專利名稱：抗脅迫基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物細胞、育種材料、植物部分和植物，其中，醛糖還原酶同源蛋白的表達水平得到提高，因此，表現(xiàn)出對脅迫條件的較高抗性。提供了植物細胞、育種材料、植物部分和植物本身，并且優(yōu)選是轉(zhuǎn)基因的。本發(fā)明還涉及核酸，例如，DNA和RNA分子，以及適用于在細胞中進行醛糖還原酶同源蛋白表達的載體，以及用于制備能超量表達醛糖還原酶同源蛋白的植物細胞的方法。
本發(fā)明特別適用于減輕由有害的生物和非生物脅迫條件在作物上造成的損害，從而改善作物的收獲前景。
在其生命周期中，植物會遇到非生物性(例如，由高光照強度造成的光抑制，UV-B照射、臭氧、重金屬、高溫和低溫、缺水、水漬和創(chuàng)傷)和生物性的(例如，病毒、細菌和真菌感染，昆蟲活動)脅迫條件。所述脅迫條件會嚴重導致植物產(chǎn)量的減少，和經(jīng)濟上的損失。因此，增強植物對脅迫的抗性并生產(chǎn)具有較高抗脅迫性的植物和育種材料是植物育種者的主要目標。
醛糖還原酶(EC．1．1．1．21)和醛還原酶(EC．1．1．1．2．)屬于醛-酮還原酶超家族。所述酶是單聚體NADPH-依賴型氧化還原酶，具有從醛糖到芳香醛的很寬的底物專一性(Bohren K．M．等1989，生物化學雜志269547-9551)。到目前為止，植物醛糖還原酶只能從單子葉植物中分離。來自大麥的醛糖還原酶同源基因的表達是在胚胎發(fā)育的后期誘導的(Bartels，D．等1991，EMBO雜志101037-1043；Roncarati，R．1995植物雜志7(5)809-822)。用雀麥植物進行的實驗證實了醛糖還原酶同源基因的表達和細胞的低溫抗性之間的聯(lián)系(Lee，S．P．1993植物生理學雜志142749-753)。針對醛糖還原酶在動物細胞中的滲透調(diào)節(jié)功能進行了一系列研究，因為這些酶能夠催化多原醇反應(yīng)途徑的第一個步驟即D-葡萄糖還原成山梨醇。眾所周知，細胞內(nèi)山梨醇含量以及其他滲透劑的調(diào)節(jié)起著保持滲透壓平衡和細胞容積的作用。Moriyama，T．等1989生物化學雜志26416815-16821；Ferraris，J．D．1996，生物化學雜志27118318-18321)。不過，有關(guān)所述酶的生物學功能有很多尚不清楚，因為醛糖和醛還原酶與很多醛的高反應(yīng)性暗示了這些酶在動物細胞中作為解毒劑的作用的可能性。
所述蛋白的解毒作用的潛在模式可能歸納如下多種病理學過程可以產(chǎn)生能導致細胞損傷的有害的自由基。所述自由基的大部分具有很短的壽命，其毒性作用僅僅集中在其所產(chǎn)生部位周圍的小范圍內(nèi)。不過，所述自由基與膜脂體的反應(yīng)會導致脂內(nèi)過氧化物和過氧化氫的形成，這些物質(zhì)隨后能發(fā)生降解作用，產(chǎn)生活性醛類化合物。所述醛比自由基更穩(wěn)定，而且，它能夠從其形成的部位遷移，將其毒性作用擴展到整個細胞。最經(jīng)常形成的并且最有毒性的脂醛是4-羥基壬烯醛醛(HNE)。由于其活性α-β不飽和雙鍵，HNE可自主性地與細胞蛋白的-SH基團和賴氨酸或組氨酸殘基形成Michael加成物。所述HNE的醛基團能夠與蛋白的α或ε氨基形成Schiff基，因此通過交聯(lián)，它可以改變其催化和結(jié)構(gòu)特性。在納摩爾濃度下HNE能夠?qū)е翫NA損傷，而在較高濃度，例如微摩爾濃度下，它具有細胞毒性作用。
由于HNE具有醛基，其解毒作用的一種可能途徑是其還原成醇，通過醛-酮還原酶超家族的成員進行催化。縱觀有關(guān)文獻，可以發(fā)現(xiàn)這種解毒作用與實驗結(jié)果一致(Van der Jagt，D．L．等1995，生物化學生物生理學公報1249117-126；Srivastava，S．等1995，生物化學生物生理學研究通訊217741-746；Spycher S．等1996，生物化學生物生理學研究通訊226512-516；Spycher S．等1977，F(xiàn)ASEB雜志11181-187)。
本發(fā)明的目的是生產(chǎn)新型的，優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因類型的植物，這種植物與起始植物(即標準作物或觀賞品系)相比，具有對非生物和生物脅迫條件的改善的抗性，并提供了生產(chǎn)這種植物的方法。
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)通過超量產(chǎn)生具有一般解毒和滲透調(diào)節(jié)作用的醛糖還原酶同源酶超家族成員，由此所產(chǎn)生的植物細胞和植物能夠同時形成對多種不同來源的脅迫條件的較大程度的抗性。具體地講，所述酶的作用與其還原各種底物的醛基的能力相關(guān)，例如，4-羥基壬烯醛(HNE)和DL-甘油醛。
為了實施本發(fā)明，業(yè)已通過重組基因操作方法分離了編碼苜蓿(Medicago sativa)醛糖還原酶同源酶(MsALRh)的cDNA。通過將該cDNA連接到一個調(diào)節(jié)片段(例如，啟動子)上確保在植物中進行異位表達(例如，通過組成型表達)，以功能性關(guān)系(例如，框內(nèi))超量產(chǎn)生醛糖還原酶同源酶業(yè)已在轉(zhuǎn)基因植物的細胞中實現(xiàn)，因此能夠通過所示醛糖還原酶同源蛋白的解毒和／或滲透調(diào)節(jié)功能減輕所述接觸不同來源的脅迫條件的植物的損害。
因此，在第一方面，本發(fā)明提供了植物、植物細胞、植物部分、育種材料和植物產(chǎn)品，以上所有均優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因的，其結(jié)果是具有較高含量的醛糖還原酶同源酶，表現(xiàn)出對多種，特別是對各種各樣的脅迫條件的損害作用的抗性。
更具體地講，本發(fā)明涉及能產(chǎn)生一種或幾種醛糖還原酶同源超家族酶的植物細胞，所述酶能夠以增強的水平還原醛基，因此，所述植物細胞具有增強了的對涉及自由基產(chǎn)生的脅迫條件的破壞作用的抗性和／或?qū)Ω珊档目剐?。特別是提供了對自由基產(chǎn)生的破壞作用的抗性。
本發(fā)明的植物細胞以及植物優(yōu)選能超量產(chǎn)生含有序列1所示氨基酸序列的醛糖還原酶同源蛋白，更優(yōu)選含有序列3所示的苜蓿序列(MsALRh蛋白)或其功能性變體或衍生物，所述變體與序列1所示醛糖還原酶同源蛋白序列的同源性優(yōu)選為至少50％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少90％，并且更優(yōu)選與序列3的苜蓿蛋白具有上述同源性。更優(yōu)選所述細胞和植物超量產(chǎn)生的所述酶所含有的序列與序列3具有至少50％的同一性，更優(yōu)選至少70％的同一性，最優(yōu)選至少90％的同一性，最優(yōu)選這些序列與序列3相同。
本發(fā)明的植物細胞優(yōu)選為轉(zhuǎn)基因的，并且是通過將能夠表達醛糖還原酶同源蛋白的核酸分子整合到其中而轉(zhuǎn)化過的。不過，本發(fā)明的植物細胞、植物部分和植物還可以通過傳統(tǒng)的非生物學突變-篩選方法產(chǎn)生，其中，例如，用一種化合物或紫外線作為誘變劑，并通過諸如下文所述的方法篩選能超量產(chǎn)生所需活性的醛糖還原酶超家族酶的植物。可以通過雜交(用Northern或Western印跡技術(shù)，參見例2)或通過檢測酶的活性確定醛糖還原酶表達的水平，特別是針對HNE和／或DL-甘油醛的活性，例如下文所述。
本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明植物細胞的植物和植物部分。本發(fā)明的植物和植物部分優(yōu)選具有針對涉及自由基產(chǎn)生的脅迫條件的增強了的抗性水平，更具體地講，例如針對用除草劑和／或重金屬和／或產(chǎn)生過氧化氫和／或用氯化鈉處理的抗性；和／或由病毒和／或細菌和／或真菌導致的感染和／或干旱。
在本發(fā)明的第二方面，提供了編碼用于本發(fā)明的醛糖還原酶同源蛋白的核酸序列，以及含有所述序列的重組核酸分子。具體地講，所述核酸是重組的、分離的、富集的和／或無細胞的，并且編碼具有上述與序列1或3的同源性的上述蛋白。所提供的核酸序列編碼的醛糖還原酶同源蛋白特別適用于本發(fā)明，和本發(fā)明的植物細胞，適用于生產(chǎn)本發(fā)明的植物和植物部分。
通過使用誘變技術(shù)，例如SDM，可將本發(fā)明的核酸設(shè)計成編碼本發(fā)明還原酶蛋白的功能性變體。還可將寡核苷酸和多核苷酸用作探針和引物，用諸如Southern或Northern印跡的方法鑒定其他天然存在的或合成的還原酶蛋白。
所述核酸優(yōu)選為DNA或RNA，特別是cDNA或cRNA，更優(yōu)選其特征是當它是一種DNA時，其多核苷酸含有的核苷酸序列與本文序列表中的序列2至少具有80％的同一性，或者在所述序列上具有密碼子核苷酸的簡并取代的序列，而當它是RNA時，它具有一種互補序列，其中，T用U取代。所述同一性優(yōu)選為90％或更高，更優(yōu)選為95％或更高，最優(yōu)選100％。所述序列的不相同的部分優(yōu)選包括簡并取代。
最優(yōu)選的DNA或RNA是能夠與序列2的核酸的一條或兩條鏈雜交的，以及具有15或更多個連續(xù)的堿基，優(yōu)選30或更多個，更優(yōu)選100或更多個連續(xù)堿基的多核苷酸和寡核苷酸片段，所述堿基選自所述序列的相應(yīng)于其他超家族酶的編碼核酸的特定片段，所述雜交是在高嚴格條件下進行的，更優(yōu)選能夠與所述多核苷酸或寡核苷酸的兩種或兩種以上雜交。進行所述雜交的序列的最合適的選擇選自序列2的編碼區(qū)，編碼相對該超家族的其他成員來說是非保守性的部分。
參見下面的


圖1可以發(fā)現(xiàn)，在所述超家族內(nèi)，41-49號氨基酸以及250-256號氨基酸傾向于保守，因此所述序列不適用于篩選雜交序列，這些雜交序列用于篩選優(yōu)選的苜蓿類型的同系物，而不是篩選一般的超家族成員。
在本發(fā)明的第三方面，提供了編碼醛糖還原酶同源蛋白超家族成員的核酸，為載體或構(gòu)建體形式，在框內(nèi)與啟動子、激活或其他能夠在植物中促進其異位表達的序列結(jié)合，所述表達是組成型的或局部的，例如，在營養(yǎng)組織或根組織中。通常該表達是非時序的，即與Rocarati等啟動子不同，因此所述植物組織一直免于自由基的破壞作用，例如產(chǎn)生HNE。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，當特定的組織需要對抗脅迫相關(guān)毒素的保護和／或滲透調(diào)節(jié)時，可以使用組織特異性調(diào)控區(qū)，如組織特異性啟動子。所述組織特異性啟動子的例子為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，但可以用WO97／20057中的啟動子作為范例(被收作本文參考文獻)，該文獻披露了根特異性啟動子，而Rocarati等的啟動子是胚胎和種子特異性的。為了保護營養(yǎng)組織，可以使用組織特異性啟動子，但也可以使用CaMv35S和苜蓿(MsH3g1)的組成型啟動子(參見被收作本文參考文獻的WO97／20058)。
在本發(fā)明的第四方面，提供了用于能超量產(chǎn)生醛糖還原酶同源蛋白的植物細胞的方法，該方法包括用本發(fā)明的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細胞。
在本發(fā)明的第五方面，提供了含有上述重組核酸、載體或構(gòu)建體的轉(zhuǎn)基因植物或其部分。第五方面的優(yōu)選植物可以在一種構(gòu)建體中含有本發(fā)明的核酸，它與啟動子、激活或其他調(diào)控序列呈功能性結(jié)合。優(yōu)選的啟動子可以是組織特異性的，以便所產(chǎn)生的蛋白表達及其作用被局限在需要的組織。具有一定程度的組織特異性的啟動子對于植物分子生物學領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是公知的。
可用于產(chǎn)生本發(fā)明的載體和構(gòu)建體的方法可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的常規(guī)分子生物學技術(shù)?？梢杂弥参锛毎D(zhuǎn)化領(lǐng)域所公知的方法將含有或編碼所述蛋白的DNA、RNA和載體導入靶細胞。特別優(yōu)選用諸如電穿孔或基因槍技術(shù)將所述DNA或RNA導入細胞的方法，更優(yōu)選導入花粉細胞。
優(yōu)選在整個植株中表達所述DNA或RNA，但在需要利用組織特異性效果的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解的是，應(yīng)當將組織特異性啟動子、增強子或其他激活物整合到轉(zhuǎn)基因細胞中，以與所述DNA的可操作的關(guān)系使用。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員了解通過插入與合適的調(diào)控序列結(jié)合的cDNA生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物和植物細胞的方法的多種具體例子。植物轉(zhuǎn)化載體由Denecke等(1992)EMBO雜志11，2345-2355披露，在美國專利申請流水號08／290301中進一步披露了將其用于生產(chǎn)能產(chǎn)生海藻糖轉(zhuǎn)基因植物的用途。EP0339009B1和US5250515披露了將異源基因插入植物中的方法(參見US5250515的第8-26欄)。在US56529183，US7530485和US7350356中披露了對花粉進行電穿孔，并產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因單子葉植物和雙子葉植物。進一步的細節(jié)可以閱讀參考書，如重組基因表達方法(1997)Rocky S．Tuan．著，Humana出版社，ISBAO-89603-333-3N；0-89603-480-1(所有文獻均被收作本文參考文獻)。可以理解的是，對打算提供的轉(zhuǎn)基因植物細胞或植物的類型沒有特別的限制；所有類型的植物、單子葉或雙子葉植物都可以結(jié)合了本發(fā)明的核酸的轉(zhuǎn)基因形式產(chǎn)生，以便組成性地或異位地改變?nèi)?，特別是HNE在植物中的還原活性。
本發(fā)明的另一方面提供了苜蓿同源蛋白及其抗體。
下面所定義的術(shù)語所給的定義將使用在整個說明書和權(quán)利要求書中，即使所下的定義與所述術(shù)語在本領(lǐng)域中通常所使用的意義有所差別。
“醛糖還原酶同源蛋白”在本說明書中被定義為是醛-酮還原酶超家族的成員的酶，并類似于該家族的其他成員，所述酶在有NADPH輔助因子的條件下能夠還原多種底物中的醛基。本文所用的術(shù)語“醛糖還原酶同源蛋白”還包括所述蛋白的功能性變體和衍生物。
一種蛋白的“功能性變體”或“功能性衍生物”是這樣一種蛋白，其氨基酸序列可能是通過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失和／或添加而從原始蛋白衍生的氨基酸序列，盡管其氨基酸序列發(fā)生了改變，所述功能性變體保留了所述原始蛋白的至少一種生物學活性的至少一部分，該活性是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以檢測到的。一種功能性變體與產(chǎn)生這種變體的蛋白通常具有至少50％的同源性(其氨基酸序列優(yōu)選至少50％相同)，優(yōu)選至少70％的同源性，更優(yōu)選至少90％的同源性。功能性變體還可以是一種蛋白的任何功能性部分；本發(fā)明中的功能具體為醛還原作用，但不排除其他作用。
所述氨基酸序列與序列1或序列3的不同優(yōu)選主要或僅在于保守性取代。更優(yōu)選所述蛋白含有與序列1或序列3具有90％或更高，更優(yōu)選95％的序列同一性的氨基酸序列，并最好與所述序列100％相同。
適用于排列序列以便比較并計算序列同源性或同一性的算法和軟件為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。所述工具的突出的例子是Pearson和Lipman檢索基FAST和BLAST程序。上述技術(shù)的有關(guān)詳情可以參見Altschul等(1990)，分子生物學雜志215403-10；Lipman D J和EARSON W R(1985)科學227，1435-41卷。公開的BLAST細節(jié)可以從互聯(lián)網(wǎng)上查到，網(wǎng)址是‘http／／www．ncbi．nlm．nih．gov／BLAST／blast-help．html’，所述同源性和同一性百分比可以用采用了諸如FASTA和BLASTn軟件的商業(yè)或公開的軟件包確定，或者通過在互聯(lián)網(wǎng)上提供服務(wù)的計算機進行。前者的一個例子是GCG威斯康星軟件包，而Genbank(參見http／／www．a(chǎn)abi．nlm．nih．gov／BLAST)和EMBL(參見http／／www．embl-heidelberg．de／Blast2)都提供了互聯(lián)網(wǎng)服務(wù)。
術(shù)語同一性是指要在參考序列中檢索的氨基酸序列或堿基序列在相同的相對位置上在對所述序列進行最佳排列時的用數(shù)字表示的百分比，雖然實際情況是所述序列可能在某些位置上具有缺失或添加，需要引入缺口，以便獲得所述氨基酸或堿基的最大百分比的排列。所述序列優(yōu)選通過使用10個或更少的缺口排列，即導入兩個序列中的缺口總數(shù)加起來為10或更少。缺口的長度不是特別重要，只要能保留醛還原活性即可，通常不超過10個，優(yōu)選不超過5個氨基酸，或者30個堿基，優(yōu)選不超過15個堿基。
BLAST檢索的優(yōu)選參數(shù)是預(yù)設(shè)值，即，對于EMBL高級Blast2來說為Blastp Matrix BLOSUMS，F(xiàn)ilter預(yù)設(shè)值，Echofilter X，Expect10，截斷預(yù)設(shè)，雙鏈，說明50，排列50。對BLASTn也優(yōu)選預(yù)設(shè)值。GCG威斯康星包預(yù)設(shè)值是Gap Weight12，長度重量4。用于同源性計算的其他優(yōu)選方法的FASTDB參數(shù)是錯配罰分=1．00，缺口罰分=1．00，缺口大小罰分=0．33，以及連接罰分=30．0。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解高‘嚴格條件’的含義，不過，通常如在US5202257中第9-10欄中所下定義，該專利被收作本文參考文獻。
術(shù)語‘簡并取代’是指能產(chǎn)生編碼相同的氨基酸的核苷酸取代；當表達所述蛋白的細胞或載體是不同于DNA來源生物細胞的類型時，所述簡并取代是有利的，它具有不同于所述cDNA來源細胞的轉(zhuǎn)錄／翻譯密碼子偏好。因此，所述簡并取代是宿主特異性的。
與氨基酸一起使用的術(shù)語‘保守取代’是指用具有同一類物理化學特性的氨基酸取代特定的氨基酸。因此，當序列1或序列3上的氨基酸具有疏水性特征的基團時，對它的保守取代是由另一個同樣具有疏水性特征基團的另一種氨基酸進行的；其他這種類別是這樣的，所述特征性基團是親水性的、陽離子型的、陰離子型的或包含硫醇或硫醚。所述取代對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是眾所周知的，即參見被收作本文參考文獻的US5380712，只希望所得到的蛋白具有醛還原酶的活性，特別是對HNE的活性，例如，在有NADPH的條件下具有該活性。
如果一種蛋白在細胞中的濃度至少比在原始細胞中的濃度高20％的話，該蛋白或RNA就被認為是“高水平生產(chǎn)的”或“超量生產(chǎn)的”，所述原始細胞是現(xiàn)在被轉(zhuǎn)化了的原始植物品系的細胞。類似地，如果一種植物能夠承受增強20％的相同有害條件的作用而沒有可檢測的損傷，就將該植物、植物組織或植物細胞定義為與原始植物、植物組織或植物細胞相比具有對有害條件的“增強的抗性水平”。一種分子在細胞中的超量表達可以通過傳統(tǒng)突變和選擇技術(shù)以及遺傳操作方法實現(xiàn)。
本文所使用的術(shù)語“異位表達”是指超量表達的一種特殊體現(xiàn)，例如，其含義是一種異位表達的蛋白是在植物的一個空間點上產(chǎn)生的，在這里這種蛋白根本就不能自然表達(或不可檢測)，就是說所述蛋白在所述點上是超量表達的。異位表達的特殊類型包括，例如，醛-酮還原酶蛋白在植物的營養(yǎng)組織或根中的表達，而在正常情況下這種蛋白只發(fā)現(xiàn)能在胚胎和／或花粉中通過轉(zhuǎn)錄物進行瞬時表達(參見Roncarati等)。
下面將結(jié)合以下的非限定性實施例、附圖和序列表對本發(fā)明進行示意性說明。落入本發(fā)明范圍的其他實施例對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。
序列表本文所附的序列表的序列如下序列1優(yōu)選的醛糖還原酶同源酶的氨基酸序列，該序列與本發(fā)明所涉及的酶具有同源性。
序列2含有編碼用于本發(fā)明的苜蓿醛糖還原酶同源酶的cDNA的DNA。
序列3用于本發(fā)明的苜蓿醛糖還原酶同源酶的氨基酸序列。
序列4和5是與例3有關(guān)的引物。
附圖
圖1是苜蓿MsALRh蛋白與人、動物和植物醛糖和醛還原酶蛋白的氨基酸序列比較。
圖2表示從苜蓿中分離的基因組DNA的Southern雜交結(jié)果。用在附圖中每一個泳道下面所標明的限制性酶消化20微克基因組DNA。在1％的瓊脂糖凝膠上分離所述限制性片段，并吸印到Hybond-N膜上，將P-32標記的MsALRh cDNA的編碼片段用作雜交探針。
圖3表示用MsALRh cDNA進行的Northern雜交實驗結(jié)果。從用150微摩爾ABA(脫落酸)激素(3a)、10％聚乙二醇(PEG4000，3b)和氯化鎘(3c)處理的苜蓿A2細胞懸浮液中分離總RNA，在1％甲醛瓊脂糖凝膠上對20微克總RNA進行電泳，并轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上，然后用P-32標記的MsALRh cDNA的片段的編碼區(qū)進行檢測。在每一種情況下的C都是未處理的對照。
圖4表示MsALRh基因表達的Western雜交分析。4a表示用較長(上)和較短表達時間在不同苜蓿組織中蛋白的含量。4b表示在用10％PEG，25微摩爾氯化鎘和1毫摩爾過氧化氫處理期間蛋白含量的變化。
圖5是用于表達編碼所述酶的cDNA的pGEX起點(pGEX-5X-3)的載體的圖譜。所述載體在大腸桿菌細胞中以谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白形式表達所述酶。
圖6表示在谷胱苷肽-Sepharose上純化MsALRh-GST融合蛋白。
圖7表示硫酸銨處理對MsALRh-GST重組融合蛋白的活性的影響。通過測定在340nm波長下NADPH氧化作用的指標，通過分光光度法測定對10mM DL-甘油醛底物的酶促活性。標準反應(yīng)混合物含有5微克酶和0．15mM NADPH。在開始所述活性測定之前，將所述酶與硫酸銨預(yù)培養(yǎng)3分鐘。
圖8表示從轉(zhuǎn)基因煙草植物葉片中分離的細胞提取物中醛糖還原酶同源蛋白的Western雜交檢測。
圖9a和9b表示在用20微摩爾百草枯(9a)和250微摩爾氯化鎘(9b)處理期間對照和轉(zhuǎn)基因植物葉片的光誘導熒光測定結(jié)果。
圖10a、10b、10c和10d表示在對照 條件(10a)，在有15mM過氧化氫(10b)，150微摩爾氯化鎘(10c)和250mM綠化鈉(10d)的條件下對照(SR1)和轉(zhuǎn)基因(TR1／1，1／5，1／9)植物的發(fā)芽試驗結(jié)果。
圖11表示對照(SR1)和轉(zhuǎn)基因(TR1／4，1／7和1／9)植物在缺水生長期間光誘導熒光測定的結(jié)果。
圖12a表示經(jīng)過35天的嚴重干旱處理之后恢復(fù)供水10天之后對照和轉(zhuǎn)基因植物的照片。12b表示在經(jīng)過上述干旱抗性試驗之后從12a中所示的對照和轉(zhuǎn)基因植物的葉片中制備的細胞提取物中醛糖還原酶同源蛋白的檢測。
圖13表示在UV-B照射之前(第1天)，期間(第2-4天)和之后(第8和第15天)在煙草葉片中葉綠素熒光的Gentry參數(shù)形式的光合效率測定。實心圓圈表示1／1，1／5，1／8，1／9和1／10植物的平均數(shù)據(jù)。空心圓圈表示1／4，1／7植物和對照SR1的數(shù)據(jù)。
實驗在下面的實驗實施例中，本發(fā)明人證實了cDNA形式的編碼苜蓿醛糖還原酶同源蛋白的基因的分離。其核苷酸序列和推測的氨基酸序列證實所分離的cDNA編碼一種迄今尚未鑒定過的新型植物醛糖還原酶同源蛋白。將所分離的醛糖還原酶cDNA克隆到植物表達載體上，并通過常用的基因?qū)敕椒ㄉa(chǎn)轉(zhuǎn)化的煙草植物。除了對所述轉(zhuǎn)基因煙草植物進行分子生物學鑒定之外，還證實了其對不同脅迫條件的增強了的抗性。例1從一種基因文庫中分離苜蓿醛糖還原酶同源cDNA(MsALRh)，并預(yù)測其所編碼的氨基酸序列。
為了制備苜蓿cDNA文庫并鑒定醛糖還原酶同源cDNA，采用廣泛使用的分子生物學方法，如Sambrook，J．等的方法(Sambrook，J．等，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，N，Y_1989，被收作本文參考文獻)。所述方法的細節(jié)可以歸納如下按如下方法產(chǎn)生苜蓿cDNA文庫。
從體外培養(yǎng)的生長素刺激激活的苜蓿組織中分離總細胞RNA，所述組織包括去分化愈傷組織和大量的體細胞胚胎。脅迫激活(生長素刺激)是用2，4-二氯-苯氧乙酸(一種生長素類似物)進行的，采用本身已知的方法，以提高脅迫誘導mRNA的濃度。mRNA分離方法詳細披露于被收作本文參考文獻的Cathala等的文章中(1983 DNA2329-335)。
按照被收作本文參考文獻的Aviv，H．和Leder，P．的方法(1972Pro．Natl．Acad．Sci．USA691408-1421)，通過寡聚脫氧胸苷纖維素層析方法從總RNA中分離mRNA分子。
然后用分離的poly-A+(mRNA)組分合成第一條cDNA鏈，使用寡聚脫氧胸苷引物并使用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶。第二條DNA鏈的合成是用DNA聚合酶Ⅰ進行的，通過RNaseH處理除去多余的模板mRNA。用末端轉(zhuǎn)移酶在合成的cDNA的末端合成poly-dC尾，并在PstⅠ消化過的pGEM2載體(Promega)末端合成poly-pG尾。在退火并用T4DNA連接酶連接之后，將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)入MC1061大腸桿菌菌株中，并將轉(zhuǎn)化混合物鋪平板到含有100mg／l氨卞青霉素選擇LB-平板上。用25微克DNA，獲得了2．5×105原代轉(zhuǎn)化體菌落。證實大約96％的克隆含有可檢測大小的插入片段。cDNA文庫的制備方法是遵循本領(lǐng)域普遍使用的方法，并且特別基于被收作本文參考文獻的De Loose等的方法(1988基因7013-23)。
測定了該cDNA文庫的大約100個獨立克隆的核苷酸序列(即從脅迫誘導的mRNA分離物制備的cDNA克隆)。在測序之前，將插入片段亞克隆到質(zhì)粒pUC19上，并且測序反應(yīng)是在雙鏈DNA上用雙脫氧鏈終止方法進行的，用α-35-S-dATP標記。為了進行測序反應(yīng)，按照生產(chǎn)商推薦的方法使用T7測序試劑盒(Pharmacia)和測序酶2．0試劑盒(美國生化)。
使用測定的cDNA序列在基因GeneBank和EMBL核苷酸序列數(shù)據(jù)庫中進行同源性檢索。結(jié)果表明，源于隨后被命名為MsALRh的氨基酸序列與人、大鼠和植物醛-酮還原酶蛋白都具有同源性。MsALRhcDNA的長度是1231個堿基對，其編碼區(qū)可能位于34和975號核苷酸之間(序列2)。該片段編碼313個氨基酸的蛋白。苜蓿醛糖還原酶同源蛋白的氨基酸序列與已知的鑒定最清楚的單子葉大麥醛糖還原酶同源蛋白具有44．3％的同一性，并且與人醛還原酶和豬醛糖還原酶分別具有46．2％和46．1％的同一性(
圖1)。它還表現(xiàn)出與雙子葉大豆NADPH依賴型氧化還原酶具有42％的氨基酸同一性。所觀察到的氨基酸同源水平讓我們得出這樣的結(jié)論，所克隆的苜蓿cDNA編碼醛-酮還原酶超家族的一種新型酶。例2苜蓿醛糖還原酶同源基因的分子生物學鑒定根據(jù)本發(fā)明進行的苜蓿醛糖還原酶同源基因的徹底的分子生物學鑒定表明，其行為不同于已知的植物醛糖還原酶同系物，用Southern雜交分析該基因在苜?；蚪M中的拷貝數(shù)；通過Northern雜交在mRNA水平上并通過Western雜交在蛋白水平上分析該基因的表達。
從苜蓿細胞中分離基因組DNA，并用限制性內(nèi)切酶消化純化的DNA。將攜帶完整長度編碼序列的MsALRh cDNA片段用作探針，在用“隨機引物”方法進行放射性同位素標記之后進行Southern雜交實驗(Freinberg，A．P．和Vogelstein，B．1983分析生物化學137266-267)。雜交是在65℃下在快速雜交緩沖液(Amersham)中進行的。雜交結(jié)果(圖2)表明，所述醛糖還原酶同系物基因具有低的拷貝數(shù)，但在放射自顯影圖上所有的限制消化物都具有微弱的額外的帶有可能表明，在苜蓿基因組中存在其他基因同系物。
用公知方法通過Northern雜交分析所述基因的表達[Sambrook，J．等，“分子克隆，實驗室手冊”(第二版，冷泉港N．Y．1989)，被收作本文參考文獻]。詳細過程如下按照被收作本文參考文獻的Maes的方法，(1992核酸研究204374)從苜蓿A2細胞懸浮液中純化總RNA。在甲醛瓊脂糖凝膠上分離之后，將所述RNA轉(zhuǎn)移到Hybond-N膜上(Amersham)。用“隨機引物”方法對MsALRh基因的完整編碼區(qū)進行放射性標記(Freinberg，A．P．和Vogelstein，B．1983分析生物化學137266-267，被收作本文參考文獻)，并且雜交是在65℃下在快速雜交緩沖液(Amersham)中進行的。組織特異性實驗證實，與大麥醛糖還原酶同系物不同，苜蓿醛糖還原酶同系物基因是在每一種組織中表達的，而前者只能瞬時表達，并且只能在胚胎中表達。用不同的激素和脅迫處理處理所述苜蓿細胞懸浮液，結(jié)果表明所研究的基因是均勻誘導的。用植物脅迫激素脫落酸(ABA)處理在開始處理之后4小時能明顯提高RNA含量(圖3)。這一發(fā)現(xiàn)的重要性在于激素ABA在若干基因的調(diào)控中是一種關(guān)鍵化合物，它在對諸如干旱和低溫的環(huán)境脅迫的適應(yīng)中起著重要作用。
用聚乙二醇處理會在植物細胞中產(chǎn)生滲透脅迫。MsALRh基因的表達可以通過滲透脅迫誘導，也可以通過氯化鎘處理誘導(重金屬脅迫；圖3)。已知鎘離子除了其光合抑制特性之外還能誘導氧化脅迫，這種情況下，植物細胞中的脂過氧化物含量提高。正如在前言部分所披露的，脂過氧化物的分解產(chǎn)物是能夠在解毒反應(yīng)用作醛-酮還原酶底物的脂醛。例3苜蓿醛糖還原酶同源蛋白的生化鑒定為了鑒定所述酶的底物專一性，在原核蛋白表達系統(tǒng)中生產(chǎn)一種重組蛋白，并進行純化。
將MsALRh基因的cDNA克隆到pGEX 4T-1原核表達載體(Pharmacia)上，并在大腸桿菌中生產(chǎn)含有GST(谷胱苷肽-S-轉(zhuǎn)移酶)的融合蛋白，并進行純化。用純化的融合蛋白做抗原，通過常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)兔多克隆抗體。通過Western雜交用所述抗體分析不同脅迫處理對MsALRh蛋白產(chǎn)生的影響，并檢測在苜蓿植物的不同組織中的蛋白(圖4)。
按照被收作本文參考文獻的Mullis和Faloona的方法(1987，酶學方法155335)對MsALRh cDNA的編碼區(qū)(975bp)進行PCR擴增，使用“引物1”(5’-cgaactcgagatggccacagcaatcaagttt-3’)作為上游引物并將“引物2”(5’-ccgagctctacttcaccatcccagag-3’)作為下游引物(在所述引物中的XhoⅠ限制位點下面劃線)。用XhoⅠ限制性內(nèi)切酶消化所述PCR產(chǎn)物，并將消化的片段克隆到pGEX4T-1載體(Pharmacia)的XhoⅠ位點上。為了避免PCR產(chǎn)生的錯誤，確定克隆產(chǎn)物的核苷酸序列。
為了誘導含有N-末端GST的融合蛋白(MsALRh-GST蛋白，隨后)產(chǎn)生，用0．5mM異丙基-β-D-半乳糖吡喃糖苷(IPTG)在25℃下處理轉(zhuǎn)化過的大腸桿菌細胞3小時。按照被收作本文參考文獻的Smith和Johnson(1988基因6731-40)的方法鑒定能表達所述融合蛋白的轉(zhuǎn)化體。按照生產(chǎn)商推薦的方法(Pharmacia)在谷胱苷肽-Sepharose 4B柱上純化MsALRh-GST融合蛋白。
將所產(chǎn)生的并純化過的MsALRh-GST融合蛋白(100-150微克，0．5毫升)與等體積的完全弗氏佐劑(Sigma)充分混合，并用該乳液對兔子進行免疫。分別在3周和6周之后用所述抗原和不完全弗氏佐劑的乳液進行再進行兩次免疫。在Western分析中檢測其血清。在競爭實驗中測定所述血清對MsALRh蛋白的專一性。
為了進行Western印跡分析，在12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上分離苜蓿細胞懸浮液提取物。在分離之后，將所述蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。將所制備的抗所述融合蛋白的血清用作第一抗體(以1∶2000的比例稀釋)；將與過氧化物酶綴合的抗-兔-IgG抗體用作該實驗的第二抗體。用Super SignalRTMCL-HRP底物系統(tǒng)(Pierce)檢測抗原抗體復(fù)合體，這是一種高靈敏度的化學發(fā)光檢測方法。
檢測MsALRh蛋白在苜蓿植物的不同類型組織中的存在。結(jié)果清楚地表明(圖4a)，所述蛋白存在于檢測過的每一種植物器官中。這一結(jié)果與由Bartels，D．等所披露的結(jié)果完全相反(1991 EMBO雜志101037-1043)，因為在營養(yǎng)組織中不存在可檢測量的大麥醛糖還原酶同源蛋白。我們的結(jié)果證實了苜蓿醛糖還原酶同源蛋白與以前分離的植物醛糖還原酶的差別，并有可能表明其具有不同的生理學作用。
還通過Western雜交技術(shù)檢測在由PEG處理誘導的滲透脅迫期間或者在由氯化鎘處理誘導的重金屬脅迫期間所導致的MsALRh蛋白量的增加以及由于過氧化氫處理所導致的有毒的自由基產(chǎn)生。所述結(jié)果表明在滲透和重金屬脅迫期間MsALRh蛋白含量的增加與觀察到的該基因的mRNA含量增加相關(guān)聯(lián)，并表明氧化脅迫誘導過氧化氫處理也能增加苜蓿細胞中MsALRh蛋白的含量。以上結(jié)果有力地支持了MsALRh蛋白在植物針對活性自由基的毒性作用的防御反應(yīng)中起作用。
MsALRh酶的底物專一性試驗-除了氨基酸同源性之外-證實了MsALRh基因編碼一種屬于醛酮還原酶超家族的酶，與此同時，它還具有若干不同于迄今所鑒定的植物醛糖還原酶同系物的特征。通過光學方法測定MsALRh-GST融合蛋白對不同底物的酶促活性在340nm波長下，在25℃下，在5分鐘反應(yīng)時間內(nèi)測定NADPH輔因子濃度的降低。1毫升的反應(yīng)混合物含有50mM磷酸鈉緩沖液(pH=7．0)，0．1mM NADPH輔因子和不同濃度的底物。一個酶單位被表示為在有所述底物的條件下在1分鐘內(nèi)氧化1微摩爾NADPH所必需的酶的量(以毫克計)。在所述專一性測定中將醛糖DL-甘油醛和4-羥基壬烯醛(ICN生物化學)用作底物，其結(jié)果(為Km動力學常數(shù))在下面的表1-3中表示。根據(jù)我們的結(jié)果，純化的酶能夠在有NADPH輔因子的條件下還原醛底物。只能在DL-甘油醛(已知為植物醛糖還原酶同系物的最佳底物)和4-羥基-壬烯醛上檢測到最高的酶促活性。MsALRh酶能夠以較低的活性還原D-木糖，而對其他醛糖底物(如D-葡萄糖，D-半乳糖，D-甘露糖，或D-核糖)無活性，即使在很高的(400mM)底物濃度下也沒有活性。根據(jù)以上結(jié)果(參見下面的表1)，苜蓿酶表現(xiàn)出與動物醛還原酶極為相似的對甘油醛底物的活性。同時，它在有4-羥基-壬烯醛的條件下具有較低的活性(表2)。
表1植物醛糖還原酶同系物和哺乳動物醛還原酶在DL-甘油醛底物上的Km動力學參數(shù)比較
表2醛糖還原酶在4-羥基-壬烯醛底物上的Km動力學參數(shù)
表3用0．3M硫酸銨處理對醛糖和醛還原酶活性的改變
我們檢查了MsALRh酶是否能還原4-羥基-壬烯醛(HNE)的醛基，這種化合物在前面提到過是脂過氧化物的降解產(chǎn)物之一，因此消除了其前面披露的毒性作用。我們的結(jié)果表明，HNE是MsALRh的底物，它比DL-甘油醛更好，后者以前被認為是植物醛糖還原酶的最佳底物。HNE的Km動力學常數(shù)值大約為700微摩爾，這一數(shù)字是在甘油醛上測得的數(shù)字的大約1／3。所述測定最初是用ALRh-GST融合蛋白進行的，不過在隨后的實驗中用去掉了GST-尾的蛋白重復(fù)了測定，所述尾是通過凝血酶裂解位于MsALRh和GST部分之間的凝血酶識別位點而去掉的。DL-甘油醛和4-羥基-壬烯醛的Km值在兩種情況下都相同，因此我們可以得出結(jié)論，GST融合配偶體不能改變MsALRh酶的底物專一性。
已知SO42-能以不同方式改變大鼠醛糖和醛還原酶酶促活性。在我們的實驗中，在存在0．3M硫酸銨的條件下所述酶促活性增強2倍，是所述醛糖還原酶的一個特征(圖7)。MsALRh酶的一個重要特征是即使在存在低濃度(45mM)硫酸銨的條件下其活性也能增加100％。這一結(jié)果可能表明，通過硫酸銨處理可以增強所述酶在轉(zhuǎn)基因植物中的有利作用。根據(jù)以上結(jié)果我們可以得出這樣的結(jié)論，MsALRh酶以及大麥醛糖還原酶同源酶也具有類似于動物醛糖和醛還原酶的特征，但它也具有特殊的不同特征。例4將苜蓿醛糖還原酶同源(MsALRh)cDNA插入煙草植物，在轉(zhuǎn)基因植物的營養(yǎng)器官中產(chǎn)生醛糖還原酶蛋白可以用基于農(nóng)桿菌屬的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)將外源基因?qū)胫参锘蚪M(詳情參見Hiche，E．等“植物細胞和組織培養(yǎng)”1994，231-270頁，Vasil，I．K．和Thorpe，T．A．著，Kluwer學術(shù)出版社出版，被收作本文參考文獻)。將研究的cDNA融合到由Benfey等1989 EMBO雜志82195-2202披露的病毒CaMV35S啟動子上，該文獻被收作本文參考文獻。
將所產(chǎn)生的二元載體構(gòu)建體轉(zhuǎn)移到農(nóng)桿菌菌株中，通過摩擦感染煙草葉片，按照被收作本文參考文獻的Claes等披露的方法(1991植物雜志115-26)進行共培養(yǎng)并再生卡那霉素抗性植物。將轉(zhuǎn)化植物和通過自交獲得的種子用于發(fā)芽實驗。
通過免疫學方法證實苜蓿醛糖還原酶基因在轉(zhuǎn)基因煙草植物中的功能。
用抗MsALRh-GST融合蛋白的多克隆抗體通過Western印跡分析證實所述醛糖還原酶基因在轉(zhuǎn)基因煙草植物中的表達。分析所述煙草品系(圖8)。按照以前詳細披露的Western雜交方法檢測從所述品系的葉片中獲得的蛋白提取物，所不同的是蛋白樣品是在10％SDS-聚丙烯酰胺變性凝膠上分離的，并將堿性磷酸酶綴合的抗-IgG抗體用作第二抗體。通過BCIP(5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸)和NBT(2，2’-二對硝基苯-3，3’-[3，3’-二甲氧-4，4’聯(lián)苯]-雙四唑-氯)底物檢測所述抗體蛋白復(fù)合物。在10個檢查過的轉(zhuǎn)基因品系中有5個可以檢測到大量MsALRh蛋白的合成，其他轉(zhuǎn)基因品系未表現(xiàn)出MsALRh基因的表達，并且在對照野生型(SR1)植物中也沒有檢測到信號。例5能表達苜蓿醛糖還原酶同源蛋白的轉(zhuǎn)化煙草植物表現(xiàn)出對諸如除草劑、重金屬、過氧化氫和氯化鈉的不同脅迫處理的較高水平的抗性為了證實本發(fā)明的理論，在有除草劑百草枯(PQ)和鎘(Cd)的條件下檢驗了所述轉(zhuǎn)化體的表現(xiàn)。從對照SR1和轉(zhuǎn)化植物的葉片上切除葉片，并在培養(yǎng)皿中用百草枯(20微摩爾)和氯化鎘(250微摩爾)溶液處理，用Vass．I．等的方法(生物化學1996，358964-8973)用PAM熒光計通過光誘導的熒光測定監(jiān)測對光合器官的功能性損傷。對于對照SR1植物來說在處理之后24小時熒光強度的減弱相當明顯，并且在48小時之后這一作用更加明顯。相反，對于所述轉(zhuǎn)基因品系來說，熒光強度的減弱較少，因此表現(xiàn)出光合功能損失的明顯的減弱(圖9)。
另外，用發(fā)芽實驗檢查所述轉(zhuǎn)化體對脅迫的抗性。在自交之后，將來自轉(zhuǎn)化體的種子放在分別含有15mM過氧化氫、150微摩爾氯化鎘和250mM氯化鈉的培養(yǎng)基上生長，在光照下，在受控制的條件下讓所述種子發(fā)芽。如
圖10所示，每一個轉(zhuǎn)化品系都比對照SR1煙草植物具有對所施加的脅迫處理更高的抗性。表達的MsALRh蛋白的保護作用清楚地表現(xiàn)出取決于濃度，因為發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因品系1／5對所述處理的抗性最高，而該品系能以最高的水平表達所述轉(zhuǎn)基因。例6產(chǎn)生苜蓿醛糖還原酶同源蛋白的轉(zhuǎn)基因煙草品系表現(xiàn)出對缺水的抗性讓轉(zhuǎn)化的煙草植物在受控制的溫室條件下在土壤中生長5周，并在實驗開始時測定土壤的含水量。在實驗期間通過上述實施例中詳細披露的光誘導熒光測定監(jiān)測對光合系統(tǒng)的損傷。在開始該實驗之前，我們從轉(zhuǎn)基因煙草品系和SR1對照植物中選擇具有類似的發(fā)育階段的植物，并選擇每一個植株上的具有相同日齡的葉片進行熒光測定，這些測定是在實驗期間的特定時間點上進行的。
在開始該實驗之后，我們停止了對實驗植物澆水。在缺水生長的第32天到35天，F(xiàn)v／Fm熒光值顯示SR1植物和品系1／4和1／7(
圖11)植物生活力的明顯下降，而品系1／1，1／5和1／9的植物生活力減弱不明顯。在該實驗的第45天檢測的植物如
圖12所示。在干旱期之后，測定土壤的濕度。此時恢復(fù)給植物澆水10天，并再次測定預(yù)先確定的葉片的光誘導熒光值。在品系1／1，1／5和1／9上，所述值與45天時的值大致相同或略好一些，不過在SR1對照和非表達的1／4和1／7品系上，F(xiàn)v／Fm值繼續(xù)下降。在恢復(fù)澆水之后，從葉片中分離蛋白提取物，并測定MsALRh蛋白含量(
圖13)。結(jié)果表明，在SR1，1／4和1／7植物中，所述蛋白是檢測不到的，而在1／1，1／5和1／9品系中，存在MsALRh蛋白。因此，我們的結(jié)論是只有能耐干旱的植物才表達所述MsALRh蛋白。
為了證實所述增強的抗旱能力不是由于葉片的儲水能力不同所致，用單一葉片重復(fù)所述缺水實驗。結(jié)果表明，在MsALRh蛋白生產(chǎn)植物和對照植物上失水的速度大致相同。例7UV-B照射保護在26℃下將煙草植物保持在通風的生長箱中進行5天實驗。在每天的上午8點和下午6點之間由熒光燈管(40W鎢燈)以60-80μmolm-2s-2的強度從上面和側(cè)面提供光合激活照射。在每天的上午9點到下午3點由UV-B313燈管(Q-panel，美國)以7．5μmol m-2s-2總的UV-B光強從上面進行UV-B(280-320nm)照射，從開始實驗的第2天起共照射4天。為了排除可能的UV-C(λ＜280nm)照射的作用，將一層乙酸纖維素濾膜(Courtauld Chemicals UK)放置在植物和UV-B源間。在恢復(fù)期間，將植物于正常生長條件下保持在溫室中。
為了進行葉綠素熒光測定，將植物轉(zhuǎn)移到實驗室中。在黑暗中進行測定，在大約45分鐘內(nèi)結(jié)束，包括最初的15分鐘暗適應(yīng)時間。在此之后，將植物轉(zhuǎn)移回到生長箱或(在恢復(fù)期內(nèi))回到溫室中。所有的葉綠素熒光測定都是在下午3點到5點進行的。
在實驗第1天的下午測定未處理的植物，并在實驗的第2天之后開始UV-B照射。在實驗的第2-第5天和終止照射后30分鐘測定UV-B照射的植物。
用一臺PAM葉綠素熒光計(WALZ公司，德國)用弱的(＜1μmolm-2s-2)調(diào)節(jié)紅色光線測定葉綠素熒光。分別在用0．5秒的飽和白色光線脈沖(2500μmol m-2s-2)照射之前和照射時在11．5μmol m-2s-2光化紅色光線中測定穩(wěn)態(tài)(Fs)和最大(Fm’)熒光產(chǎn)量。用Gentry-參數(shù)衡量光合電子轉(zhuǎn)移效率，表示為(Fm’-Fs)／Fm’。對每一個植物的兩個葉片進行檢測，并且在每一個葉片的近軸側(cè)在中脈的兩側(cè)對稱地進行兩次葉綠素熒光測定。
結(jié)果從實驗的第3天開始，在UV-B照射2天之后，植物葉片表現(xiàn)出可見的UV-B損傷癥狀，即具有損傷色素沉積的斑點。在進一步的照射之后上述斑點變得更明顯，并且即使在恢復(fù)期也依然存在于葉片上。葉綠素熒光表明從UV-B照射第1天起光合效率降低(Gentry-參數(shù))。對于植物1／1，1／5，1／8，1／9和1／10來說，在溫室中經(jīng)過1周的恢復(fù)之后，其光合效率恢復(fù)到原始效率的大約90％。而在對照SR1，1／4和1／7植物中沒有明顯的恢復(fù)。
在UV-B照射之前(第1天)、期間(第2-4天)、和之后(第8天和第15天)，以煙草葉片中葉綠素熒光的Gentry-參數(shù)形式測定光合效率。在
圖13中，實心圓表示用植物1／1，1／5，1／8，1／9和1／10獲得的平均數(shù)據(jù)?？招膱A表示在植物1／4，1／7和SR1上測定的平均數(shù)據(jù)。
綜合上文詳細說明的實驗的結(jié)果并考慮所述酶的生物化學特征，我們可以得出如下結(jié)論(1)分離的苜蓿醛糖還原酶同源基因編碼一種具有新型特征的酶，它能與有毒的脂醛4-羥基-壬烯醛起反應(yīng)。
(2)生產(chǎn)能表達所述苜蓿醛糖還原酶同源基因的轉(zhuǎn)基因植物，以便利用所述酶的上述特征及其他特征，并且所生產(chǎn)的植物被證實能抗多種有害的脅迫處理。
(3)上述實施例證實了本發(fā)明構(gòu)思的實用性，這一構(gòu)思還得到了理論方面的支持，即能超量產(chǎn)生苜蓿醛糖還原酶同源酶的植物具有對不同來源的多種脅迫條件的較強的抗性。
由于本發(fā)明基本上新型的方法不包括任何種專一性必要特征，技術(shù)人員可以合理地推斷，能超量表達任何來源醛糖還原酶同源蛋白的任何種的植物細胞都具有對多種不同脅迫條件的增強的抗性。根據(jù)上文證實的結(jié)果，考慮到醛糖還原酶同源蛋白的一般保護作用極有可能是基于所披露的基本細胞生物學過程，人們還可以合理地推斷，本發(fā)明的方法還可用于產(chǎn)生對其他脅迫條件的抗性，例如對高溫或低溫，UV-B照射，和植物病原體活動的抗性。
序列表<110>Oberschall，AttilaHorvath Dr，GaborDeak Dr，MariaTorok，KarolyneDudits Dr，DenesFeher Dr，AttilaSass，LaszloHideq Dr，EvaVass Dr，ImreBTG International Ltd<120>抗脅迫基因<130>137980／PCT<140><141><150>HU P9702118<151>1997-11-18<150>HU P9702118<151>1998-03-09<150>HU P9702118<151>1998-04-21<160>5<170>PatentIn Ver．2．0<210>1<211>306<212>PRT<213>苜蓿<400>1Phe Gln Leu Asn Thr Gly Ala Lys Ile Pro Ser Val Gly Leu Gly Thr1 5 10 15Trp Gln Ala Glu Pro Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa20 25 30Xaa Xaa Gly Tyr Arg His Ile Asp Cys Ala Glu Ala Tyr Lys Asn Gln35 40 45Ser Glu Ile Gly Ser Ala Leu Lys Lys Leu Xaa Glu Asp Gly Val Val50 55 60Lys Arg Glu Glu Leu Trp Ile Thr Ser Lys Leu Trp Cys Ser Asp His65 70 75 80His Pro Glu Asp Val Pro Lys Ala Leu Asp Lys Thr Xaa Xaa Xaa Xaa85 90 95Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ile His Trp Pro Val Ser Met100 105 110Lys Arg Gly Thr Gly Glu Phe Met Gly Glu Asn Leu Asp His Ala Asp115 120 125Ile Pro Ser Thr Trp Lys Ala Leu Gly Ala Leu Tyr Asp Ser Gly Lys130 135 140Ala 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1．一種植物細胞，其特征在于它能超量產(chǎn)生或含有較高含量的醛糖還原酶同源蛋白。
2．如權(quán)利要求1的細胞，其特征在于它具有針對涉及自由基產(chǎn)生的脅迫條件和／或針對干旱的增強了的抗性。
3．如權(quán)利要求1的植物細胞，其特征在于所述醛糖還原酶同源蛋白是源于苜蓿的醛糖還原酶同源蛋白(MsALRh蛋白)或其功能性變體或衍生物。
4．如權(quán)利要求1或2的植物，該植物是通過導入編碼醛糖還原酶同源蛋白的表達的核酸分子而轉(zhuǎn)化過的。
5．如權(quán)利要求1-4中任一項的植物，其中，所述醛糖還原酶同源蛋白是含有序列1或3所示氨基酸序列的醛糖還原酶同源蛋白或其功能性變體。
6．如權(quán)利要求1-4中任一項的植物，其特征在于所述醛糖還原酶同源蛋白的氨基酸序列與序列1或3的序列具有至少50％的序列同源性。
7．如權(quán)利要求1-6中任一項的植物，其特征在于所述醛糖還原酶同源蛋白所含的氨基酸序列與序列1或3的序列具有至少90％的序列同源性。
8．如權(quán)利要求1-7中任一項的植物細胞，其特征在于所述醛糖還原酶同源蛋白所含的序列與序列1或3的序列具有至少50％的序列同一性。
9．如權(quán)利要求8的植物，具有針對涉及自由基產(chǎn)生的脅迫條件的增強了的抗性。
10．如權(quán)利要求9的植物細胞，其特征在于它具有針對用除草劑和／或重金屬和／或氯化鈉處理和／或針對由病毒和／或細菌和／或真菌導致的感染；和／或針對干旱的增強了的抗性。
11．一種含有權(quán)利要求1-10中任一項所述細胞的植物、植物部分或育種材料或由上述任一項產(chǎn)生的產(chǎn)品。
12．一種重組的、分離的、富集的、或無細胞的核酸分子，編碼具有序列1或3所示氨基酸序列的醛糖還原酶同源蛋白或其功能性變體或衍生物。
13．如權(quán)利要求12的核酸分子，其特征在于它編碼一種醛糖還原酶同源蛋白功能性變體或衍生物，其所含氨基酸序列與序列1或3的氨基酸序列具有至少50％的同源性。
14．如權(quán)利要求13的核酸分子，其特征在于它能在高嚴格條件下與序列2的核酸雜交。
15．一種重組的、分離的、富集的、或無細胞的核酸分子，其特征在于它包括序列2的15或15個以上連續(xù)堿基的多核苷酸或寡核苷酸片段或它的互補序列。
16．一種重組核酸分子，其特征在于它是權(quán)利要求13所述的分子。
17．一種編碼具有序列1或3的氨基酸序列的醛糖還原酶同源蛋白或其功能性變體的核酸分子，可用于制備權(quán)利要求1-10中任一項所述的植物細胞。
18．一種編碼醛糖還原酶同源蛋白超家族成員的核酸分子，其特征在于它是一種重組載體或構(gòu)建體形式，它與能促進其在植物中異位表達的啟動子、激活或調(diào)節(jié)序列功能性地結(jié)合在一起。
19．一種制備能超量產(chǎn)生醛糖還原酶同源蛋白的植物細胞的方法，包括用權(quán)利要求12-18中任一項所述的核酸分子轉(zhuǎn)化植物細胞。
20．用醛糖還原酶同源蛋白超家族成員保護植物細胞、植物或植物部分免于自由基產(chǎn)生的破壞作用的用途。
21．用編碼醛糖還原酶同源蛋白超家族成員的核酸保護植物細胞、植物或植物部分免于自由基產(chǎn)生的破壞作用的用途。
22．權(quán)利要求20或21的用途，其特征在于蛋白或核酸通過分子生物學操作施用于植物。
23．如權(quán)利要求1-22中任一項的用途，其特征在于所述蛋白是在營養(yǎng)或根組織中和／或以組成型和／或非時序型形式表達的。
24．一種保護植物細胞、或含有所述細胞的植物免于由非生物和生物脅迫誘導的自由基產(chǎn)生的破壞作用的方法，其特征在于它包括提高細胞中醛糖還原酶同源蛋白超家族成員的含量。
25．如權(quán)利要求24的方法，其特征在于它還包括對所述細胞使用銨和／或硫酸根離子。
26．如權(quán)利要求25的方法，其特征在于所述離子是以硫酸銨溶液形式使用的。
27．一種重組的、分離的、富集的、或無細胞的蛋白，其特征在于它是一種醛糖還原酶同源蛋白，其所含氨基酸序列與序列1或3的序列具有至少50％的序列同一性。
28．將權(quán)利要求22的蛋白或其表位部分用于產(chǎn)生能夠結(jié)合所述蛋白的抗體的用途。
29．一種抗體，其特征在于它能夠結(jié)合如權(quán)利要求27所述的醛糖還原酶同源蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及—優(yōu)選轉(zhuǎn)基因—植物細胞,育種材料,植物部分和植物,其中,醛糖還原酶同源蛋白的表達水平得到提高,并且具有對不同來源的脅迫條件的較高的抗性。本發(fā)明還涉及適用于表達醛糖還原酶同源蛋白的DNA分子和載體,以及用于制備超量表達醛糖還原酶同源蛋白的植物細胞的方法。本發(fā)明適用于減輕由有害的生物和非生物脅迫條件在作物上造成的損害,從而改善作物的收獲前景。
文檔編號A01H5/00GK1292823SQ98813179
公開日2001年4月25日 申請日期1998年11月18日 優(yōu)先權(quán)日1997年11月18日
發(fā)明者A·奧伯沙爾, G·霍爾瓦斯, M·德克, K·特雷克, D·杜蒂茨, A·菲赫爾, L·薩斯, E·希德格, I·瓦斯 申請人:英國技術(shù)集團國際有限公司