專利名稱：甘蔗的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘蔗植物、更具體地講涉及生產(chǎn)上述植物的方法。
眾所周知甘蔗是一種極其重要的農(nóng)作物，這是由于其在食品生產(chǎn)中的用途及其諸如糖蜜、蔗渣、濾漿(filter mud)和乙醇這樣的副產(chǎn)品的用途，所有這些用途既對發(fā)展中國家又對發(fā)達國家有著很大的價值。
一般說來，甘蔗是作為一種多年生作物進行培養(yǎng)的?？梢允乖撝参锷L一年，并稱作“甘蔗”。在這一階段割下甘蔗并進行加工以生產(chǎn)出糖。將甘蔗的根和少量甘蔗的莖留在地里，這可以在來年生長以生成“第一次截根苗”。然后收獲該植物以生產(chǎn)出糖，并且保留所述植物的剩余部分以便在下一年中生長來生成“第二次截根苗”。在一些國家中，在最終將植物連根拔起之前要重復這一生長循環(huán)直至“第五次截根苗”。
甘蔗是通過風媒傳粉的，這就導致在由種子得到的植物中存在著很大的變異性。這對于育種程序是很有用的，因為它產(chǎn)生了可以用來選擇新的有用克隆的許多不同的植物變異。但是對于正常的商業(yè)繁殖來說，天然的繁殖方法并不提供忠實于原型的(true-to-type)植物。結(jié)果直至今日，植物的繁殖僅為繁殖甘蔗的實際的方式?，F(xiàn)有繁殖甘蔗的方法依賴于使用成熟甘蔗的莖。從降低甘蔗作物的整體生產(chǎn)率來看該方法浪費很大，從勞動力的消耗來看該方法是昂貴的，從傳播病毒疾病(諸如斐濟病)、細菌疾病(諸如紅腐病)以及黑穗病這樣的主要的真菌疾病來看該方法還會產(chǎn)生一些問題。由于所述的疾病是由許多不同的載體傳播的并且可以非常迅速地傳遍整個的甘蔗種植區(qū)，因此甘蔗生產(chǎn)中出現(xiàn)的疾病問題是極其嚴重的。
不幸的是，由于在把莖切成大約30cm的節(jié)段之前植物必須要生長9-12個月，因此植物的繁殖是非常昂貴的。主要的問題在于甘蔗的切割末端暴露在污染物之中，尤其是由于甘蔗汁中營養(yǎng)物蔗糖的存在。結(jié)果便易于傳播會對甘蔗生產(chǎn)具有嚴重影響的病毒、細菌和真菌疾病。
由于在新的甘蔗植物生產(chǎn)中出現(xiàn)的所有這些問題，因此針對育種和繁殖程序以及消除病毒而言已經(jīng)研究了組織培養(yǎng)方法。例如，Barredo R.，Luzaman R和Dequinto B.(1994)使用心葉(分蘗的最靠內(nèi)部的葉子)從Phil 74-64品種生產(chǎn)13,500株小植物。但是，他們發(fā)現(xiàn)從實驗室工作開始起需花費8個月的時間來生產(chǎn)能夠在田地里種植的幼苗。Barba R.C.，Zamora A.B.，Linga C.K.和Thai VanN.(1975)使用了可以使它們由3cm的甘蔗枝條小片生產(chǎn)出4,000株小植物的愈傷組織法，但不利的是，該方法會導致遺傳變異。
通過植物組織培養(yǎng)技術(shù)，生物技術(shù)中最新的進展已經(jīng)對農(nóng)作物的改良和繁殖提供了新的機遇。
體細胞胚為含有枝條和根的分生組織的兩極結(jié)構(gòu)。它們既可以在愈傷組織中、又可以在細胞懸浮培養(yǎng)物中形成，并且直接導致成熟植物的形成。體細胞胚胎發(fā)生為植物的大規(guī)模生產(chǎn)提供了潛在的系統(tǒng)。但是對于實際用于植物大規(guī)模生產(chǎn)中的體細胞胚胎發(fā)生來說，必須克服直至本發(fā)明為止時對用于甘蔗植物生產(chǎn)的方法的使用仍存在著障礙的許多問題。直至本發(fā)明時，僅僅從在固體培養(yǎng)基上生長的愈傷組織生產(chǎn)出了成熟的體細胞胚。已知在愈傷組織上生長的細胞在遺傳學上是不穩(wěn)定的，因此從該愈傷組織培養(yǎng)出的胚胎可能在遺傳學上是顯著的。此外，愈傷組織衍生的胚胎并不同步生長，并且操作是勞動密集型的。這些問題使得愈傷組織衍生的體細胞胚胎發(fā)生不適合于大規(guī)模的商業(yè)化繁殖。與之相比，細胞的液體懸浮培養(yǎng)顯示出更大的遺傳穩(wěn)定性，通過改進生長條件可以使之同步生長，并且可以進行自動化操作。到本發(fā)明為止，液體培養(yǎng)的嘗試僅在生產(chǎn)未成熟的球形胚中取得了成功。
通過考慮上面提到的問題，已經(jīng)提供了本發(fā)明。本發(fā)明克服了這些問題，并且提供了生產(chǎn)甘蔗植物的有效且可靠的方法，該方法特別適用于大規(guī)模的商業(yè)目的。
根據(jù)本發(fā)明，提供了一種從甘蔗外植體生產(chǎn)甘蔗體細胞胚的方法，該方法包括下列步驟(1)從外植體培養(yǎng)未成熟的胚胎(2)從那些未成熟的胚胎中培養(yǎng)成熟的甘蔗的體細胞胚。
本發(fā)明提供了一種涉及用于在甘蔗植物生產(chǎn)中使用的體細胞胚產(chǎn)生的體細胞胚胎發(fā)生的系統(tǒng)，因為成熟的體細胞胚可以迅速并大量地產(chǎn)生，而且在體細胞胚中維持了原始的植物基因的特性。
隨后可以使通過本發(fā)明的方法產(chǎn)生的甘蔗體細胞胚發(fā)芽以生成甘蔗植物，或者可以將其包封在包封劑中以生成用于直接送入田地里的“人造種子”，從而使胚胎隨后在原位發(fā)芽。
最優(yōu)選的情況是至少步驟2發(fā)生在液體懸浮培養(yǎng)中，因為對于以大規(guī)模使用所述方法時，這是最為實用的培養(yǎng)基。
由本發(fā)明的方法生產(chǎn)甘蔗的體細胞胚涉及到體細胞胚胎發(fā)生。該方法是非常有價值的，因為它可能會以大約同步的方式在少量體積的培養(yǎng)基中生產(chǎn)出非常大量的胚胎。但是，與其它的甘蔗植物的營養(yǎng)繁殖方法相比，高增殖率僅僅是由用于隨后生成甘蔗植物的體細胞胚胎發(fā)生提供的幾個潛在優(yōu)點中的第一個優(yōu)點。例如，步驟(1)中胚發(fā)生組織的生長以及接下來在步驟(2)中胚胎發(fā)育至成熟都可以在液體培養(yǎng)基中實現(xiàn)，這就使得可能用最少量的處理來操作非常大量的無性繁殖體。此外，體細胞胚胎發(fā)生的產(chǎn)物為一種能夠通過進一步輸入極少量的勞力而發(fā)育成再生的甘蔗植物的胚胎。用于生產(chǎn)甘蔗植物的體細胞胚胎發(fā)生優(yōu)于營養(yǎng)繁殖和微量繁殖的現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)之處為在同一單元中同時存在著根和枝條的分生組織，因此無需費力的轉(zhuǎn)移操作，從而非常明顯地減少了操作費用。
此外，這種缺乏重復的轉(zhuǎn)移操作可以有利地減少由接觸傳播的污染。另一個優(yōu)點為胚發(fā)生系統(tǒng)能夠生產(chǎn)出分離的單個的胚胎，它不與母體組織或其它胚胎結(jié)合。因此，胚發(fā)生培養(yǎng)物生成了不僅完全、而且分散的無性繁殖體。這兩種特性的結(jié)合為體細胞胚提供了直接送入溫室或田地里的可能性，例如作為人造種子或處于液體條播(drilling)系統(tǒng)中的組分。
本發(fā)明的方法有利地提供了一種體外的增殖庫，從而為迅速地在液體培養(yǎng)基中獲得大量的甘蔗胚胎提供了新的可能性。比起目前使用存在著高勞動成本缺點的其它技術(shù)(諸如微量繁殖)得到的植物，上述方法可以使甘蔗植物更多和更快地繁殖。
使用涉及體細胞胚胎發(fā)生的本發(fā)明方法再生的甘蔗植物最優(yōu)選是從甘蔗植物特有的組織化的分生組織或分生組織細胞得到的。這些細胞在遺傳學上天生就穩(wěn)定并且不易于發(fā)生突變的改變。的確，有證據(jù)表明在體細胞胚發(fā)育的過程中存在著有利于在遺傳學上為正常細胞的強烈的選擇。結(jié)果，由本發(fā)明的方法得到的甘蔗植物導致產(chǎn)生了對可靠和有效地大量生產(chǎn)甘蔗植物很重要的真正的克隆群體。
因為缺少重復地處理植物組織、易于擴大所述工藝之規(guī)模的潛力并且相對容易地使所述工藝自動化，因此胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物特別適合于大規(guī)模的生產(chǎn)。在理論上將所述方法開發(fā)成為實際的生產(chǎn)系統(tǒng)需要生產(chǎn)出單個的胚胎，即所述胚胎處于發(fā)育的同一階段并且存在著最終轉(zhuǎn)化為幼苗的高轉(zhuǎn)化率。使用胚胎作為無性繁殖體的優(yōu)點為可能將它們包封起來以便直接送入田地里。
另外，本發(fā)明的方法有利地提供了從已經(jīng)在操作過的培養(yǎng)物中選擇的細胞再生為甘蔗植物的方式。因此，本發(fā)明的方法提供了一種用于甘蔗的新的遺傳操作技術(shù)的有效方法以便進行農(nóng)作物的改良，諸如體細胞雜交和遺傳轉(zhuǎn)化。
在本發(fā)明方法的步驟1中使用的外植體可以取自甘蔗母體植物的任何部分和發(fā)育的任何階段。例如，外植體的來源可以來自甘蔗植物的葉、根、幼枝、芽、花序、年幼的節(jié)間，和/或外植體可以包括通過應激(stress)甘蔗植物的葉、幼枝、根、芽、花序或年幼的節(jié)間而衍生的成熟的胚胎。應激可以通過用95％的乙醇處理植物部分一段時間(優(yōu)選1-5小時)和/或冷卻所述植物部分至大約5-15℃的溫度下約1-3個月來實現(xiàn)。最優(yōu)選的根衍生的或者成熟的胚胎用作外植體材料。
根外植體在形成未成熟的胚胎中是最有利的生產(chǎn)力的，這可能是由于根(尤其是尖部)主要是由分生組織組成的。而且，根外植體有利地不太受到植物組織培養(yǎng)技術(shù)中已知的培養(yǎng)基和細胞“褐變”問題的影響。“褐變”結(jié)果是由酚類化合物氧化成醌類氧化產(chǎn)物而產(chǎn)生的。酚類衍生物通常是由外植體釋放的。由于當從根外植體衍生時未成熟胚胎培養(yǎng)物的褐變基本上是不存在的，因此有利的是不需要改變培養(yǎng)基，從而在任何固定的時間段內(nèi)，根衍生的培養(yǎng)物傾向于積累更多的生物物質(zhì)。
使用根外植體、而非葉或枝條外植體的另一個優(yōu)點為生成了良好的、高度分散的未成熟胚胎培養(yǎng)物。此外，可以將根外植體直接用于在液體懸浮培養(yǎng)中生成胚胎，而無需形成中間的愈傷組織并且無需每隔2至5天更換培養(yǎng)基。對于使用體細胞胚胎發(fā)生而在工業(yè)上應用本發(fā)明的方法作為繁殖甘蔗的一種手段來說，這一特點是非常重要的。根外植體和非根外植體共同培養(yǎng)給混合的培養(yǎng)物帶來了與上述針對根外植體單獨培養(yǎng)的優(yōu)點基本上相同的優(yōu)點。例如，“褐變”通常出現(xiàn)在枝條外植體培養(yǎng)的過程中，而在混合的枝條和根的外植體培養(yǎng)中所述的褐變被減小到了最低的程度。
此外，由于通過把至少包括一個節(jié)在內(nèi)的枝條材料放入蒸餾水中可以容易地誘導出根部，因此根的外植體易于得到。在一段時間后，根的網(wǎng)絡(luò)生長起來，外植體材料即可以來源于此。在工業(yè)上應用本發(fā)明的方法中，這是特別有用的。
使用葉外植體的優(yōu)點包括其易于得到并且它們通?？梢砸圆皇芪廴镜臓顟B(tài)得到。
在使用葉外植體的情況下，最優(yōu)選的葉外植體來源于靠近植物生長點的區(qū)域，這是因為培養(yǎng)基褐變的頻率隨著距離生長點的距離的增加而增加。此外，葉外植體所來源的供體植物的年齡優(yōu)選介于大約3-12個月，但是最優(yōu)選大約為9個月，這是因為培養(yǎng)基褐變的頻率基本上不存在，并且來自9個月老的植物的所有葉子的節(jié)段實際上都是高度發(fā)生胚的。
上面提到的單獨或者與其它來源的外植體結(jié)合使用根外植體的優(yōu)點、尤其是避免了在植物培養(yǎng)技術(shù)中頻繁遇到的“褐變”問題，對于所有類型的植物的培養(yǎng)都是有利的(諸如樹、棗椰樹、馬鈴著)，因此甘蔗根的外植體的使用不局限于甘蔗的培養(yǎng)。
由外植體(本發(fā)明的步驟1)培養(yǎng)未成熟的胚胎的方法優(yōu)選包括下列步驟(a)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體材料以生成體細胞(b)選擇并且增殖來源于外植體材料的體細胞(c)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)體細胞一段時間，以便從體細胞誘導出未成熟的甘蔗的胚胎未成熟的胚胎可以在固體培養(yǎng)基上以胚發(fā)生愈傷組織來引發(fā)和維持，或者在液體培養(yǎng)中以胚發(fā)生細胞懸浮培養(yǎng)物來引發(fā)和維持，或者在優(yōu)選稱作“雙層”培養(yǎng)基的固體和液體培養(yǎng)基結(jié)合的培養(yǎng)基上引發(fā)和維持。
在本發(fā)明的方法中可以使用由Evans等、Gamborg等、Schenk與Hildebrandt(SH培養(yǎng)基)以及Murashige和Skoog(MS培養(yǎng)基)的相對稀釋的培養(yǎng)基至更加濃縮的配方這樣的寬范圍的固體和/或液體培養(yǎng)基。對于本發(fā)明的方法來說，最優(yōu)選使用的是固體或液體MS培養(yǎng)基，這是由于該培養(yǎng)基特別有利于以胚發(fā)生的愈傷組織/懸浮培養(yǎng)物來形成未成熟的胚胎以及誘導其體細胞的胚胎發(fā)生，而這可能是因為在MS培養(yǎng)基中存在著較高水平的氨型氮。根據(jù)需要，可以在本發(fā)明方法的不同步驟中使用不同的培養(yǎng)基。
在培養(yǎng)基配方中或者單獨或者以組合的方式包括最優(yōu)選的植物生長調(diào)節(jié)劑，諸如生長素(例如2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、吲哚3-乙酸(IAA))、細胞激動素(cytokinins)、赤霉素、脫落酸、抗生長素、細胞分裂素、玉米素和/或活性炭。在本發(fā)明的方法中，對于從外植體誘導未成熟胚胎(愈傷組織的形成和/或懸浮培養(yǎng))的發(fā)育以及對于從未成熟的胚胎發(fā)育成體細胞胚來說，生長素2，4-D是最有效的調(diào)節(jié)劑。寬的2，4-D的濃度范圍是合適的(例如0.5-10mg/l)，但是最優(yōu)選使用相對高的濃度(諸如大約3-5mg/l)。相反地，細胞激動素對未成熟的甘蔗胚胎的生長具有抑制作用。在培養(yǎng)基中優(yōu)選同時包含了ABA和2，4-D，ABA的濃度為0.1-20mg/l，最優(yōu)選其濃度約為1mg/l。ABA有利地阻滯了非胚發(fā)生細胞的生長，從而使培養(yǎng)物中胚發(fā)生細胞的百分比最優(yōu)化。
作為碳源和能源，糖是組織培養(yǎng)基的主要和基本的組分。最優(yōu)選使用蔗糖作為用于培養(yǎng)甘蔗的本發(fā)明方法中所用培養(yǎng)基的主要的糖組分。在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，許多其它的單糖(諸如葡萄糖和果糖)、二糖(諸如乳糖)以及其它的糖(諸如蜜二糖)也可以支持生長和胚胎發(fā)生。但是，蔗糖的使用對本發(fā)明的方法而言是特別有好處的，因為它不增加培養(yǎng)物的褐變。所用蔗糖的濃度優(yōu)選在10-60g/l的范圍內(nèi)。所用蔗糖的濃度最優(yōu)選地約為30g/l。直至本發(fā)明時，在培養(yǎng)甘蔗的過程中通常以椰子汁作為培養(yǎng)基的一個組分。但在本發(fā)明的方法中，有利的是椰子汁不是一種必須的組分，從而降低了成本。
在將外植體材料引入培養(yǎng)基(步驟a)之前，通過應激外植體材料和/或來源于所述外植體材料的組織來最有效地刺激胚發(fā)生愈傷組織和/或胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)物的生成。
例如，這可以通過涉及將外植體冷卻到大約5℃-15℃的溫度下大約1-3個月的應激-處理來實現(xiàn)。最優(yōu)選將外植體冷卻到大約10℃下約2個月。用于刺激胚胎產(chǎn)生的其它合適的應激處理包括將外植體在大約95％的乙醇中浸泡約1-5個小時。優(yōu)選在后的乙醇方法，因為這是一種處理甘蔗外植體以去除污染、同時保留下對培養(yǎng)而言可存活的細胞以生成胚發(fā)生材料的現(xiàn)有的方法。在乙醇中浸泡外植體的最優(yōu)選的時間約為4個小時。
在乙醇處理之前，優(yōu)選用諸如燭蠟這樣的蠟來覆蓋取自母體甘蔗植物的組織暴露出的切口端，以便減少在切口處暴露的組織對乙醇的吸附。將組織在乙醇中浸泡之后，優(yōu)選將所述的組織包裹在無菌干燥的組織試紙或類似物之中以吸去剩余的乙醇。然后可以從供體組織(例如葉、枝條、根)選擇和切下外植體材料，并將其引入培養(yǎng)基中。接下來培養(yǎng)外植體一段時間以誘導體細胞形成。通過使用含有ABA的培養(yǎng)基，最優(yōu)選地通過陽性來選擇體細胞的發(fā)育。ABA阻滯了其它類型的細胞的生長，從而使得所需的體細胞的百分比最優(yōu)化。通過根據(jù)其尺寸和形狀分離細胞的方法進一步選擇體細胞。甘蔗的體細胞通常是圓形的，其直徑約為40-65μm，最通常地直徑介于46-63μm。相反地，非胚發(fā)生的甘蔗細胞通常是伸長的，并且其長度小于約46μm。基本上僅僅選擇體細胞的方便的方法是通過網(wǎng)眼尺寸為100-50μm的第一個篩子來篩分培養(yǎng)物，從而基本上使體細胞和非胚發(fā)生的細胞通過(但卻收集了任何較大的顆粒，諸如細胞聚集體)，隨后通過網(wǎng)眼尺寸為50-38μm的第二個篩子來篩分已過篩的培養(yǎng)物，這就基本上使非胚發(fā)生的細胞通過、而基本上收集了體細胞。體細胞最佳的選擇發(fā)生在第一個篩子約為63μm、第二個篩子約為45μm的情況下。
為了增殖的目的，然后優(yōu)選將所選擇的體細胞重新懸浮在上述含有2，4-D的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基優(yōu)選還含有如上所述的ABA。
然后培養(yǎng)體細胞一段時間以生成未成熟的胚胎，步驟(c)。所述的時間通常介于10天和40天之間，而這取決于例如外植體的性質(zhì)、所用的培養(yǎng)基以及所用的生長調(diào)節(jié)劑的濃度和種類。一般說來，體細胞形成未成熟胚胎的百分數(shù)隨著2，4-D濃度的增加而增加。
未成熟的胚胎可以通過本發(fā)明的方法在黑暗或者光照的條件下或者結(jié)合黑暗和光照的條件來生產(chǎn)。最優(yōu)選的是將培養(yǎng)物暴露在16小時光照和8小時黑暗的光循環(huán)之中，因為該循環(huán)產(chǎn)生了數(shù)量最大的胚胎。
來自起源于外植體的體細胞的未成熟胚胎的培養(yǎng)可能涉及到來自于原始培養(yǎng)物的傳代培養(yǎng)物的生長。在傳代培養(yǎng)至新鮮的培養(yǎng)基上之前，最優(yōu)選地將原始培養(yǎng)物在原始培養(yǎng)基上至少維持3個月。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這樣會生產(chǎn)出數(shù)量最佳的胚發(fā)生的培養(yǎng)物。
在外植體的原始培養(yǎng)物涉及到在固體培養(yǎng)基上從外植體引發(fā)胚發(fā)生的愈傷組織時，本發(fā)明方法的步驟1進一步涉及到來自外植體的胚發(fā)生愈傷組織在液體培養(yǎng)基中的傳代培養(yǎng)，以便建立和維持胚發(fā)生細胞的懸浮培養(yǎng)。直至本發(fā)明時，上述傳代培養(yǎng)存在著大量問題，其中包括當轉(zhuǎn)移至液體培養(yǎng)基時愈傷組織培養(yǎng)物廣泛地發(fā)生褐變，在液體培養(yǎng)中產(chǎn)生了大量的根、而不是胚胎，愈傷組織細胞進行聚集、而不是形成了良好的懸浮培養(yǎng)物等等。
以前，僅僅通過每隔2-4天重復地更換培養(yǎng)基來防止液體培養(yǎng)基的褐變。這樣的更換耗費了時間，并且會浪費昂貴的培養(yǎng)基。培養(yǎng)基的更換還能帶來培養(yǎng)物污染的可能性并且損失了由細胞產(chǎn)生的重要的化學物質(zhì)。因此對于通過體細胞胚胎發(fā)生來大規(guī)模地繁殖甘蔗而言，替換培養(yǎng)基以克服褐變問題并不是一種切實可行的選擇方案。本發(fā)明已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了解決這一問題的不同的方法，它們不需要進行上述重復的傳代培養(yǎng)來避免褐變。
在本發(fā)明中，最優(yōu)選的是將由根外植體單獨或者與其它類型的外植體一同形成的胚發(fā)生愈傷組織用于形成液體懸浮培養(yǎng)物。根的愈傷組織迅速地分散開來，并且產(chǎn)生了帶有最少量細胞聚集體的良好的懸浮物。此外，根的愈傷組織基本上不產(chǎn)生任何培養(yǎng)基或者細胞的褐變，因此根愈傷組織的懸浮培養(yǎng)不需要進一步的傳代培養(yǎng)以避免培養(yǎng)基和/或細胞褐變的問題。使用甘蔗根的外植體用于培養(yǎng)的本發(fā)明的方法對所有類型的植物培養(yǎng)物而言都是重要的，直至本發(fā)明時，所述的植物培養(yǎng)物都已遇到了“褐變”的問題、諸如棗椰樹。
至少在葉外植體衍生的培養(yǎng)物的情況下，抗壞血酸和檸檬酸協(xié)助防止了細胞和培養(yǎng)基的褐變。因此，作為愈傷組織起始固體培養(yǎng)基和液體胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)基的一個組分而優(yōu)選包含著抗壞血酸。在本發(fā)明培養(yǎng)過程的不同階段需要不同濃度的抗壞血酸/檸檬酸。最優(yōu)選地在由葉外植體建立愈傷組織時，在固體培養(yǎng)基中含有大約1-2mg/l的抗壞血酸以防止外植體的褐變。對于由愈傷組織建立懸浮培養(yǎng)物時，在培養(yǎng)基中包含有優(yōu)選50mg/l-200mg/l的抗壞血酸(最優(yōu)選大約100mg/l的抗壞血酸)以及優(yōu)選250mg/l的檸檬酸(最優(yōu)選大約150mg/l的檸檬酸)。在懸浮培養(yǎng)的起始階段之后，在維持培養(yǎng)基中應當存在著濃度為2mg/l-20mg/l、并且最優(yōu)選約為10mg/l的抗壞血酸以避免褐變。
其它的抗氧化劑可能是有用的，例如在把愈傷組織轉(zhuǎn)入液體培養(yǎng)基中以便建立懸浮培養(yǎng)物之前，可以在原始的固體培養(yǎng)基中摻入活性炭。
另一方面，同時培養(yǎng)根和非根的外植體，這是因為根外植體/愈傷組織的存在基本上抑制了培養(yǎng)基和細胞褐變的發(fā)生。
影響懸浮培養(yǎng)物形成及其隨后生長的一個重要的因素為愈傷組織接種物的密度。接種物的密度越大，細胞聚集的頻率也越高。為了得到分散良好的懸浮培養(yǎng)物，優(yōu)選接種物的密度在1-10g/l培養(yǎng)基的范圍內(nèi)。最優(yōu)選的密度約為5g/l。
對于懸浮培養(yǎng)物的最佳的生長來說，最優(yōu)選的光照周期為16小時光照/8小時黑暗的循環(huán)。
在液體培養(yǎng)基中最優(yōu)選的糖源為蔗糖。當然可以是諸如上面提到的單糖和二糖這樣的其它類型的糖類。對于最佳的胚胎生產(chǎn)來說，最優(yōu)選使用濃度為20-60g/l的蔗糖和/或葡萄糖、并且最優(yōu)選約為30g/l。
在液體培養(yǎng)基中優(yōu)選包括脫落酸(ABA)。介于0.1-20mg/l之間的濃度是優(yōu)選的，并且最優(yōu)選約為1mg/l，因為這樣抑制了非胚發(fā)生細胞的生長、同時鼓勵了胚發(fā)生細胞的生長，并且促進了基本上純的胚培養(yǎng)物的生成。這就特別有利于胚發(fā)生培養(yǎng)物高效長期的維持，因為它避免了在每次傳代培養(yǎng)的過程中需要密集的勞動以除去所形成的非胚發(fā)生細胞，從而確保了高效、長期的再生。在其它類型植物的培養(yǎng)中，這種在培養(yǎng)基中使用ABA來抑制非胚發(fā)生細胞的生長可能也是重要的。
對于在商業(yè)上大規(guī)模地繁殖甘蔗胚胎來說，優(yōu)選的情況是一開始在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體衍生的愈傷組織，從而將其轉(zhuǎn)移以便在液體培養(yǎng)基中進一步發(fā)育。如果一開始在固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)的外植體衍生的愈傷組織繼續(xù)在固體培養(yǎng)基上發(fā)育的話，那么盡管最終將胚胎建成為甘蔗小植物，但是胚胎并不同步發(fā)育并且必須單獨進行處理。因此對在商業(yè)上大規(guī)模繁殖甘蔗來說，優(yōu)選的是將外植體衍生的愈傷組織從固體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)移到液體懸浮培養(yǎng)中進行進一步的發(fā)育。但重要的是，另外也可能直接在液體懸浮培養(yǎng)基中直接從根的外植體開始未成熟的球形胚的生產(chǎn)，從而避免了例如至少對枝條和葉的外植體培養(yǎng)而言所需要的在固體培養(yǎng)基上進行原始誘導的要求。
因此，本發(fā)明方法的步驟2最優(yōu)選地包括通過誘導體細胞胚胎發(fā)生，使得在液相懸浮培養(yǎng)中未成熟的球形胚成熟至發(fā)育完全的胚胎。直至本發(fā)明為止，問題已經(jīng)阻礙了在液體培養(yǎng)中成功地生產(chǎn)出成熟的甘蔗胚胎。
本發(fā)明提供了一種成功地實現(xiàn)了這種使用根、枝條和葉的外植體作為原始的植物組織來源的方法。最優(yōu)選使用根的外植體。有利的是，在步驟2中根衍生的培養(yǎng)物生成了一種使懸浮物發(fā)粘的膠質(zhì)狀的物質(zhì)。這種膠質(zhì)狀的物質(zhì)具有重要的協(xié)助防止褐變的性質(zhì)。而且，培養(yǎng)基粘度的增加也提高了胚胎發(fā)生的程度。通過在相對高的溫度下(諸如35℃)、在無菌條件中將根浸入水中，可以從甘蔗的根誘導膠質(zhì)狀物質(zhì)的生產(chǎn)。然后可以取回膠質(zhì)狀的物質(zhì)，并將其加入任何發(fā)生“褐變”的植物組織/細胞培養(yǎng)物中。使用這種物質(zhì)可以代替對在通常需要避免“褐變”的培養(yǎng)基中包括昂貴的抗氧化劑的需求。
如前文所述，在含有2，4-D的培養(yǎng)基中從外植體有效地誘導出甘蔗未成熟的胚胎。最優(yōu)選的是對步驟2而言，隨后將未成熟的胚胎轉(zhuǎn)移到不含生長素2，4-D的液體培養(yǎng)基中，以便鼓勵成熟胚胎的發(fā)育。但是，僅有根衍生的懸浮培養(yǎng)物在不含2，4-D的液體培養(yǎng)基中發(fā)育成成熟的胚胎、而基本上不發(fā)生褐變。例如將葉和枝條衍生的懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到不含2，4-D的培養(yǎng)基中時，褐變發(fā)展起來、減少了胚胎的成熟。因此在這種情況下，優(yōu)選在這一階段向培養(yǎng)基中加入活性炭或其它合適的抗氧化劑，這就協(xié)助控制了培養(yǎng)基和細胞的褐變，從而使得并且鼓勵成熟胚胎發(fā)育。對根衍生的培養(yǎng)物而言，活性炭/抗氧化劑的加入并不是必須的、但卻可以包括在某些條件下，例如當根培養(yǎng)物的年齡大于大約2個月時的情況，因為超過該時間以后，根培養(yǎng)物通常開始產(chǎn)生“褐變”的問題。最優(yōu)選的是在需要活性炭的情況下，向液體培養(yǎng)基中加入濃度約為3g/l的活性炭。
優(yōu)選使培養(yǎng)物在一段時間內(nèi)發(fā)育，優(yōu)選介于50-60天之間。在成熟階段中，優(yōu)選頻繁地更換培養(yǎng)基，例如每周進行更換。例如取決于培養(yǎng)條件，未成熟球形胚的體細胞胚胎發(fā)生成為兩極胚、而后成為成熟的體細胞魚雷胚發(fā)生在大約30-40天。
對于將要用于大規(guī)模生產(chǎn)甘蔗植物的體細胞胚胎發(fā)生來說，被送入田地里的成熟的胚胎(優(yōu)選呈合成種子的形式)應當產(chǎn)生均勻生長的植物，以便促進諸如除草、灌溉和收獲這樣的農(nóng)業(yè)操作。在甘蔗中，為了實現(xiàn)最大量地生產(chǎn)出糖，植物必須處于成熟的某一年齡。開花后，糖的產(chǎn)量顯著下降。因此對接下來的發(fā)芽來說，關(guān)鍵是讓所有成熟的胚胎處于發(fā)育的同一階段，以便植物在同一時間成熟。
為了避免未成熟胚胎不同時成熟，步驟2最優(yōu)選地包括一種處理胚胎以克服不同時發(fā)育的方法。合適的處理包括在冷的儲存器中儲存懸浮培養(yǎng)物。最佳的條件例如為在5℃(+或-1℃)下儲存大約10天。另一種可以有利地易于原位使用而沒有污染危險的簡單的處理為熱處理，例如在約50℃下處理45-60分鐘。在經(jīng)過該處理后，非胚發(fā)生的細胞和胚發(fā)生的細胞喪失了其生存能力，而胚胎則不受影響。
在所述的熱處理之后或者另一方面，為了選擇具有體細胞胚的較高百分數(shù)的培養(yǎng)物，優(yōu)選如上關(guān)于本發(fā)明的第一步所述來篩分懸浮培養(yǎng)物。最理想的是通過一個網(wǎng)眼為63μm的第一個篩子篩分懸浮物，并在網(wǎng)眼為45μm的第二個篩子上收集。
最理想的是在篩分之后攪拌培養(yǎng)物，這就基本上除去了任何剩余的非胚發(fā)生的細胞。當所述培養(yǎng)物處于攪拌生物反應器中時，通過在約500rpm下操作攪拌器大約1個小時來方便地實現(xiàn)所述的攪拌。應當領(lǐng)會的是對任何種類的植物培養(yǎng)而言，可以有利地應用上述在培養(yǎng)中優(yōu)化胚胎同步發(fā)育的方法，其中異步發(fā)育通常發(fā)生在例如用于生產(chǎn)樹木、棗椰樹和馬鈴薯的胚胎的培養(yǎng)中。
對于通過組織和細胞培養(yǎng)來大量地繁殖甘蔗植物來說，使用生物反應器生產(chǎn)甘蔗的體細胞胚是非常合乎需要的。使用生物反應器，就可能控制培養(yǎng)條件、使方法自動化、生產(chǎn)出大量的懸浮培養(yǎng)物并且避免了對所生成的懸浮培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)的需要。
對于體細胞胚胎發(fā)生而言，生物反應器具有許多優(yōu)于搖瓶的優(yōu)點。除了它巨大的工作體積之外，由于通過機械攪拌或者通過給培養(yǎng)基通風而產(chǎn)生的混合，因此生物反應器提供了均勻的培養(yǎng)。使用生物反應器，就可能監(jiān)測pH、溶氧濃度及其它環(huán)境因素。
最重要的因素之一為培養(yǎng)基中的溶氧濃度，該濃度是由生物反應器中的通風和攪拌速率來控制的。其它重要的因素為培養(yǎng)基內(nèi)部細胞的分布和密度。
任何類型的生物反應器都適合于本發(fā)明的方法，諸如氣升式生物反應器和機械攪拌生物反應器。在氣升式生物反應器中，使用空氣既提供了通風、又混合了培養(yǎng)物。借助機械攪拌生物反應器，就可能控制與混合的水平無關(guān)的培養(yǎng)基的充氧。因此這種在后的生物反應器的類型是優(yōu)選的，因為它可能獨立地改變機械攪拌器的轉(zhuǎn)動速度。在超過500rpm的轉(zhuǎn)子速度下沒有非胚發(fā)生細胞存活，從而轉(zhuǎn)子速度的變化是改進胚發(fā)生培養(yǎng)物同步的一種有價值的方式。
攪拌釜生物反應器中的體細胞胚胎發(fā)生的百分數(shù)通常高于氣升式生物反應器中的百分數(shù)。攪拌釜在所有的階段中均提供了良好的混合，而氣升式生物反應器中的流速必須隨著生長的增加而連續(xù)地增加，這是因為若氣流速度低的話，那么許多的細胞將沉淀。伴隨著高的氣流速度會發(fā)生大量的蒸發(fā)和泡沫的形成，這就造成許多的細胞附著到生物反應器的壁上。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于從未成熟的胚胎培養(yǎng)甘蔗成熟的體細胞胚的方法，該方法包括下列步驟(1)從外植體制備未成熟胚胎的液體懸浮培養(yǎng)物(2)在生物反應器中培養(yǎng)所述的懸浮物以形成體細胞胚。
最優(yōu)選的是在生物反應器中進行步驟(1)和步驟(2)的培養(yǎng)。但是，步驟(1)可以換一種方式例如在搖瓶中進行，并且將未成熟胚胎的培養(yǎng)物用作用于在步驟(2)的生物反應器中培養(yǎng)的接種物。
最優(yōu)選的是步驟(1)包括在含有2，4-D和ABA的培養(yǎng)基中直接培養(yǎng)來自于根外植體的根的胚發(fā)生愈傷組織。最理想的2，4-D的濃度在0.1-5mg/l的范圍內(nèi)且最優(yōu)選為3mg/l，ABA的濃度最理想為0.1-20mg/l且最優(yōu)選為1mg/l。優(yōu)選在步驟(2)之前，所述的方法包括以上述方式通過篩子篩分培養(yǎng)物以形成良好的懸浮物。優(yōu)選篩子的網(wǎng)眼尺寸為63μm，并且在網(wǎng)眼尺寸為45μm的篩子上收集懸浮物，這基本上確保了良好的懸浮物基本上包括體細胞胚。接下來，所述的方法優(yōu)選包括在步驟2之前一個額外的將步驟1的培養(yǎng)物重新懸浮于新鮮培養(yǎng)基中的步驟。這一額外的步驟優(yōu)選包括在含有2，4-D和ABA的新鮮培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)最理想大約1個月，以便形成高度的胚的培養(yǎng)物。對于重新懸浮于生物反應器中來說，最優(yōu)選的接種密度約為5g/l。最優(yōu)選通過在500rpm下攪拌培養(yǎng)物1小時來除去任何剩余的非胚發(fā)生細胞。這可以在攪拌釜型生物反應器中最方便地得以實現(xiàn)，因此可以調(diào)節(jié)攪拌器轉(zhuǎn)子的速度。
步驟(2)優(yōu)選包括在不含2，4-D、而含有ABA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)懸浮物，其中優(yōu)選在攪拌式生物反應器中培養(yǎng)。最優(yōu)選有規(guī)律地更換生物反應器中的培養(yǎng)基直至成熟。這通常發(fā)生在大約50天時。優(yōu)選例如每10天更換一次培養(yǎng)基。
隨后可以將由本發(fā)明的方法(在生物反應器中或以其它的方式)生產(chǎn)的成熟的胚胎包封起來以形成“人造種子”。
甘蔗小植物的生產(chǎn)包括通過使胚胎發(fā)芽來使體細胞胚成熟為植物的幼苗。該步驟最優(yōu)選包括在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)單個的體細胞胚。所述的培養(yǎng)優(yōu)選在聚乙烯泡沫上進行。聚乙烯泡沫有利地支持了幼苗，使得可以容易地將幼苗直接轉(zhuǎn)移到田地里。優(yōu)選體細胞胚處于晚魚雷期。優(yōu)選在不含2，4-D的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)胚胎。培養(yǎng)基可以有利地包括濃度為0.05-1mg/l的ABA、最優(yōu)選濃度為0.1mg/l。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生于用ABA處理的胚胎的幼苗更加茁壯并且在溫室條件下生存得更好。
在發(fā)芽之前，可以將由本發(fā)明方法生產(chǎn)的體細胞胚包封起來以形成人造種子。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于包封體細胞胚的方法，該方法包括向體細胞胚中加入至少一種包封劑的步驟。該方法適合于包封許多植物的體細胞胚，其中包括但不限于甘蔗、各類樹木、馬鈴薯、棗椰樹等，以形成易于處理、儲存和運輸?shù)乃^的“人造種子”。
最優(yōu)選的包封劑包括至少一種全谷物面粉/水糊狀物(waterpaste)。這種糊狀物作為包封劑是特別有利的，因為它給包裹住的胚胎提供了營養(yǎng)物、使得胚胎可以通風、形成了外殼以保持胚胎潮濕并且對胚胎而言易于其發(fā)芽，而且它也不貴。全高粱粉是一種特別優(yōu)選的物質(zhì)，這是因為它特別便宜。所用的面粉可以是發(fā)酵過的或者是沒有發(fā)酵的。發(fā)酵過的面粉最為優(yōu)選，因為由此產(chǎn)生的膠囊基本上都抗裂。面粉與水的混合物優(yōu)選為每100ml的水中有5-30g的面粉，并且最優(yōu)選為大約10g面粉/100ml水。
包封的方法優(yōu)選包括下列步驟(1)形成面粉/水糊狀物(2)向糊狀物中加入體細胞胚(3)把包封在糊狀物中的單個的胚胎放入水中，以便在每個胚胎周圍形成膠囊(4)干燥所述的膠囊形成面粉/水糊狀物的方法優(yōu)選包括將面粉和水混合在一起、加熱所述的混合物以形成糊狀物、對糊狀物進行高壓滅菌、冷卻所述的糊狀物。
在干燥之前，可以將膠囊浸入諸如殺真菌劑和/或殺細菌劑這樣的殺微生物劑之中。
在包封胚胎的方法的步驟(4)之前或之后，所述的方法可以進一步包括下列步驟(a)向膠囊中加入海藻酸鈉溶液(b)接下來把所述的膠囊放入氯化鈣溶液中。
這些額外的步驟產(chǎn)生了含有包封在面粉糊狀物中的單個胚胎的海藻酸鈣珠。
最理想的是在上述步驟中所用的海藻酸鈉溶液的濃度約為3％，從而理想地將其轉(zhuǎn)移到步驟(ii)中75mM的氯化鈣溶液中?？梢允购袉蝹€胚胎的海藻酸鈣珠在液體或固體培養(yǎng)基中(諸如不含2，4-D的培養(yǎng)基)或者直接在土壤中發(fā)芽。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有包封在以面粉為基質(zhì)物質(zhì)中的植物胚胎的人造種子。優(yōu)選將面粉包封的胚胎包裹在海藻酸鈣珠的內(nèi)部。人造種子最優(yōu)選是由上述方法生產(chǎn)的。最優(yōu)選的植物胚胎為由本發(fā)明的方法生產(chǎn)的甘蔗的體細胞胚。
這種包含體細胞胚的人造種子提供了優(yōu)于有性種子的許多的優(yōu)點。例如，其發(fā)芽率要高于有性種子的。而且，與通常由有性種子表現(xiàn)出的染色體變異和差的存活能力相比，人造種子在遺傳學上是穩(wěn)定的并且能夠高度存活。另外，這種人造種子提供了優(yōu)于甘蔗的營養(yǎng)繁殖的許多優(yōu)點，就甘蔗的使用、勞力和運輸而言所述的營養(yǎng)繁殖費用大并且也帶來了疾病污染的高風險。本發(fā)明生產(chǎn)體細胞胚以及隨后進行包封以形成人造種子的方法提供了一種非常有效的生產(chǎn)甘蔗的方法，因為它給從單個甘蔗的外植體來大量地生產(chǎn)有活力的、在遺傳學上相同的人造種子提供了一種不含污染、低勞力、時間效率高的方法?？梢砸宰畹偷某杀緝Υ?、運輸和種植所生產(chǎn)的人造種子。
由母體植物的營養(yǎng)繁殖產(chǎn)生的植物與那些由本發(fā)明的體細胞胚胎發(fā)生產(chǎn)生的植物在形態(tài)、糖含量、生物化學等方面是相似的，而且由本發(fā)明方法產(chǎn)生的植物在許多特性上都類似于原始的母體植物。因此，本發(fā)明的方法為甘蔗的大規(guī)模生產(chǎn)提供了一種在商業(yè)上重要并且富有生命力的新方法。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種由包括下列步驟的方法生產(chǎn)的甘蔗的體細胞胚(1)從外植體培養(yǎng)出未成熟的胚胎(2)從那些未成熟的胚胎中培養(yǎng)出成熟的甘蔗的體細胞胚根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種由包括下列步驟的方法生產(chǎn)的甘蔗植物(1)從外植體培養(yǎng)出未成熟的胚胎(2)從那些未成熟的胚胎中培養(yǎng)出成熟的甘蔗的體細胞胚(3)使那些體細胞胚發(fā)芽以形成至少一株甘蔗植物。
最優(yōu)選地，所述方法包括一個額外的在將步驟2中產(chǎn)生的成熟的體細胞胚包封在包封劑中的步驟3之前的步驟。所述的甘蔗體細胞胚優(yōu)選是通過根據(jù)本發(fā)明上述方面的方法產(chǎn)生的。
優(yōu)選地，那些步驟包括根據(jù)本發(fā)明上述方面的方法。
現(xiàn)在，通過以下非限制性的實施例來描述本發(fā)明。
實施例葉的外植體的制備將來自Co527品種(Kenana糖業(yè)公司)的甘蔗的連根切枝(setts)在52℃的水浴中浸沒2天，以便暴露任何的污染物并且促進生根和發(fā)芽。
隨后在25℃下、以16小時光照的光周期在溫室中自11月至4月并且在5月至10月期間使用自然光、在Levington MultipurposeCompost(Fisons)上培養(yǎng)所述的連根切枝。
每周用液體肥料(Tomorite Rey TM，F(xiàn)isons)給正在生長的植物施肥。
在三個月時，把葉的外植體切成5mm的外葉和內(nèi)葉的節(jié)段。
通過在95％的乙醇中浸泡20分鐘來給葉的外植體滅菌。
枝條或根的外植體的制備在體外從起源于葉外植體(Co527品種)的愈傷組織培養(yǎng)物中得到小植物。母體植物選自那些小植物，并且在枝條繁殖培養(yǎng)基上進行繁殖。根和枝條的外植體是從這些三個月大的微量繁殖的植物中得到的。在無菌培養(yǎng)中無需滅菌從再生的植物中轉(zhuǎn)移出根和枝條的外植體。
培養(yǎng)物MS(Murashinge與Skoog，1962)培養(yǎng)基的制備基本培養(yǎng)基是由貯存液制得的，然后用各種組合的植物生長調(diào)節(jié)劑、維生素和糖進行補充，其貯存液是單獨制備的并且在黑暗的瓶子中于-20℃下儲存。在制備過程中，向培養(yǎng)基中加入肌醇、固化劑(瓊脂)和糖。培養(yǎng)基是由雙蒸水制得的。在高壓滅菌前加入熱穩(wěn)定的植物生長調(diào)節(jié)劑以及其它的化合物，而僅在倒入無菌平板之前才向微溫的培養(yǎng)基中加入熱不穩(wěn)定的化合物、諸如玉米素和ABA。在高壓滅菌前，通過使用1M NaOH或1M HCl將所有培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到5.8。在固體培養(yǎng)基的情況下，在調(diào)節(jié)pH之前加入0.9％(w/v)的瓊脂(Sigma，UK)。
將含有30g/l蔗糖和3mg/l 2，4-D的Murashige與Skoog(1962)培養(yǎng)基用于愈傷組織培養(yǎng)物以及搖瓶和生物反應器中的懸浮培養(yǎng)物的生長和維持；它稱為(MS1)。對胚胎發(fā)生而言，使用含有30g/l蔗糖的Murashige與Skoog培養(yǎng)基并且稱作(MS2)。根據(jù)需要可以對培養(yǎng)基進行調(diào)節(jié)。
定期無菌地取出樣品，并且將樣品涂在MYGP瓊脂(麥芽和酵母提取物，葡萄糖和胨)、PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)和NA(營養(yǎng)瓊脂)的板上，所有的試劑均由Oxoid，Basingstoke，Hants提供。然后在檢查微生物的生長之前，將這些植物在25℃下培養(yǎng)1周。
愈傷組織培養(yǎng)物的引發(fā)通過在用0.9％瓊脂固化的含有MS1的90×15mm無菌的塑料陪替氏培養(yǎng)皿(Sterilin Ltd.UK)中培養(yǎng)外植體來引發(fā)愈傷組織的培養(yǎng)物。用石蠟膜(American National Can Co.)密封陪替氏培養(yǎng)皿以減少由蒸發(fā)帶來的濕度的損失。在培養(yǎng)幾周后，當愈傷組織已經(jīng)生長之時，用無菌鑷取出愈傷組織并將其放在新鮮的瓊脂板上。然后再培養(yǎng)一個月。棄去包括任何深褐色或者被污染的組織在內(nèi)的剩余的原始外植體。
懸浮培養(yǎng)物的生產(chǎn)一開始，懸浮培養(yǎng)物是通過把0.5-1.0g(鮮重)的愈傷組織材料放入含有50ml MS1的無菌的250ml錐形搖瓶(Corning，Stone，Staffs.)中來生產(chǎn)的。在用大約12×12cm見方的雙層無菌鋁箔重新密封后，將燒瓶放置在轉(zhuǎn)速為100rpm的旋轉(zhuǎn)振蕩器上。在幾周內(nèi)，這種輕柔的振蕩作用促進了細胞更小的部分以及單個的細胞離開較大的聚集體。然后對該培養(yǎng)物進行傳代培養(yǎng)，特別注意的是轉(zhuǎn)移出較小的團塊并棄去較大的聚集體。每周將較好的細胞聚集體的10-15ml的等分試樣轉(zhuǎn)移到處于250ml搖瓶的50ml新鮮的培養(yǎng)基中。
根的懸浮培養(yǎng)物的直接建立以便小規(guī)模地生產(chǎn)將從成熟的植物或從微量繁殖的植物收獲的根直接放入含有0.5-10mg/l 2，4-D(最優(yōu)選為3mg/l)以及ABA 0.1-10mg/l(最優(yōu)選1mg/l)的液體培養(yǎng)基中。形成了一種良好的懸浮培養(yǎng)物。
通過體細胞胚胎發(fā)生進行成熟胚胎的生產(chǎn)對于胚胎發(fā)生來說，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到不含2，4-D的MS培養(yǎng)基中。胚胎的成熟發(fā)生在不含生長調(diào)節(jié)劑的相同的MS培養(yǎng)基中。
用于工業(yè)用途的根的懸浮物的建立(作為大型生物反應器的接種物)年齡為9個月的種植得良好的母體植物為植物材料的來源。將在地面以上的植物切掉10cm，切下帶有2個節(jié)(大約20cm長)的連根切枝，用熔化的石蠟封住切口端。在20％的次氯酸鈉中使連根切枝滅菌20分鐘并用蒸餾水洗滌多次，去掉用蠟封的末端。仔細地除去芽，從而抑制枝條在生物反應器內(nèi)部的生長。把植物放入3升的生物反應器內(nèi)且靠近生物反應器的器壁，并且通過無毒的膠而與器壁連接的圓形硅管使所述植物固定在器壁上。
生物反應器中裝滿了蒸餾水，并且通過35℃的水浴且不運行攪拌器來控制溫度。龐大的根的網(wǎng)絡(luò)生長。當根約為1英寸長時，用虹吸管抽出蒸餾水并使生物反應器中裝滿MS1培養(yǎng)基。接下來將溫度降至27℃。在100rpm下攪拌生物反應器。1個月后，不發(fā)生褐變的良好的懸浮物隨時都可以用作接種物。
通過網(wǎng)眼為63μm的篩子來篩分良好的懸浮物，并在網(wǎng)眼尺寸為45μm的篩子上收集懸浮物。
用于商業(yè)用途的5升生物反應器中體細胞胚的生產(chǎn)從上述接種物中，用25g的細胞來接種采用MS2培養(yǎng)基的5升攪拌釜生物反應器。在500rpm下操作攪拌器，從而去除了任何剩余的非胚發(fā)生的細胞。這一步驟導致高度同步的生長。在運轉(zhuǎn)結(jié)束時，93％的胚胎為魚雷胚，其密度約為每升中有1百萬個胚胎。
包封的體細胞胚的生產(chǎn)將高粱粉(10g)與水(100ml)混合，并將pH調(diào)節(jié)到5.8。使該混合物沸騰，同時連續(xù)地攪拌以形成粘稠的糊狀物(當以一滴放入水中時，它立即固化)。在該階段中，在15psi、121℃下對糊狀物高壓滅菌20分鐘。將糊狀物冷卻到40℃。對于包封而言，從3周后的成熟培養(yǎng)基中挑選出成熟的胚胎，然后將胚胎逐個地滴入糊狀物中。使用移液管將包括包封胚胎的糊狀物的圓形膠囊滴入冷水中。在該階段中，可以將膠囊浸入殺真菌劑和殺細菌劑中。然后干燥所述的膠囊。
向MS2中加入濃度為3.0％(w/v)的海藻酸鈉(Sigma)。在調(diào)節(jié)pH至5.8之后，對培養(yǎng)基高壓滅菌。首先將面粉包封的胚胎逐個地浸入無菌的海藻酸鈉溶液中，然后將其滴入位于放置在磁力攪拌器之上的燒杯中的75mM氯化鈣溶液中。通過潷去氯化鈣溶液并用MS液體培養(yǎng)基洗滌來回收每個含有單個體細胞胚的得到的珠子。
胚胎發(fā)芽以生成小植物在MS(固體或液體)培養(yǎng)基中發(fā)芽之后，將幼苗轉(zhuǎn)移到珍珠石(perlite)、然后轉(zhuǎn)移到Levington混合肥料(compost)(3周后)上，并且在15-32℃、87％的相對濕度下在溫室中進行培養(yǎng)。在汞汽燈下維持較長的白天的條件(16小時光照)。3周后，將小植物轉(zhuǎn)移到混合肥料上。
成活力測試使用熒光素二乙酸酯(FDA)測試(Widholm，1972)來評價培養(yǎng)物中細胞和胚胎的成活力。在使用前，在水中將FDA的丙酮溶液(5mg/ml)稀釋至最終濃度為0.01％。將等體積的該溶液與細胞懸浮物混合，并且在室溫下至少保留3分鐘。用移液管吸取一滴混合物到顯微鏡的玻璃載玻片上，用玻璃蓋玻片覆蓋，并在Olympus BH2 U.V.顯微鏡下觀察，所述的顯微鏡裝配有BH-RFL-W型反射光熒光附件、100瓦的汞汽燈、EY.455激發(fā)濾片(exciter filter)、B(DM.500+0.515)二色鏡以及530nm的阻擋濾片。幾分鐘后使熒光顯影，在10隨機視野中計量出發(fā)黃綠色熒光的細胞(有成活力的)的數(shù)目以及包括不發(fā)熒光的細胞(沒有成活力的)在內(nèi)的細胞的總數(shù)。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員應當領(lǐng)會的是本發(fā)明提供了一種在時間和勞力方面均高效的、但也很可靠的適合于大規(guī)模生產(chǎn)甘蔗成熟胚胎的方法。有利的是該方法適合于在生物反應器中進行生產(chǎn)，其中所述的方法可以完全實現(xiàn)自動化。
應當了解的是本發(fā)明的范圍不應局限于上述實施例，因為那些實施例僅僅是通過舉例的方式用于說明的。
權(quán)利要求
1.一種包括從甘蔗的外植體生產(chǎn)甘蔗的體細胞胚的方法，其特征在于包括下列步驟(1)從外植體培養(yǎng)出未成熟的胚胎(2)從那些未成熟的胚胎中培養(yǎng)出成熟的甘蔗的體細胞胚。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于至少步驟(2)是在液體懸浮培養(yǎng)中發(fā)生的。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法，其特征在于步驟(1)中胚發(fā)生組織的生長以及接下來在步驟(2)中所述胚胎發(fā)育至成熟都是在液體培養(yǎng)基中發(fā)生的。
4.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3之任一的方法，其特征在于所述的甘蔗植物是從甘蔗植物特有的組織化的分生組織或分生組織細胞得到的。
5.一種根據(jù)權(quán)利要求1至4之任一的方法，其特征在于所述的外植體材料包括根衍生的或者成熟的胚胎。
6.一種根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其特征在于所述的外植體材料包括通過應激甘蔗植物材料得到的成熟的胚胎。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其特征在于應激是通過冷卻所述的植物材料來實現(xiàn)的。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于將所述的植物材料冷卻到5-15℃下1-3個月。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求6至8之任一的方法，其特征在于應激是通過用醇處理來實現(xiàn)的。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求1至9之任一的方法，其特征在于從外植體培養(yǎng)未成熟胚胎的方法(步驟1)包括下列步驟a)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)外植體材料以生成體細胞b)選擇并且繁殖來源于所述外植體材料的體細胞c)在培養(yǎng)基上培養(yǎng)所述的體細胞一段時間，以便從所述的體細胞中誘導出未成熟的甘蔗的胚胎。
11.一種根據(jù)權(quán)利要求1至10之任一的方法，其特征在于所述的未成熟的胚胎是在固體培養(yǎng)基上以胚發(fā)生的愈傷組織來引發(fā)和維持的、或者是在液體培養(yǎng)基中或在固體和液體培養(yǎng)基結(jié)合的培養(yǎng)基中以胚發(fā)生細胞的懸浮培養(yǎng)物來引發(fā)和維持的。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求1至11之任一的方法，其特征在于在所述的培養(yǎng)基配方中或者單獨或者以組合的方式包括植物生長調(diào)節(jié)劑，諸如生長素、細胞激動素、赤霉素、脫落酸、抗生長素、細胞分裂素、玉米素和/或活性炭。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求1至12之任一的方法，其特征在于所述的方法是在含有以蔗糖作為主要的糖的組分的培養(yǎng)基中進行的。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其特征在于所用蔗糖的濃度在10-60g/l的范圍內(nèi)。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求1至14之任一的方法，其特征在于外植體材料來源于具有用蠟覆蓋了暴露的切口端的甘蔗植物組織。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求1至15之任一的方法，其特征在于基本上僅僅選擇體細胞是通過采用至少下列方法之一來實現(xiàn)的篩分培養(yǎng)物材料、熱處理或者攪拌。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中使用網(wǎng)眼尺寸為100-50μm的第一個篩子，接下來使用網(wǎng)眼尺寸為50-38μm的第二個篩子。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求1至17之任一的方法，其特征在于在所述未成熟胚胎的生產(chǎn)過程中使用光照和黑暗的循環(huán)。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求1至3以及權(quán)利要求8至18之任一的方法，其特征在于所述未成熟胚胎的培養(yǎng)涉及使用用于傳代培養(yǎng)的新鮮培養(yǎng)基從原始培養(yǎng)物生長傳代培養(yǎng)物。
20.一種根據(jù)權(quán)利要求1至19之任一的方法，其特征在于外植體的原始培養(yǎng)涉及在固體培養(yǎng)基上從外植體引發(fā)胚發(fā)生的愈傷組織、接下來在液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)來自所述外植體的胚發(fā)生的愈傷組織，以便建立和維持胚發(fā)生細胞的懸浮培養(yǎng)物。
21.一種根據(jù)權(quán)利要求1至20之任一的方法，其特征在于在使用葉外植體衍生的培養(yǎng)物的情況下，作為愈傷組織引發(fā)的固體培養(yǎng)基和液體胚發(fā)生懸浮培養(yǎng)基的一個組分而包括了抗壞血酸。
22.一種根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于由愈傷組織引發(fā)懸浮培養(yǎng)物包括大約50mg/l-200mg/l的抗壞血酸。
23.一種根據(jù)權(quán)利要求21或22的方法，其特征在于由愈傷組織引發(fā)懸浮培養(yǎng)物包括了抗壞血酸和檸檬酸。
24.一種根據(jù)權(quán)利要求1至23之任一的方法，其特征在于在液體培養(yǎng)基中包括了脫落酸。
25.一種根據(jù)權(quán)利要求1至24之任一的方法，其特征在于由未成熟的胚胎培養(yǎng)出甘蔗成熟的體細胞胚包括下列步驟(1)由外植體制備未成熟胚胎的液體懸浮培養(yǎng)物；(2)在生物反應器中培養(yǎng)所述的懸浮物以形成體細胞胚。
26.一種根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征在于步驟(1)以及步驟(2)的培養(yǎng)發(fā)生在生物反應器中。
27.一種根據(jù)任何前述權(quán)利要求的方法，其特征在于在發(fā)芽之前將生成的成熟的胚胎包封起來。
28.一種根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其特征在于包封劑包括谷物面粉/水性糊狀物。
29.一種根據(jù)權(quán)利要求28的方法，其特征在于所述的面粉為高粱粉。
30.一種根據(jù)權(quán)利要求1至29之任一的方法，其特征在于步驟(2)中所用的根衍生的培養(yǎng)物產(chǎn)生了膠質(zhì)狀的物質(zhì)，所述膠質(zhì)狀物質(zhì)的生產(chǎn)是在無菌條件下通過將根浸入溫度約為35℃的水中來誘導的。
31.一種根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其特征在于對步驟(2)而言，隨后將根衍生的未成熟胚胎轉(zhuǎn)移到基本上不含生長素2，4-D的液體培養(yǎng)基中。
32.一種根據(jù)權(quán)利要求1至31之任一的方法，其特征在于對步驟(2)而言，將葉和枝條衍生的懸浮培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到不含生長素2，4-D的培養(yǎng)基中，而在所述的培養(yǎng)基中包括活性炭或其它的抗氧化劑。
33.一種根據(jù)權(quán)利要求27的方法，其特征在于包封包括下列步驟(1)形成面粉/水的混合物(2)向所述的糊狀物中加入體細胞胚(3)將包封在糊狀物中的單個的胚胎放入水中，以便形成包圍著所述胚胎的膠囊(4)干燥所述的膠囊。
34.一種根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其特征在于在干燥(步驟(4))之前，將所述的膠囊浸入諸如殺真菌劑和/或殺細菌劑這樣的殺微生物劑中。
35.一種根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其特征在于在干燥(步驟(4))之前，對所述胚胎的包封進一步包括下列步驟a)向所述膠囊中加入海藻酸鈉溶液b)隨后將所述的膠囊放入氯化鈣溶液中。
36.一種根據(jù)權(quán)利要求1至35之任一的方法，其特征在于甘蔗的小植物是通過胚胎發(fā)芽而使體細胞胚成熟至植物的幼苗來生產(chǎn)的，由此在聚乙烯泡沫上攜帶的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)單個的體細胞胚。
37.一種根據(jù)權(quán)利要求36的方法，其特征在于所述的體細胞胚處于晚魚雷期并且是在不含生長素2，4-D的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，該液體培養(yǎng)基包括脫落酸(ABA)。
38.甘蔗的體細胞胚，所述的體細胞胚是由包括下列步驟的方法生產(chǎn)的(1)從外植體培養(yǎng)出未成熟的胚胎(2)從那些未成熟的胚胎中培養(yǎng)出成熟的甘蔗的體細胞胚。
39.甘蔗植物，所述的植物是由包括下列步驟的方法生產(chǎn)的(1)從外植體培養(yǎng)出未成熟的胚胎(2)從那些未成熟的胚胎中培養(yǎng)出成熟的甘蔗的體細胞胚(3)使那些體細胞胚發(fā)芽以形成至少一株甘蔗植物。
40.根據(jù)權(quán)利要求39的甘蔗植物，其特征在于所述的方法包括在步驟(3)之前一個額外的將步驟(2)中產(chǎn)生的成熟的體細胞胚包封在包封劑中的步驟。
41.當應用到來源于除甘蔗以外的植物來源的植物材料時，權(quán)利要求1至37之任一的方法，所述的植物來源尤其是樹木、棗椰樹和馬鈴薯。
全文摘要
使用可以來源于葉、枝條、根和植物的其它部分的外植體材料來繁殖植物、尤其是甘蔗植物。通過從外植體材料培養(yǎng)出未成熟的胚胎、然后從未成熟的胚胎培養(yǎng)出成熟的體細胞胚來生產(chǎn)體細胞胚,所有這些均是在液體懸浮培養(yǎng)中實現(xiàn)的,從而可以使甘蔗進行顯微繁殖且培養(yǎng)物在任何階段都不會褐變。然后可以將成熟的胚包封起來以生成用于發(fā)芽目的的人造種子。
文檔編號A01H5/04GK1252685SQ9880434
公開日2000年5月10日 申請日期1998年2月20日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月21日
發(fā)明者萊拉·扎卡里亞·阿布德拉曼 申請人:萊拉·扎卡里亞·阿布德拉曼