專利名稱：一種改良肽,免疫原性組合物和疫苗或醫(yī)用制劑,一種針對激素lhrh免疫動物的方法 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種肽，它適于生產(chǎn)有效針對黃體生成激素釋放激素(LHRH，也稱為促性腺激素釋放激素，GnRH)的疫苗。本發(fā)明還涉及以此肽為基礎(chǔ)的免疫原性組合物和疫苗或藥用制劑(疫苗和藥物)以及使用此種疫苗或藥用制劑針對LHRH免疫哺乳動物并因此影響其生殖或行為特征，增進豬肉質(zhì)量的方法。
LHRH是來自下丘腦的具有10個氨基酸長度的小肽(十肽)。LHRH的氨基酸序列(氨基酸氨基端在左，羧基端在右)以三字母代碼表示為pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2，以單字母代碼表示為#EHWSYGLRPG@；#E為焦谷氨酸，G@為甘氨酰胺。
LHRH作用于垂體，引起生物學活性FSH(促卵泡激素)和LH(黃體生成激素)更多地釋放，進入血液，刺激生長中的雄性動物精巢發(fā)育及精巢類固醇合成。對于生長中的雌性動物，上述激素則刺激卵巢發(fā)育和其中的卵泡發(fā)育，卵巢類固醇合成及排卵。
已知偶聯(lián)了載體蛋白的LHRH可以作為疫苗為動物接種。此種疫苗的不同用途均與LHRH的天然功能有關(guān)。已知血液中LH和FSH的大量減少會抑制精巢類固醇，雄激素，精子，以及卵巢類固醇、孕激素、雌激素、卵泡的形成或成熟。血液中雄激素、孕激素、雌激素可以通過針對LHRH有效免疫動物而達到與去除動物精巢或卵巢相當?shù)妮^低水平。這樣，大多數(shù)時候動物精巢發(fā)育遲緩或停止(無雄激素生成、無精子形成)，雌性動物卵巢變小(無雌激素、孕激素等雌性類固醇激素合成，卵泡成熟及排卵受阻)。
獸醫(yī)藥中，針對LHRH的100％有效的免疫法可替代閹割、卵巢切除等徹底手術(shù)對雌、雄性小型家養(yǎng)動物諸如貓、狗等作絕育，或者控制雄性狗、牛等的功擊行為。針對LHRH的免疫法的其它用途還包括抑制雌性動物熱量消耗，減少雄性動物焦燥不安，以利于育肥屠宰。人類健康理療方面，針對LHRH的免疫可用于前列腺癌和乳腺癌治療，甚至可治療一些類型的垂體癌。
針對LHRH的疫苗的另一用途在于家畜育種方面，尤其是用于屠宰的豬的育肥。雄性、性成熟的豬肉(公豬)有典型的所謂公豬膻味。這種豬在其精巢中形成C19-Δ16類固醇并貯于脂肪組織中(帕特森，《科學食品農(nóng)業(yè)雜志)》19，31-38(1968)；布魯克斯·安·柏森，《動物科學雜志》62，632-645(1986)；克勞茲，Zeitschrift.Tierzuchtg.Zuchtungsbiol.93，38-47(1976)；克勞茲，《內(nèi)分泌年鑒》(哥本哈根)91，增補本，225，432-433，(1979))。當豬肉加熱時，這些類固醇會散發(fā)出難聞的尿樣氣味(福齊斯，《瑞典農(nóng)業(yè)研究雜志)》1，233-237(1971)；勃尼，《生畜生產(chǎn)科學》9，687-705(1982))。由于氣味難聞，性成熟的公豬肉不適于消費及出口。約有10％的雄豬在屠宰時已經(jīng)性成熟，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。
為了控制和消除這種損失，幾乎所有雄豬在幼齡階段均閹割處理，一般在無任何麻醉劑情況下進行。閹割既對動物不友善，又會導(dǎo)致感染、生長抑制，最終肉質(zhì)劣于完整的未閹割雄豬(只要完整的雄豬還未出現(xiàn)公豬膻味)(沃斯特拉，《生畜生產(chǎn)科學》1，187-96(1974))。
一種較為友善又增加豬肉質(zhì)量的替代辦法是，通過針對LHRH的免疫減少幼豬垂體中LHRH的濃度。LHRH水平的減少導(dǎo)致生物活性FSH及LH濃度的減少，從而抑制精巢發(fā)育及精巢類固醇包括C19-Δ16類固醇的合成。閹割變得沒有必要，感染和生長抑制得到消除，最終的肉質(zhì)不比閹割后的差。這種方法消除了屠宰前公豬膻味的發(fā)生。
然而，作為消除公豬膻味的好疫苗有其嚴格要求，即延遲精巢發(fā)育，使得在屠宰前不會發(fā)生公豬膻味。已知的疫苗制劑不符合這一要求。
有關(guān)針對LHRH的疫苗的抗生育性質(zhì)，現(xiàn)有技術(shù)文獻及以往專利申請中疫苗接種的結(jié)果經(jīng)常不一；如一些動物幾乎沒有反應(yīng)?；蛘咝枰^大劑量的疫苗佐劑(這在商業(yè)上不能接受)才有期望的效果(Chaffaux等，Recueil de Medicine Veterinaire，16卷(2)，133-145頁(1985)；加拉蒂等，C.R.Acad.Sc.Paris，303，集III，16期，673-676(1986)；法爾沃等，《動物科學雜志》，63卷，986-994頁(1986年)；戈寶等，家養(yǎng)動物內(nèi)分泌科學》，6卷，339-347頁(1989年a)；戈寶等，《獸醫(yī)學》，32卷，557-567頁(1989年b)；霍斯金森等，《動物科學》，72卷，14-20頁(1994年)；美國專利4,608,251；國際專利申請WO 88/05308)。根據(jù)文獻資料，使用針對LHRH的免疫接種阻斷免疫過的豬早期階段精巢發(fā)育而完全解決公豬膻味問題是不可能的。成功率僅在20-80％間。這是不夠的，使得現(xiàn)有LHRH疫苗不能用于農(nóng)業(yè)實踐中。
制備這種疫苗的難點可能在于“耐受性”現(xiàn)象的存在。免疫系統(tǒng)不能識別而是耐受象激素這樣的“自身”物質(zhì)，通常沒有抗體產(chǎn)生，一個好的疫苗要求既與激素相似又有充分的“外源性”以誘發(fā)抗體的產(chǎn)生。這兩個要求互相抵觸，直到現(xiàn)在也沒有確定是否能夠制備出這種物質(zhì)。一種生產(chǎn)類似LHRH肽疫苗的嘗試是將LHRH十肽的第6位的Gly替換成右旋氨基酸(D-Tryp；Chaffaux等，Recueil deMedicine Veterinaire 161卷，(2)，133-145，1985)。然而，含有此種修飾的LHRH肽的疫苗制備物效果比LHRH正常十肽更差(EPO 464 124)。
然而是最近我們發(fā)現(xiàn)，在針對LHRH免疫的動物中引發(fā)有效抗體反應(yīng)是可能的(梅隆等，《疫苗》，12卷，741-746頁，(1994年))。實驗中用一種LHRH疫苗給豬接種兩次，該疫苗不同于典型的LHRH疫苗(LHRH偶連載體蛋白，使用弗氏佐劑)，它是串聯(lián)LHRH疫苗(歐洲專利號046124)。根據(jù)此串聯(lián)LHRH疫苗的發(fā)明，優(yōu)選的肽是至少包括2個串聯(lián)LHRH序列，通式為(N端氨基酸在左，C端氨基酸在右)Z1-Glx-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-X-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-ProJn-Gly-Z2，其中氨基酸以三字母代碼表示，Trp1和Trp2為色氨酸(Trp)或甲基化色氨酸(N(吲哚)-甲基-色氨酸)，n至少為1，X為氨基酸Gly和Gln之間的一個直接鍵合或一個間隔基，Z1-Glx要么是pGlu(焦谷氨酸)要么是連有包括一個或多個額外氨基酸的尾部的Gln，Gly-Z2要么是Gly-NH2要么是連有包括一個或多個氨基酸的尾部的Gly。通式中，X可能是甘氨酸與谷氨酸胺間的一個直接鍵合，即這些氨基酸不經(jīng)中間連鍵而直接相連(通過一般肽鍵)。此串聯(lián)LHRH疫苗發(fā)明還包括這樣的肽，其中LHRH序列通過間隔基相互連接。間隔基的性質(zhì)可以是一個或多個氨基酸，或者一個較短或較長的碳氫鏈以及其它化合物基團或分子。在上述通式中，Z1-Glx優(yōu)選代表pGlu(焦谷氨酸)，但也可代表連接有包括一個或多個額外氨基酸的尾部的Gln，例如用于將肽偶聯(lián)到載體蛋白。上述通式中，Gly-Z2代表例如Gly-NH2或代表連接有包括一個或多個額外氨基酸的尾部的Gly，例如用于將肽偶聯(lián)到載體蛋白。Gly-Z2優(yōu)選代表Gly-Cys-NH2，加入C末端的半胱氨酸可將肽偶聯(lián)到載體蛋白。
更具體地說，此串聯(lián)LHRH疫苗發(fā)明提供了一種肽，其特征在于包括至少2個LHRH序列串聯(lián)，通式為(N端氨基酸在左，C端氨基酸在右)pGlu-His-Trp1-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro[-Gly-Gln-His-Trp2-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro]n-Gly-Cys-NH2，其中氨基酸以三字母代碼表示，Trp1和Trp2是色氨酸或N-甲基-色氨酸，n是至少為1的數(shù)字。
這個串聯(lián)LHRH疫苗似乎完全阻斷精巢發(fā)育及精巢中產(chǎn)類固醇細胞(間質(zhì)細胞)的發(fā)育。但此疫苗有許多不利的方面不適于實際應(yīng)用。一個不利的方面是，要使免疫閹割成功，需用高劑量接種以引發(fā)所需反應(yīng)，每頭豬至少1mg，在養(yǎng)豬業(yè)中大規(guī)模使用這種疫苗無疑十分昂貴。
該疫苗另一重要的不利是該疫苗只有在與完全弗氏佐劑合用時才會高效，而且使用這種強刺激的佐劑會引發(fā)許多不希望的副作用，如由其粘稠的性質(zhì)引起的疫苗制備和使用中的困難，而且其本身應(yīng)用也會使動物很痛苦，佐劑殘余物及佐劑引發(fā)的接種部位慢性炎癥反應(yīng)如化膿等可能降低豬肉品質(zhì)。
然而，本發(fā)明解決了以上所述由使用針對LHRH的串聯(lián)LHRH肽疫苗引起的不利副反應(yīng)，而且又不會喪失其有利的方面。
已表明，串聯(lián)LHRH疫苗的單體形式結(jié)合弗氏完全佐劑但無載體蛋白KLH，對阻斷精巢生長和公豬膻味充分有效，并且串聯(lián)LHRH疫苗的二聚體形式與較溫和的弗氏不完全佐劑結(jié)合，可以產(chǎn)生相當高的效果。令人驚奇的是，將串聯(lián)原則應(yīng)用到LHRH分子的變體，即該十肽的第6位甘氨酸被右旋氨基酸D-Lys取代，然后將得到的肽偶聯(lián)到普通載體化合物(這里用卵清蛋白)，并與幾種溫和佐劑如Specol、雙油乳化劑等配合使用，可以得到非常有效疫苗，即使低劑量也有效。因此盡管單一LHRH十肽中第6位甘氨酸被取代為D-氨基酸會降低原來的LHRH序列的免疫原性，然而此種取代應(yīng)用于串聯(lián)LHRH疫苗卻能產(chǎn)生更高的免疫原性LHRH疫苗制備物。用其它右旋氨基酸取代串聯(lián)單位中一個或每個LHRH十肽第6位甘氨酸預(yù)期也會增加疫苗效果。另外，例如使用右旋賴氨酸作為取代氨基酸時，可以使串聯(lián)肽既可以二聚或多聚，又不失去將肽組合物結(jié)合到載體化合物的可能性。盡管C端半胱氨酸可通過二硫鍵的形成而用于二聚化，因而不能再用來偶聯(lián)載體化合物，但取代氨基酸的側(cè)鏈仍可用來偶聯(lián)載體化合物。當然，用含有合適側(cè)鏈的其它氨基酸作為取代物(如右旋谷氨酸，其它帶合適側(cè)鏈的可能的取代氨基酸是普通技術(shù)人員公知的)也能將肽偶聯(lián)到載體化合物。-LHRH已被描述為一種超活性LHRH興奮劑(西柏羅迪等，《藥物化學雜志》，21卷，276-280頁(1978年)并用于LHRH放射免疫分析(赫伯·安·歐德爾，《實驗生物藥學進展》，158卷，643-646頁(1978年))中，作為LHRH受體研究的熒光配體使用(科恩等，《生物化學雜志》，256卷，1098-1100頁(1981)；勞爾等，《生物化學雜志》，256卷，3049-3052頁(1981年)；齊爾茲等，《肽》，4卷，549-555頁(1983年))，并偶聯(lián)到細胞毒性基團以阻止癌生長(斯諾克，《肽》，15卷，359-366頁(1994)。[D-Lys6]-LHRH以前未作LHRH疫苗使用過。
本發(fā)明涉及由至少兩個串聯(lián)形式的LHRH序列組成的肽或肽組合物，其中最初的LHRH十肽序列的第6位甘氨酸已被右旋氨基酸所取代。第6位Gly可被一功能氨基酸取代，這個右旋氨基酸還含有一側(cè)鏈，通過該側(cè)鏈可將LHRH串聯(lián)單位偶聯(lián)到載體化合物。根據(jù)所用的肽合成技術(shù)，此肽有或沒有C端酰胺化。另外此肽可以二聚化或多聚化，其中至少一個原始LHRH十肽在第6位含有功能性的氨基酸取代。
本發(fā)明的肽或肽組合物含有可以如下列通式所示的連續(xù)序列16 16 21#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC其中*號表示Gly可能被一個右旋氨基酸所取代，該右旋氨基酸還含有可將LHRH串聯(lián)單位偶聯(lián)到載體化合物的側(cè)鏈。
本發(fā)明的第一個特征是，此肽或肽組合物中的一個或多個氨基酸可以被取代，例如串聯(lián)重復(fù)單位中每個LHRH十肽的第6位氨基酸即甘氨酸(上述通式中的第6位和/或第16位)被右旋氨基酸取代，從而產(chǎn)生與正常LHRH序列有足夠的差異而被免疫系統(tǒng)識別的肽，而不失去免疫原性。
本發(fā)明的第二個特征是，各個串聯(lián)單位二聚化以加強其免疫原性，并且不失去將肽或肽組合物偶聯(lián)到載體化合物的可能性，在這種肽或肽組合物中，串聯(lián)單位的二聚化可發(fā)生于羧基末端或氨基末端，如通過二硫橋或硫醚鍵而將兩個串聯(lián)單位二聚化。為達到這個目的可使用第21位半胱氨酸，或半胱氨酸可在第1位谷氨酸之前合成。現(xiàn)有技術(shù)中的其它將LHRH串聯(lián)單位二聚化或多聚化的方法也可使用。為了防止二聚化或多聚化導(dǎo)致可綴合載體化合物的結(jié)合位點的丟失，需將替換第6位和/或第16位甘氨酸的右旋氨基酸的選擇限制為有合適的側(cè)鏈的氨基酸，這種替換氨基酸可以例如是右旋賴氨酸、右旋谷氨酸或其它含有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸。
更具體地，本發(fā)明的一個優(yōu)選肽D-Lys6-串聯(lián)LHRH二聚體通式如下16 16 21#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC*＝D-Lys|#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC222737 42本發(fā)明另一個優(yōu)選肽D-Glu6-串聯(lián)LHRH二聚體通式如下1 6 16 21#EHWSY*LRPGQHWSYGLRPGC*＝D-Glu|#EHWSY*LRPGQHWSYGLRPGC222737 42但其它在第6位和/或第16位和/或(如在上兩個二聚體形式例子中)在第27位和/或第37位有右旋氨基酸取代的單聚、二聚或多聚LHRH串聯(lián)單位的肽和肽組合物也是本發(fā)明的一部分。
本發(fā)明還提供一種組合物，其特征在于含有已被變?yōu)槊庖咴孕问降碾?。如熟練技術(shù)人員熟知的，有許多不同方法將本身無免疫原性的物質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)槊庖咴孕问健１景l(fā)明中首先的可能做法是將本發(fā)明的肽偶聯(lián)到合適的載體蛋白。串聯(lián)肽中的N端或C端半胱氨酸可用于化學偶聯(lián)。串聯(lián)二聚體肽中，用在第6位和/或16位和/或27位和/或37位取代甘氨酸的D-賴氨酸，D-谷氨酰胺或其它修飾氨基酸的普通或修飾側(cè)鏈作偶聯(lián)。本領(lǐng)域熟練人員十分清楚何種偶聯(lián)方法，何種載體蛋白比較合適。本發(fā)明的一個優(yōu)選組合物的特征在于包括一種蛋白如卵清蛋白和本發(fā)明的肽或肽組合物的免疫綴合物。當然本發(fā)明的疫苗制備物可以與至少一種免疫佐劑聯(lián)合應(yīng)用。本領(lǐng)域熟練人員熟知合適的免疫佐劑。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的佐劑可以是Specol或雙油乳液，但其它沒有或有較小副作用的佐劑也能使用。本發(fā)明可用于針對LHRH免疫不同脊椎動物但尤其是哺乳動物的方法中，針對LHRH免疫可以例如用于給小型家養(yǎng)動物如雄性、雌性貓、狗等絕育，或治療雄性狗、牛的攻擊行為。其它用本發(fā)明針對LHRH免疫的可想象的原因還包括阻止狗、貓、牛等雌性動物的熱量散失，治療雄性動物的焦燥不安，以利育肥屠宰。對人類健康理療，針對LHRH的免疫可用于前列腺癌、乳房癌、垂體癌的治療。
一個優(yōu)選的實施方案是增加豬肉質(zhì)量的方法，其中用本發(fā)明的疫苗制劑給豬接種。本發(fā)明在下述實驗部分中說明。
實施例成功的公豬接種的定義是屠宰時精巢重量應(yīng)小于150克，接受疫苗的治療組所有動物精巢均應(yīng)明顯可見減小。精巢重量與睪丸甾酮及公豬膻味的產(chǎn)生直接相關(guān)。精巢重量小于60克時精巢在組織學上完全沒有活性(梅隆等，《疫苗)》，12卷，741-746頁(1994))，血清中檢測不到睪丸甾酮。我們已描述了精巢大小、特別是重量與背部脂肪雄激素水平的精確相關(guān)關(guān)系(翁克等，《家畜生產(chǎn)科學》，42卷，63-71(1995)。免疫動物精巢小于150克是無公豬膻味的清楚指標。背部脂肪中雄激素通常濃度很低，不易檢測，如存在也總低于0.5μg/g脂肪。文獻中將這個值稱為可檢測公豬膻味的安全低限，而也有報道說每克背部脂肪中1μg睪丸甾酮足夠低。我們將最低值作為低限，低于此值我們就認為豬已成功地免疫閹割。這個關(guān)系建立在對100多頭豬的測定之上。本實驗對照動物精巢重量介于200至350克之間。免疫閹割的豬飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉/脂肪比率相對于幼年手術(shù)閹割的公豬均有提高。
方法肽合成在ABI 430A肽合成儀上進行，以0.25mM規(guī)模、約60分鐘的循環(huán)時間作FastMoc循環(huán)(菲爾茲CG，羅伊德DH，麥克唐納RL，奧迪森KM，自動化Fmoc固相肽合成中惰性RL HBTU活化”，《肽研究》，4卷，95-101頁，(1991年)；用戶手冊#32，應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(1990))。
肽的純化純化用Waters PrepLC4000系統(tǒng)進行，裝備有WatersPrepPak柱(25毫米×100毫米)，填充Delta-Pak C18(15nm，100A)材料和保護柱。
我們使用兩個Waters型號510泵，一個Waters型號680梯度控制儀，一個Waters型號WISP 712自動進樣機和一個Waters型號991光二極管陣檢測儀進行分析高效液相層析。以從含0.1％TFA的水到60％乙腈在含0.1％TFA的水中的線性梯度，在Waters Delta PakC18-100A(3.9×150mm，5μm)柱上，在250nm以1毫升/分對產(chǎn)物作分析。所有產(chǎn)物由峰表面顯示為純度95％。
氨基酸分析采用Waters PicoTag系統(tǒng)進行，結(jié)果與根據(jù)氨基酸序列所作的估計值一致。
二聚化程序?qū)a(chǎn)物溶于20％二甲基亞砜水溶液中。pH值應(yīng)用1％或2％NH4HCO3調(diào)到5-6，溶液應(yīng)澄清。pH過高則用1-10％乙酸矯正。在室溫至少攪拌5小時。產(chǎn)物直接用高效液相色譜純化。
D-Lys6-串聯(lián)二聚體與卵清蛋白的綴合(使用的重量當量在milliQ-水中使用10mgECDI偶聯(lián)1mg卵清蛋白和1mg D-Lys6-串聯(lián)二聚體)。首先將肽與卵清蛋白溶于milliQ-水中(A＝肽溶液；B＝卵清蛋白溶液)，將A、B充分混合，接著將基于重量當量10倍過量的碳二亞胺(ECDI)溶于milliQ-水中(C＝ECDI溶液)。然后連續(xù)攪拌下將C緩慢加入A+B溶液中，6小時后，對水透析(截流分子量10,000)產(chǎn)物。
荷載測定荷載量通過計算綴合物以及單獨的肽與載體蛋白的比較氨基酸分析得到。從氨基酸分析得知綴合物中每毫克卵清蛋白約含0.5mg肽。
疫苗制備物疫苗由肽與佐劑混合制得(細節(jié)見Specol)受試佐劑為弗氏完全佐劑(CFA)，弗氏不完全佐劑(IFA)，Specol油和雙油乳液(d.o.e)。
-CFA或IFA按1∶1與肽溶液混合，得到穩(wěn)定的乳液。
-雙油乳液(W/O/W)10份第一水相溶于PBS(磷酸鹽緩沖液)的抗原11份油相含10％一油酸二縮甘露酯(“Arlacel”)的Marcol52(Esso)。
10份第二水相含2％Montanox 80(＝Tween80)的PBS
-Specol(特殊油相)是適于產(chǎn)生用于研究的油包水乳液的產(chǎn)品。組成每10ml含0.453g Tween 85(ICI)，0.532g Span 85(ICI)，9ml Marcol52(Esso Belgium)。
在Specol中的乳液的制備將4份含抗原的水相與5份Specol(體積比)混合，將水相慢慢加入油相(Specol)，同時用ultraturrax劇烈(振蕩器混合太溫和)。盡可能防止空氣進入。使用干凈的無清潔劑的玻璃器皿。貯存Specol優(yōu)選貯于4-8℃。(參考B.A.博克豪特等，《獸醫(yī)免疫學與免疫病理學)》，2卷，491-500(1981)；W.霍爾等，《獸醫(yī)免疫學與免疫病理學》22卷，175-186(1989)；W.J.A.博爾斯瑪?shù)?，《免疫學研究》，143卷，503-511(1992))。
接種程序?qū)⑸鲜鲋苽涞?mg肽(由負荷量計算)或較低量溶于1ml磷酸鹽緩沖液(PBS)并用指示的佐劑乳化，用于一只動物的一次接種。實驗開始時，雄豬一般在10周齡左右接受第一次接種，8周后用同樣組合物加強免疫。
評價豬的精巢大小在外部用卡尺測量。從首次接種約12周后豬的精巢不再增大(甚至變小)，LHRH濃度降低。取血清作抗LHRH效價及睪丸甾酮測定。通過系列稀釋度的豬抗血清與125LHRH的結(jié)合測定抗GnRH的抗體。動物在首次接種后16周宰殺，精巢取出稱重，取背部脂肪樣品用ELISA法(Ridascreen)測定類固醇雄激素。進一步鑒定肉質(zhì)。
實驗1在這些實驗中檢測了非綴合形式的不同肽構(gòu)建物。每種肽在10周齡和18周齡兩次接種，每次接種量為1mg，使用IFA作為佐劑，受檢的構(gòu)建物是羧基端二聚化LHRH單體，羧基端二聚化的LHRH串聯(lián)體，氨基端二聚化的LHRH串聯(lián)體，羧基端二聚化的[D-Nal(2)6]-LHRH(NafarelinR)單體，羧基端二聚化的[D-Nal(2)6]-LHRH(Nafarelin)單體，羧基端二聚化的[D-Nal(2)6]-LHRH(Nafarelin)串聯(lián)體，羧基端二聚化的[D-Lys6]-LHRH單體和羧基端二聚化的[D-Lys6]-LHRH串聯(lián)體。
1)C-單體LHRH二聚體的肽分子式1 11pEHWSYGLRPGC|pEHWSYGLRPGC12 222)C-串聯(lián)LHRH二聚體的肽分子式1 21pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC|pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC22 423)N-串聯(lián)LHRH二聚體的肽分子式1 21CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@|CQHWSYGLRPGQHWSYGLRPG@22 424)[D-Nal(2)6]-單體LHRH二聚體的肽分子式1611pEHWSY*LRPGC*＝[3-(2-萘)-D-丙氨酸]|pEHWSY*LRPGC1217 22
5)[D-Nal(2)6]-串聯(lián)LHRH二聚體的肽分子式16 16 21pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC *＝[3-(2-萘)-D-丙氨酸]|pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC222737 426)[D-Lys6]-單體LHRH二聚體的肽分子式1611pEHWSY*LRPGC*＝[D-賴氨酸]|pEHWSY*LRPGC1217 225)[D-Lys6]-串聯(lián)LHRH二聚體的肽分子式16 16 21pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC *＝[D-賴氨酸]|pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC222737 42抗原精巢重量＜150克 精巢重量的豬數(shù)/組豬數(shù) (平均值±s.d.)1)C-單體LHRH二聚體0/7 294±442)C-串聯(lián)LHRH二聚體5/7 92±1053)N-串聯(lián)LHRH二聚體6/7 88±573)N-串聯(lián)LHRH二聚體6/8 72±894)[D-Nal(2)6]-單體LHRH二聚體 2/7 177±695)[D-Nal(2)6]-串聯(lián)LHRH二聚體 0/7 248±566)[D-Lys6]-單體LHRH二聚體2/7 190±447)[D-Lys6]-串聯(lián)LHRH二聚體5/7 103±102第2、3、7組中70-80％的動物免疫閹割成功，在這些應(yīng)答者中精巢重量最高為86克，而沒有應(yīng)答的動物精巢重為193克或更高。從這些結(jié)果看起來在配方中用弗氏不完全佐劑代替完全弗氏佐劑與未綴合的肽一起使用會降低效果。另外，第一，其特別示出串聯(lián)原則對疫苗活性是必要的，第二，在羧基端或氨基端均可二聚化，第三，并非每一種氨基酸取代都是允許的，如用Nafarelin-類似物作為疫苗即沒有效果。
實驗2對于第一次在CFA中接種，第二次在IFA中接種已知成功的基于與匙孔嘁血藍蛋白(KLH)偶聯(lián)的串聯(lián)-LHRH肽的疫苗，使肽不結(jié)合載體蛋白，以單體或二聚體形式，在CFA/IFA中，及在2×IFA中，劑量為1mg和100μg進行測試。分別在10周齡和18周齡接種兩次免疫豬。
1)串聯(lián)LHRH的肽分子式121pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC2)串聯(lián)LHRH二聚體的肽分子式121pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC|pEHWSYGLRPGQHWSYGLRPGC22 42抗原 精巢重量 精巢重量8wpv時的＜150克的數(shù) (平均值±s.d.) LHRH-Ab豬數(shù)/組豬 效價佐劑劑量1)串聯(lián)LHRH CFA/IFA 1mg6/6 38±231)串聯(lián)LHRH CFA/IFA 1mg6/6 24±61)串聯(lián)LHRH CFA/IFA 1mg6/6 41±271)串聯(lián)LHRH CFA/IFA 1mg11/1139±1417.8±11.52)串聯(lián)LHRH二聚體 CFA/IFA 1mg10/1167±6416.7±5.91)串聯(lián)LHRH 2×IFA 1mg5/13 159±108 10.8±8.42)串聯(lián)LHRH二聚體 2×IFA 1mg6/13 154±95 8.7±6.81)串聯(lián)LHRH CFA/IFA 100μg 7/12 121±92 12.6±5.92)串聯(lián)LHRH二聚體 CFA/IFA 100μg6/12132±86 9.8±5.21)串聯(lián)LHRH 2×IFA 100μg5/13172±92 3.5±4.62)串聯(lián)LHRH二聚體 2×IFA 100μg1/13220±55 4.6±5.4單體或二聚體形式的串聯(lián)LHRH疫苗即便在完全缺失載體蛋白KLH時也能有效阻止精巢生長及公豬膻味形成。這個疫苗不利的一面是只有高劑量使用弗氏完全佐劑才能取得高效。此外，只有使用1mg劑量CFA/IFA的串聯(lián)LHRH或串聯(lián)LHRH二聚體才能得到合理的抗LHRH抗體效價(表示為免疫后8周(8wpv)所取血清的結(jié)合百分率)。
實驗3用更溫和的佐劑SpeCol和雙油乳液(d.o.e)代替IFA，檢測綴合載體蛋白的效果。將在第6、16、27、37位甘氨酸被D-賴氨酸取代的二聚化串聯(lián)LHRH肽與卵清蛋白綴合，用Specol及雙油乳液分別乳化。在10周齡及18周齡分別給豬接種2次，劑量為1mg肽綴合物。偶聯(lián)效果為50％，因此實際使用的抗原量為500μg。-串聯(lián)LHRH二聚體的肽分子式16 16 21pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC*＝[D-賴氨酸]|pEHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC222737 42抗原 精巢重量＜150克精巢重量的豬數(shù)/組豬數(shù)(平均值±s.d.)1)在Specol中的[D-Lys6]-串聯(lián) 9/9 19±12LHRH二聚體-卵清蛋白2)在d.o.e中的[D-Lys6]-串聯(lián) 8/8 43±46LHRH二聚體-卵清蛋白即使使用非常溫和的佐劑，與通用載體蛋白綴合也會極大改善疫苗效率。
實驗4在后續(xù)實驗中，我們檢測了使用劑量可降低到何種程度。肽抗原為[D-Lys6]-串聯(lián)LHRH二聚體，其偶聯(lián)到卵清蛋白，使用Specol作為佐劑，分別在10周齡和18周齡兩次給豬接種綴合物。
劑量 精巢重量＜150克精巢重量 12wpv時的(μg綴合物)的豬數(shù)/組豬數(shù) (平均值±s.d.)LHRH效價A.1000 9/9 19±1246.5±5.1B.1000 8/8 43±4628.7±13.0C.1000 7/8 60±6244.1±11.4D.900 11/1146±3824.4±4.4C.500 7/9 65±6936.3±14.3D.300 11/1129±1828.0±3.2E.300 15/1524±1835.3±4.2C.250 9/9 32±1245.1±8.6C.125 8/8 42±4244.9±12.0F.125 12/1235±3727.8±3.6G.125 10/1021±1226.5±3.1H.125 6/6 12±2 n.d.K.125 7/7 31±2229.5±5.1D.100 9/10 62±5823.2±6.7D.3010/1153±6525.6±7.4E.3013/1561±7532.5±5.2D.109/11 78±8622.9±7.8E 3 6/15207±117 21.3±9.7使用在Specol中的[D-Lys6]-串聯(lián)LHRH二聚體-卵清蛋白綴合物，可以顯著降低疫苗劑量。在43頭接種125μg綴合物(＝62.5μg肽)的豬中，有效率100％。精巢小于150g的豬中測得每克背部脂肪中雄激素含量低于0.5μg(翁克等，《生畜生產(chǎn)科學》，42卷，63-71(1995))，大多數(shù)情況下甚至低于ELISA可檢水平(0.111μg/g背部脂肪)。用10-100μg綴合物劑量時，非反應(yīng)者有增加趨勢，劑量低于10μg則無效。抗LHRH抗體效價僅在一個實驗內(nèi)部可比。結(jié)果清楚表明，低劑量疫苗能引發(fā)與高劑量相似的效價，這與使用串聯(lián)LHRH或串聯(lián)LHRH二聚體獲得的結(jié)果相反。在一個實驗中低平均效價、高標準偏差產(chǎn)生于豬的方面而非全出自對疫苗的響應(yīng)或不響應(yīng)。
實驗5對照組為完整雄豬，測定其精巢重量和雄激素水平。
數(shù)目精巢重量 雄激素(平均值±s.d.) (μg/g背部脂肪)1 10217±38 0.68±0.422 6 233±41 2.04±1.553 5 231±58 2.05±0.70正如翁克等《生畜生產(chǎn)科學》，42卷，63-71(1995)報道，雄激素濃度在各個完整成年雄豬中差別較大。
權(quán)利要求
1.一種含至少兩個連續(xù)LHRH十肽序列的肽，其中至少有一個LHRH十肽的第6位甘氨酸被具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸取代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的肽，其特征在于其包括具下列結(jié)構(gòu)的氨基酸序列1 6 16 21#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC其中第6位或第16位氨基酸*是具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸，另一個氨基酸*是甘氨酸或具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的肽，其是二聚化或多聚化的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的肽，其包括下列結(jié)構(gòu)1 6 16 21#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC|#EHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC2227 37 42其中第6位或16位或27位或37位氨基酸*為右旋賴氨酸或右旋谷氨酰胺或另一種具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸，另一氨基酸*是甘氨酸或右旋賴氨酸或右旋谷氨酰胺或另一種具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的肽，其具有下列結(jié)構(gòu)16 16 21#CQHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC|#CQHWSY*LRPGQHWSY*LRPGC222737 42其中第6位或16位或27位或37位氨基酸*為右旋賴氨酸或右旋谷氨酰胺或另一種具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸，另一氨基酸*是甘氨酸或右旋賴氨酸或右旋谷氨酰胺或另一種具有可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸。
6.一種組合物，其中根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項所述的肽與一種載體化合物偶聯(lián)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的組合物，其中載體化合物是一種蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的組合物，其中載體化合物是KLH或卵清蛋白。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項所述的組合物，其還含有一種溫和佐劑。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的組合物，其中溫和佐劑是一種油包水乳液的油相或一種雙油乳液。
11.一種疫苗，包括權(quán)利要求1-10任一項所述的組合物。
12.一種用權(quán)利要求13的疫苗接種動物的方法。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的用疫苗接種動物的方法，其中有效劑量低于約1mg。
14.一種影響動物的一種或多種生殖特征或行為特征的方法，所其特征在于所述動物已根據(jù)權(quán)利12或13的方法接種。
15.一種免疫閹割豬的方法，其特征在于所述豬已根據(jù)權(quán)利要求12或13的方法接種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的串聯(lián)LHRH肽疫苗制劑,其中組成串聯(lián)單位的一個或兩個LHRH十肽的第6位甘氨酸被含可偶聯(lián)載體化合物的側(cè)鏈的右旋氨基酸所取代。并且,串聯(lián)LHRH肽能形成串聯(lián)的二聚體形式,也適于生產(chǎn)有效針對LHRH(黃體生成激素釋放激素)或稱為GnRH(促性腺激素釋放激素)的疫苗,以用于免疫閹割,抑制或影響脊椎動物特別是家畜,男性的行為或生殖功能。
文檔編號A01K67/00GK1187200SQ96194609
公開日1998年7月8日 申請日期1996年6月6日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月7日
發(fā)明者羅伯特·漢斯·梅隆, 亨德里卡·貝倫迪娜·翁克 申請人:動物育種及動物保健基金會研究所