專利名稱：一種提高植物蛋白溶解性的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種提高植物蛋白溶解性的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及植物蛋白來源的蛋白質溶解的方法，它們包括用足量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源，并且用足量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源。另一方面，本發(fā)明提供了含有一種肌醇六磷酸酶及一種或多種蛋白分解酶的動物飼料添加劑。
背景技術：
蛋白質對于a.o.哺乳動物及產蛋雞是一種必需營養(yǎng)物質。大多數牲畜及人類從植物蛋白來源得到所必需的蛋白質。重要的植物蛋白源為例如谷物、豆科植物及油籽類作物。
水解的植物蛋白如大豆蛋白水解物可以作為營養(yǎng)物，如營養(yǎng)添加劑，應用于食品及飲料中。水解蛋白比未水解蛋白更易吸收，這是為什么蛋白水解物被認為具有最高營養(yǎng)價值的原因。已知有數種制備蛋白水解物的方法并在文獻中進行了描述，參見US4,324,805和WO92/15696。
基本上所有來源于植物的食品及飼料均含有肌醇六磷酸鹽及肌醇六磷酸作為貯存的磷源[參見E.Graf(ed.)，Phytic Acid，Chem-istry and Applications，Minneapololis，U.S.A.1986綜述]。谷類中約75-78％的磷結合成肌醇六磷酸。肌醇六磷酸鹽占所有堅果類、谷類、豆類、油籽類、孢子及花粉的1-3％。肌醇六磷酸的復合鹽稱為肌醇六磷酸鈣鎂。
肌醇六磷酸可以螯合礦物質如鈣、鋅、鎂及鐵，從而降低了營養(yǎng)性重要的礦物質的生物利用度，因此被普遍認為是一種抗營養(yǎng)因子。體外研究表明肌醇六磷酸抑制某些動物蛋白的胃酸消化，而胰蛋白酶消化卻未受影響[參見Knuckles et al.，Journal of Food Science，1989，541348-1350]。
肌醇六磷酸酶為催化肌醇六磷酸鹽向肌醇及無機磷轉化的一組酶。肌醇六磷酸酶已從如芽胞桿菌、假單孢菌、酵母菌及曲霉中得到。
在美國專利US3,297,548中已經建議向單胃動物飼料中加入微生物肌醇六磷酸酶以便向飼料中補充無機磷。
已有人認為肌醇六磷酸酶可以用于大豆的處理中。因此，EP-A-0420358報告了大豆粗粉中含有高含量的抗營養(yǎng)因子肌醇六磷酸鹽，它使這種蛋白質來源不適合用于嬰兒的食物中，也不適于魚類、小牛及其它的非反芻動物的飼料中，因為肌醇六磷酸鹽螯合了飼料中的重要礦物質。
總之，以前已有人提議用肌醇六磷酸酶利用在植物蛋白來源中存在的、結合在肌醇六磷酸鹽/肌醇六磷酸中的磷，或利用結合在肌醇六磷酸復合物中營養(yǎng)性重要的礦物質。
然而，有必要改善植物來源如谷類、豆類及油籽作物中存在的蛋白質的利用度，因為利用度的增加可以提高蛋白質水解過程的產量以及獲得更高的營養(yǎng)收益，即改善了蛋白質的利用。
本發(fā)明概述如今已經發(fā)現用有效量的肌醇六磷酸酶處理植物源可以提高植物源中蛋白質的溶解性。在蛋白質分解的過程中加入肌醇六磷酸酶，可以獲得更高程度的水解并提高了蛋白質的溶解性，而且產量也得到了提高。
因此，本發(fā)明提供了一種用于溶解植物蛋白來源中蛋白質的方法，該方法包括用有效量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源，且用有效量的一種或多種蛋白分有酶處理植物蛋白源。
另一方面，本發(fā)明提供了一種包括一種肌醇六磷酸酶及一種蛋白分解酶的動物飼料添加劑。本發(fā)明詳述植物蛋白質的溶解性本發(fā)明提供了一種溶解植物蛋白來源中蛋白質從而獲得蛋白質水解物的方法。該方法包括以下步驟(a)用有效量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源；且(b)用有效量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源。
與現有已知的獲取蛋白質水解物的方法相比，本方法提高了蛋白質的利用度，從而使提取增加，產量提高以及蛋白質的利用提高。
適于本發(fā)明方法的植物蛋白源可以是任何含蛋白質的植物，特別是豆類、谷類、菊科植物或十字花植物。優(yōu)選地，豆類植物包括大豆、蠶豆、豌豆和白羽扇豆(羽扇豆屬植物)，更優(yōu)選地為大豆。優(yōu)選地，谷類包括小麥、玉米、大麥、黑麥、燕麥、大米、高粱、芝麻(Sesa-mum indicum)和小米(Panicum miliaceum)。有用的菊科植物的例子是向日葵(Helianthus)，且有用的十字花科植物的例子是油菜(油菜子，如Brassica napus)。
植物蛋白源優(yōu)選大豆。
利用本發(fā)明方法的含蛋白質植物可以是任何形式的，包括“已處理的形式”，其中在蛋白質進行本發(fā)明方法處理之前，干燥物質中的蛋白質含量已增加。例如，大豆蛋白質粗制物可以從大豆、去脂大豆片、豆粉或大豆分離物獲得。這些含蛋白的粗制物一般含有約42％-95％的蛋白質。
蛋白源在用本發(fā)明方法處理前可以以任何常規(guī)的方法進行預處理。特別是可以將蛋白源干燥和/或磨碎，即處理成粗粉或片狀(如大豆粗粉或片)。
本發(fā)明方法的兩個步驟(a)和(b)可以連續(xù)進行，或同時進行。
植物蛋白源也可用含有一種或多種肌醇六磷酸酶及一種或多種蛋白分解酶的酶制備物處理，或者植物蛋白源可用兩種或多種含有一種或多種肌醇六磷酸酶和/或一種或多種蛋白分解酶的酶處理。
目前認為本發(fā)明的方法優(yōu)選以混懸液的PH在約PH3-9的范圍內，更優(yōu)選在約PH4-7的范圍內進行。
也認為本發(fā)明的方法優(yōu)選在約10℃-70℃，更優(yōu)選在約35℃-65℃的溫度范圍內進行。
在更具體的實施方案中，本方法包括如下連續(xù)步驟(i)將植物蛋白源混懸在水中；(ii)將混懸液用一種或多種肌醇六磷酸酶及一種或多種蛋白分解酶進行酶處理以蛋白分解性的水解蛋白質；(iii)使酶失活，且可選擇地(iv)從混懸物中分離水解的蛋白質。
使酶失活可以采用常規(guī)的酶失活法，如加熱處理，即提高水解混懸液或混合物的溫度至可使酶變性的溫度，一般至85℃以上。
分離步驟可以采用常規(guī)的從混懸物中分離水解蛋白的方法，例如對含蛋白水解物的混懸液進行離心或膜過濾。
總的說來，本發(fā)明的方法可以以相似于常規(guī)的獲得蛋白水解物的方法進行，例如，在美國專利US4,324,805、US4,100,024和WO92/15696中所描述，這些出版物引入本文作參考。肌醇六磷酸酶本發(fā)明的溶解植物蛋白源中蛋白質的方法包括用足量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源。
在本發(fā)明的上下文中，肌醇六磷酸酶是一種催化肌醇磷酸鹽上的無機磷脫掉的酶。肌醇六磷酸酶優(yōu)選來自于微生物如細菌、真菌及酵母但也可為植物來源。
在一優(yōu)選實施方案中，肌醇六磷酸酶來源于真菌株，尤其是曲霉株，如黑曲霉、米曲霉、無花果曲霉、滄盛曲霉、無冠構巢曲霉和土曲霉。更優(yōu)選的是得自黑曲霉株或米曲霉株的肌醇六磷酸酶。
在另一優(yōu)選實施方案中，肌醇六磷酸酶來自于細菌株，尤其是芽胞桿菌株或假單孢菌株。優(yōu)選地，肌醇六磷酸酶來自枯草桿菌株。
在另一優(yōu)選實施方案中，肌醇六磷酸酶來自于酵母，尤其是克魯維酵母屬菌株或酵母屬菌株。優(yōu)選地，肌醇六磷酸酶來自啤酒酵母株。
在本發(fā)明的上下文中，“來自于……的酶”包括由一特殊菌株自然產生的酶，或由該菌株回收的，或由來自該菌株DNA序列編碼且在以所說DNA序列轉化的宿主生物體中產生的。
肌醇六磷酸酶可用任何適宜的技術從所談到的微生物中獲得。特別地是可通過在適宜的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行產生肌醇六磷酸酶微生物的發(fā)酵，然后再用已熟知的方法分離該酶來得到肌醇六磷酸酶。
用于培養(yǎng)的肉湯或培養(yǎng)基可以是任何適于使所談到的宿主細胞生長的常規(guī)培養(yǎng)基，并且可以根據現有技術的原則加以配制。優(yōu)選的培養(yǎng)基含有碳源和氮源以及其它無機鹽。適宜的培養(yǎng)基如最低限度或復合培養(yǎng)基可得商業(yè)供應商，或根據公開的收藏物如美國典型微生物保藏中心(ATCC)菌株目錄加以制備。
培養(yǎng)后，用從培養(yǎng)肉湯中分離和純化蛋白質的常規(guī)方法回收肌醇六磷酸酶。已熟知的純化方法包括用離心或過濾將細胞與培養(yǎng)基分離，用鹽如硫酸銨的方法沉淀含蛋白質成分，以及層析法如離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
另外的一種方法是也可用重組DNA技術優(yōu)選地大量制備肌醇六磷酸酶，該技術在EP-A1-0420358中得到描述，其公開物引入本文作參考。
優(yōu)選地，在如EP-A1-0420358所描述的有利于肌醇六磷酸酶編碼基因表達的條件下培養(yǎng)由無花果曲霉或黑曲霉屬獲得的肌醇六磷酸酶編碼基因轉化的曲霉屬之真菌。
優(yōu)選地用過濾及超濾法將含肌醇六磷酸酶發(fā)酵肉湯于應用于本發(fā)明(的配方)中之前進行處理。
目前認為足以改善植物蛋白溶解性的肌醇六磷酸酶的量相應于每公斤植物蛋白源約2至約50000FYT(見下文定義)的量，優(yōu)選每公斤植物蛋白源從約50至約30000FYT，最優(yōu)選每公斤植物蛋白源從約100至10000FYT。蛋白分解酶本發(fā)明的溶解植物蛋白源中蛋白質的方法也包括用足量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源。
蛋白分解酶可以是微生物酶，優(yōu)選源自細菌或真菌株的蛋白酶，或者蛋白分解酶可以是胰蛋白酶或胃蛋白酶。在優(yōu)選的實施方案中，蛋白分解酶為源自芽胞桿菌株，優(yōu)選枯草桿菌株或地衣芽胞桿菌株的細菌蛋白酶。商售的芽胞桿菌蛋白酶為AlcalaseTM和Neu-traseTM(Novo Nordisk A/S，Denmark)。在另一優(yōu)選的實施方案中，蛋白分解酶為一源自曲霉株，優(yōu)選棘孢曲霉株、黑曲霉株、米曲霉株的真菌蛋白酶。商售的曲霉蛋白酶為FlavourzymeTM(Novo NordiskA/S，Denmark)。
目前認為足以改善植物蛋白溶解性的蛋白分解酶的量相應于每公斤植物蛋白源從約0.0001至約0.5AU(在下文定義)的量，優(yōu)選每公斤植物蛋白源從約0.001至約0.05AU，更優(yōu)選每公斤植物蛋白源從約0.005至0.03AU。其它的酶如上文所述，本發(fā)明提供了溶解植物蛋白源中蛋白質的一種方法，該方法包括如下步驟(a)用足量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源；并且(b)用足量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源。
本發(fā)明方法的兩個步驟(a)和(b)可以連續(xù)進行，也可同時進行。
在一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括下述步驟(c)用一種或多種選自脂解酶和葡糖苷酶的酶處理植物蛋白源。
本發(fā)明方法的三個步驟(a)、(b)和(c)可以連續(xù)進行，或同時進行。或者，本發(fā)明方法的兩個步驟(a)和(b)同時進行，然后進行(c)步驟。
步驟(c)的脂解酶可以是任何三?；视椭?EC3.1.1.3)。
步驟(c)的葡糖苷酶可以是任何葡糖苷酶(EC3.2，也稱為糖酶)。優(yōu)選地，葡糖苷酶為淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纖維素酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)或內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特別是內-1，4-β葡聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖一內-1，3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15，也稱為果膠酶)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91，也稱為cel-lobiohydrolases)；內葡聚糖酶，特別是內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
在一更優(yōu)選的實施方案中，葡糖苷酶為聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；或內葡聚糖酶，優(yōu)選內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)，內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。工業(yè)應用本發(fā)明的溶解植物蛋白源之蛋白質的方法可在許多工業(yè)領域得到應用。特別是本發(fā)明的方法可應用于用作營養(yǎng)物如加入食品及飲料的營養(yǎng)添加物的蛋白水解性的制備。
因此，另一方面，本發(fā)明也可提供以本發(fā)明方法從植物蛋白源獲得的蛋白水解物。
本發(fā)明的蛋白水解物可以加入食品或飲料中，從而提高了其營養(yǎng)價值。
尤其是本發(fā)明的蛋白水解物可以加至動物飼料中，如單胃動物的飼料中。動物飼料添加劑本發(fā)明提供了一種包括一種或多種肌醇六磷酸酶和一種或多種蛋白分解酶的動物飼料。
當加至動物飼料中時，一種或多種肌醇六磷酸酶及一種或多種蛋白分解酶的聯(lián)合應用提高了植物源動物飼料中蛋白質的利用度，從而能夠更好地提取植物蛋白、獲得更多的蛋白質且提高蛋白質的利用。因此，飼料氮的消化性和營養(yǎng)價值都得到了提高，而且動物的生長率和/或飼料轉換比(即攝入的飼料重量與體重增加的比)也得到了改善。
在本發(fā)明的上下文中，動物飼料添加劑為含有一種或多種肌醇六磷酸酶和一種或多種蛋白分解酶以及適宜的載體和/或賦形劑的酶制備物，并且該酶制備物是以適于加入動物飼料的形式提供的。本發(fā)明的動物飼料添加劑可以根據已知的方法制備，并且可以是干燥或液狀制備物的形式。制備物所含的酶可以按照已知的方法可選擇地加以穩(wěn)定。
在一具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑是一種顆粒化的酶產物，它可以容易地與飼料成分混勻，或者更優(yōu)選地形成預混物(pre-mix)的成分。顆粒狀的酶產物可以包衣或不包衣。酶顆粒的大小優(yōu)選為與飼料和預混物成分的顆粒相當。這提供了將酶摻入飼料的一種安全和方便的方法。
在另一具體的實施方案中，本發(fā)明的動物飼料添加劑為一穩(wěn)定化的液狀組合物，它可以是水性或油性基質的漿狀物。
在另一具體的實施方案中，將一種或多種酶在將飼料壓?；驂核榍斑M行應用。
本發(fā)明的動物飼料添加劑可以在體外(通過改善飼料的成分)或體內顯示其效應。本發(fā)明的飼料添加劑特別適于加至含高含量蛋白的植物的動物飼料組合物中，這些植物尤其是豆類、谷類、菊科植物或十字花科植物。優(yōu)選地豆類為大豆、蠶豆、豌豆和/或白羽扇豆(白羽扇豆屬植物)。最優(yōu)選的豆類為大豆。優(yōu)選地，谷類為小麥、玉米、大麥、黑麥、燕麥、大米、高粱，芝麻(Sesamum indicum)和小米(Pan-icum miliaceum)。葡科植物的一個例子是向日葵(helianthus)，有用的十字花科植物的例子是油菜(油菜子，如Brassicanapus)。
在另一優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了一種含一種或多種選自脂解酶及葡糖苷酶的添加酶的動物飼料添加劑。
脂解酶可以是任何三酰基甘油脂酶(EC3.1.1.3)。
葡糖苷酶可以是任何葡糖苷酶(EC3.2，也稱為糖酶)。優(yōu)選地，葡糖苷酶為淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纖維素酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)或由-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖-內-1，3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15，也稱為果膠酶)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91，也稱為cellobiohy-drolases)；內葡聚糖酶，特別是內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
在一更優(yōu)選的實施方案中，葡糖苷酶為聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；或內葡聚糖酶，優(yōu)選內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
目前認為動物飼料添加劑的PH應在約2-8的范圍內。
目前認為動物飼料添加劑中肌醇六磷酸酶活性應在每克總組合物中約200-50000FYT(如下文定義)的范圍內，優(yōu)選在每克總組合物中約500-10000FYT的范圍內，最優(yōu)選在每克總組合物中約2000-6000FYT的范圍內。
優(yōu)選地，加入動物飼料中添加劑的量應足以使每公斤飼料組合物中至少含50FYT，優(yōu)選在每公斤飼料組合物中含約100-2000FYT的范圍內。
可以理解，為增加營養(yǎng)價值(即氮的消化性)加入飼料的實際肌醇六磷酸的量依賴于飼料自身的組成成分。含有大量肌醇六磷酸的飼料一般需加入更大量的肌醇六磷酸酶活性。通過專業(yè)人員可很容易地確定需加入的肌醇六磷酸酶的量。肌醇六磷酸酶活性(FYT)可以用肌醇六磷酸鈉作為底物的方法測定肌醇六磷酸酶活性。當受肌醇六磷酸酶作用時，無機磷從肌醇六磷酸鈉上脫下。在含亞鐵/鉬的試劑中，磷(PO4)形成復合物，用750nm的分光光度法加以檢測。
一個肌醇六磷酸酶單位(FYT)定義為在標準條件下每分鐘將1μmol磷釋出的酶的量，所說標準條件為PH5.5，37℃，5.0mM肌醇六磷酸鈉的底物濃度，反應時間30分鐘。
更詳細地描述此分析方法的標準操作程序EAL-SM-0403.01由Novo Nordisk A/S，Denmark備索，其公開物引入本文作參考。蛋白酶活性(AU)可以用變性血紅蛋白作底物測定蛋白分解活性。在Anson-Hemoglobin測定蛋白分解活性的方法中，消化變性的血紅蛋白，并且用三氯乙酸(TCA)沉淀未消化的血紅蛋白。TCA可溶性產物的量用苯酚試劑測定，它與酪氨酸和色氨酸產生藍色。
一個Anson單位(AU)定義為標準條件下以起始速率消化血紅蛋白，每分鐘產生可如1毫克當量酪氨酸與苯酚試劑產生相同顏色的TCA可溶液產物的酶的量。
更詳細描述此分析方法的檔案AF4/5由Novo Nordisk A/S，Denmark備索，其公開物引入本文作參考。
實施例參考于下列實施例對本發(fā)明進行進一步描述說明，這些實施例不應以任何方式限制本發(fā)明權利要求的范圍。
實施例一大豆蛋白水解將大豆蛋白濃縮物(Unico 75，Loders Crosklaan，NL)混懸在50℃的去離子水中。
于85℃對混合物熱處理3分鐘，再冷卻至水解溫度55℃。用4N NaOH調節(jié)pH至8.5。
將混合物分至三只管中以進行三個比較實驗1)用下述酶進行水解AlcalaseTM2.4L，劑量為蛋白濃度的2W/W％。
NeutraseTM0.5L，劑量為蛋白濃度的1W/W％。
肌醇六磷酸酶NovoTM(一種曲霉肌醇六磷酸酶，6900FYT/g)，劑量為每克大豆?jié)饪s液1mg。pH以HCl調節(jié)至4.5。在pH＜6.6時加入肌醇六磷酸酶。2)用下述酶進行水解AlcalaseTM2.4L，劑量為蛋白濃度的2W/W％。
NeutraseTM0.5L，劑量為蛋白濃度的1W/W％。3)以HCl調節(jié)pH至6.2。加入肌醇六磷酸酶NovoTM(一種曲霉肌醇六磷酸酶，6900FYT/g)，劑量為每克大豆?jié)饪s物1mg。
通過檢測水解的程度及滲透壓對水解液進行監(jiān)測。結果示于下面的表1-2中。表1滲透壓

表2水解程度

水解程度(％PH)的兩種測量結果顯示底物降解增加。與實驗2(77.3％)的結果相比，實驗1產生了更多的可溶蛋白(78.8％)。實施例2體外大豆粗粉的N-消化性制備兩種樣品樣品A1克大豆粗粉樣品B1克大豆粗粉，加上0.032克肌醇六磷酸酶NovoTM(一種曲霉肌醇六磷酸酶，5000FYT/g)。
每個樣品與蛋白酶于pH2.4溫育2小時，然后與胰酶于pH6.8溫育16小時。已懸浮的但未消化的蛋白質用磺基水楊酸進行沉淀。通過過濾和干燥收集未消化的蛋白質(以及其它未消化的成分)。測定濾餅及樣品的干燥物質，并用Kjeldahl法測定氮(N)的量。
按下式計算N消化性

將氮(N)消化性乘6.25計算出蛋白質消化性。
得到下列蛋白質消化性結果樣品A(無肌醇六磷酸酶)88.4％樣品B(含肌醇六磷酸酶)89.9％。實施例3肌醇六磷酸對豬表現氮消化性及氮利用的影響以大麥-小麥-大豆飲食對豬進行平衡試驗。
飲食組成大麥 50.8％小麥 20.0％大豆 24.0％動物脂肪 2.0％melasse 1.0％礦物質、維生素及氨基酸 2.2％飲食中不加任何無機磷。于60℃以上將食物制成丸狀。
平衡試驗包括5天的適應期和7天的收集期。
將12頭豬分成2組，第一組用該飲食喂養(yǎng)，第二組用同樣飲食喂養(yǎng)但另于每100公斤飲料中加入20.3克肌醇六磷酸酶NovoTM(一種曲霉肌醇六磷酸酶，7370FYT/g)。
測定飲食、糞便及尿中的氮含量并計算表現氮消化性及氮利用。
結果示出表下中。表3氮的消化性及氮的利用

*p≤0.01NS(不顯著)p＞0.05S.E.M.標準誤平均數權利要求書按照條約第19條的修改1.一種溶解植物蛋白源中蛋白質的方法，該方法包括如下步驟(a)用足量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源；且(b)用足量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源且(c)用足量的一種或多種脂解酶(EC3.1.1.3)和/或一種或多種糖苷酶(EC3.2)處理植物蛋白源。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)的葡糖苷酶為淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纖維素酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)或內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖-內-1，3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；內葡聚糖酶，特別是內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
3.根據權利要求1的方法，其中步驟(c)的葡糖苷酶為聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；或內葡聚糖酶，優(yōu)選內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
4.根據權利要求1-3中任何一項的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)同時進行。
5.根據權利要求1-4中任何一項的方法，其中步驟(a)中的肌醇六磷酸酶為植物肌醇六磷酸酶、真菌肌醇六磷酸酶、細菌肌醇六磷酸酶或可由酵母產生的肌醇六磷酸酶。
6.根據權利要求5的方法，其中真菌肌醇六磷酸酶來自曲霉株，優(yōu)選黑曲霉株、無花果曲霉株、泡盛曲霉株、米曲霉株、土曲霉株或無冠構巢曲霉株。
7.根據權利要求5的方法，其中細菌肌醇六磷酸酶來自芽胞桿菌或假單孢菌，優(yōu)選枯草桿菌。
8.根據權利要求5的方法，其中肌醇六磷酸酶來自克魯維酵母屬或酵母菌屬的酵母，優(yōu)選啤酒酵母。
9.根據權利要求1-8中任何一項的方法，其中植物蛋白源用步驟(a)中的肌醇六磷酸酶以每公斤蛋白源約2-50000肌醇六磷酸酶單位(FYT)的量進行處理，酶的量優(yōu)選每公斤蛋白源約50-30000FYT，最優(yōu)選每公斤蛋白源約100-10000FYT。
10.根據權利要求1-9中任何一項的方法，其中步驟(b)中的蛋白分解酶為微生物蛋白酶、真菌蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶。
11.根據權利要求10的方法，其中微生物蛋白酶來自芽胞桿菌，優(yōu)選地衣芽胞桿菌株，和/或枯草桿菌株。
12.根據權利要求10的方法，其中真菌蛋白酶來自曲霉株，優(yōu)選棘孢曲霉株、黑曲霉株、米曲霉株.
13.根據權利要求1-12的任何一項的方法，其中植物蛋白源用一種或多種步驟(b)之蛋白分解酶以每公斤蛋白源約0.0001-0.5AU的量處理，酶的量優(yōu)選每公斤蛋白源約0.001-0.05AU，更優(yōu)選每公斤蛋白源約0.005-0.03AU。
14.根據權利要求1-13的任何一項之方法，其中植物蛋白源為豆類、菊花科植物、十字花科植物、或谷類、或其混合物。
15.根據權利要求1-13的任何一項之方法，其中植物蛋白源為大豆。
16.根據權利要求1-15的任何一項之方法，其中的酶處理在pH3-9，優(yōu)選pH4-7的條件下進行。
17.根據權利要求1-16的任何一項之方法，其中的酶處理在約10-70℃，優(yōu)選約35-65℃的條件下進行。
18.一種動物飼料添加劑，它含有一種或多種來自脂解酶(EC3.1.1.3)和糖苷酶(EC3.2)的另加的酶.
19.根據權利要求18的動物飼料添加劑，其中葡糖苷酶為淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纖維素酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)或內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特別是內-1，4-β葡聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖一內-1，3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；內葡聚糖酶，特別是內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
20.根據權利要求18的動物飼料添加劑，其中葡糖苷酶為聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；或內葡聚糖酶，優(yōu)選內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
21.根據權利要求18-20任何一項的動物飼料添加劑，其中的肌醇六磷酸酶為植物肌醇六磷酸酶、真菌肌醇六磷酸酶、細菌肌醇六磷酸酶或可由酵母產生的肌醇六磷酸酶。
22.根據權利要求21的動物飼料添加劑，其中真菌肌醇六磷酸酶來自曲霉株，優(yōu)選黑曲霉株、無花果曲霉株、泡盛曲霉株、米曲霉株、土曲霉株或無冠構巢曲霉株。
23.根據權利要求21的方法，其中細菌肌醇六磷酸酶來自芽胞桿菌或假單孢菌，優(yōu)選枯草桿菌。
24.根據權利要求21的方法，其中肌醇六磷酸酶來自克魯維酵母屬或酵母菌屬的酵母，優(yōu)選啤酒酵母。
25.根據權利要求18-24任何一項的動物飼料添加劑，它含有含量相當于每克組合物約200-50000肌醇六磷酸酶單位(FYT)的一種或多種肌醇六磷酸酶，酶含量優(yōu)選每克組合物約500-10000FYT，更優(yōu)選每克組合物約2000-6000FYT。
26.根據權利要求18-25任何一項的動物飼料添加劑，其中蛋白分解酶為微生物蛋白酶、真菌蛋白酶，或胃蛋白酶或胰蛋白酶。
27.根據權利要求26的動物飼料添加劑，其中微生物蛋白酶來自芽胞桿菌，優(yōu)選地衣芽胞桿菌，知/或枯草桿菌。
28.根據權利要求26的動物飼料添加劑，其中真菌蛋白酶來自曲霉株，優(yōu)選棘孢曲霉株、黑曲霉株、米曲霉株。
29.根據權利要求18-28任何一項的動物飼料添加劑，它含有含量相當于每克組合物約0.01-20AU(Anson Units)的蛋白分解酶，酶含量優(yōu)選每克組合物約0.1-10AU，更優(yōu)選每克組合物約0.2-5AU。
30.根據權利要求18-29任何一項的動物飼料添加劑，其中一種或多種酶以粉狀、非粉狀顆粒、穩(wěn)定的液狀、漿狀、或以受保護的酶的形式提供。
權利要求
1.一種溶解植物蛋白源中蛋白質的方法，該方法包括如下步驟(a)用足量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源；且(b)用足量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源。
2.根據權利要求1的方法，其中步驟(a)和(b)同時進行。
3.根據權利要求1-2其中之一的方法，其方法進一步包括步驟(c)用足量的一種或多種脂解酶(EC3.1.1.3)和/或一種或多種葡糖苷酶(EC3.2)處理植物蛋白源。
4.根據權利要求3的方法，其中葡糖苷酶為淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纖維素酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)或內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖-內-1，3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；內葡聚糖酶，特別是內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
5.根據權利要求3的方法，其中葡糖苷酶為聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；或內葡聚糖酶，優(yōu)選內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
6.根據權利要求3-5其中任何一項的方法，其中步驟(a)、(b)和(c)同時進行。
7.根據權利要求1-6其中任何一項的方法，其中步驟(a)中的肌醇六磷酸酶為植物肌醇六磷酸酶、真菌肌醇六磷酸酶、細菌肌醇六磷酸酶或可由酵母產生的肌醇六磷酸酶。
8.根據權利要求7的方法，其中真菌肌醇六磷酸酶來自曲霉株，優(yōu)選黑曲霉株、無花果曲霉株、泡盛曲霉株、米曲霉株、土曲霉株或無冠構巢曲霉株。
9.根據權利要求7的方法，其中細菌肌醇六磷酸酶來自芽胞桿菌或假單孢菌，優(yōu)選枯草桿菌。
10.根據權利要求7的方法，其中肌醇六磷酸酶來自克魯維酵母屬或酵母菌屬的酵母，優(yōu)選啤酒酵母。
11.根據權利要求1-10中任何一項的方法，其中植物蛋白源用步驟(a)中的肌醇六磷酸酶以每公斤蛋白源約2-50000肌醇六磷酸酶單位(FYT)的量進行處理，酶的量優(yōu)選每公斤蛋白源約50-30000FYT，最優(yōu)選每公斤蛋白源約100-10000FYT。
12.根據權利要求1-11中任何一項的方法，其中步驟(b)中的蛋白分解酶為微生物蛋白酶、真菌蛋白酶或胃蛋白酶或胰蛋白酶。
13.根據權利要求12的方法，其中微生物蛋白酶來自芽胞桿菌，優(yōu)選地衣芽胞桿菌，和/或枯草桿菌。
14.根據權利要求12的方法，其中真菌蛋白酶來自曲霉株，優(yōu)選棘孢曲霉株、黑曲霉株、米曲霉株。
15.根據權利要求1-14的任何一項的方法，其中植物蛋白源用一種或多種步驟(b)之蛋白分解酶以每公斤蛋白源約0.0001-0.5AU的量處理，酶的量優(yōu)選每公斤蛋白源約0.001-0.05AU，更優(yōu)選每公斤蛋白源約0.005-0.03AU。
16.根據權利要求1-15的任何一項之方法，其中植物蛋白源為豆類、菊花科植物、十字花科植物或谷類或其混合物。
17.根據權利要求1-15的任何一項之方法，其中植物蛋白源為大豆。
18.根據權利要求1-17的任何一項之方法，其中的酶處理在pH3-9，優(yōu)選pH4-7的條件下進行。
19.根據權利要求1-18的任何一項之方法，其中的酶處理在約10-70℃，優(yōu)選約35-65℃的條件下進行。
20.根據權利要求1-19的任何一項之方法，其方法包括步驟i)將植物蛋白源混懸在水中；ii)將步驟i)的水性混懸物用一種肌醇六磷酸酶和一種蛋白分解酶進行酶處理；iii)使步驟ii)的酶失活；且可選擇地iv)從水性混懸物中分離可溶性蛋白質。
21.一種含肌醇六磷酸酶和一種蛋白分解酶的動物飼料添加劑。
22.根據權利要求21的動物飼料添加劑，它含有一種或多種來自脂解酶(EC3.1.1.3)和葡糖苷酶(EC3.2)的另加的酶。
23.根據權利要求22的動物飼料添加劑，其中葡糖苷酶為淀粉酶，特別是α-淀粉酶或β-淀粉酶；纖維素酶，特別是內-1，4-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.4)或內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.6)；木聚糖酶，特別是內-1，4-β葡聚糖酶(EC3.2.1.8)或木聚糖-內-1，3-β-木糖苷酶(EC3.2.1.32)；α-半乳糖苷酶(EC3.2.1.22)；聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；內葡聚糖酶，特別是內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
24.根據權利要求22的動物飼料添加劑，其中葡糖苷酶為聚半乳糖醛酸酶(EC3.2.1.15)；纖維素-1，4-β-纖維素二糖酶(EC3.2.1.91)；或內葡聚糖酶，優(yōu)選內-1，6-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.75)、內-1，2-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.71)、內-1，3-β-葡聚糖酶(EC3.2.1.39)或內-1，3-α-葡聚糖酶(EC3.2.1.59)。
25.根據權利要求21-24中任何一項的動物飼料添加劑，其中肌醇六磷酸酶為植物肌醇六磷酸酶、真菌肌醇六磷酸酶、細菌肌醇六磷酸酶或可由酵母產生的肌醇六磷酸酶。
26.根據權利要求25的動物飼料添加劑，其中真菌肌醇六磷酸酶來自曲霉株，優(yōu)選黑曲霉株、ficuum曲霉株、泡盛曲霉株、米曲霉株、土曲霉株或nidulans曲霉株。
27.根據權利要求25的動物飼料添加劑，其中細菌肌醇六磷酸酶來自芽胞桿菌或假單孢菌，優(yōu)選枯草桿菌。
28.根據權利要求25的動物飼料添加劑，其中肌醇六磷酸酶來自kluveremyces屬或酵母菌屬的酵母，優(yōu)選啤酒酵母。
29.根據權利要求21-28的任何一項之動物飼料添加劑，它包含含量相當于每克組合物約200-50000肌醇六磷酸酶單位(FYT)的一種或多種肌醇六磷酸酶，酶含量優(yōu)選每克組合物約500-10000FYT，更優(yōu)選每克組合物約2000-6000FYT。
30.根據權利要求21-29任何一項的動物飼料添加劑，其中蛋白分解酶為微生物蛋白酶、真菌蛋白酶，或胃蛋白酶或胰蛋白酶。
31.根據權利要求30的動物飼料添加劑，其中微生物蛋白酶來自芽胞桿菌，優(yōu)選地衣芽胞桿菌，和/或枯草桿菌。
32.根據權利要求30的動物飼料添加劑，其中真菌蛋白酶來自曲霉株，優(yōu)選棘孢曲霉株、黑曲霉株、米曲霉株。
33.根據權利要求21-32任何一項之動物飼料添加劑，它包含含量相當于每克組合物約0.01-20AU(Anson Units)的一種蛋白分解酶，酶含量優(yōu)選每克組合物約0.1-10AU，更優(yōu)選每克組合物約0.2-5AU。
34.根據權利要求21-33任何一項之動物飼料添加劑，其中一種或多種酶以粉狀、非粉狀顆粒、穩(wěn)定的液狀、漿狀、或以受保護的酶的形式提供。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種提高植物蛋白溶解性的方法。更具體地說，本發(fā)明涉及植物蛋白來源的蛋白質溶解的方法，它們包括用足量的一種或多種肌醇六磷酸酶處理植物蛋白源，并且用足量的一種或多種蛋白分解酶處理植物蛋白源。另一方面，本發(fā)明提供了含有一種肌醇六磷酸酶及一種或多種蛋白分解酶的動物飼料添加劑。
文檔編號A23K1/00GK1146713SQ95192690
公開日1997年4月2日 申請日期1995年4月20日 優(yōu)先權日1994年4月22日
發(fā)明者P·M·尼勒森, I·H·納普 申請人:諾沃挪第克公司