專利名稱：抗生mi198物質(zhì)、其制備以及線形動物和節(jié)肢動物的殺滅劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及被簡稱為MI198物質(zhì)的一類新型抗生化合物，該化合物具有包括殺線蟲活性、殺螨活性和殺昆蟲活性的各種殺蟲活性。本發(fā)明還涉及MI198物質(zhì)的制備方法。本發(fā)明還涉及殺滅或控制線形動物門害蟲(例如線蟲)的藥劑，和殺滅或控制節(jié)肢動物門害蟲(如昆蟲，蜱螨和螨新型)的藥劑。這些藥劑都含有作為有效成分的新型抗生MI198物質(zhì)，它們可用作殺線蟲劑、殺蠕蟲劑、殺螨劑和/或殺蟲劑。本發(fā)明還涉及用于生產(chǎn)新型MI198物質(zhì)的新微生物。
眾所周知各種大環(huán)內(nèi)酯抗生素都具有抗菌活性。同時(shí)我們也知道屬于大環(huán)內(nèi)酯抗生的B-41物質(zhì)具有殺蟲和殺螨活性(特開昭48-60127，BP-B90336和USP-3984564)。據(jù)報(bào)道抗生物質(zhì)B-41物質(zhì)是很多不同的組分的復(fù)合物，這些組分通常認(rèn)為是milbemycin類(USP4，155，352)。另外，在USP4093629和4134973中公開了各種milbemycin衍生物。進(jìn)一步還知道，屬于milbemycin類的B-41-D抗生生物具有殺螨抗蠕蟲活性(USP4346171)。這些milbemycin是大環(huán)內(nèi)酯抗生素的一類，其中某些milbemyicn是已知的殺滅寄生在動物，植物和人身上的線形動物門害蟲(如線蟲)的驅(qū)蟲劑(見“JournolofAntibiotics”Vol.33，pp.1120～1127;Vol.36，pp.502～508及Vol.36，pp.509～515，以及BP-2056986)。這些milbenycin具有類似于本發(fā)明的新型抗生MI198物質(zhì)的大環(huán)內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。
人們總是希望發(fā)現(xiàn)或制造比已知?dú)⑾x劑包括抗細(xì)菌劑和抗真菌劑的性能更優(yōu)越的新化合物，并為此目的進(jìn)行著廣泛研究。
本發(fā)明人為了找到新的適用的抗生素進(jìn)行了深入的研究。結(jié)果我們成功地從在日本東京大田區(qū)收集的土壤樣中分離出了屬于吸水鏈霉菌種的菌株。然后本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)該菌株可產(chǎn)物一種新型大環(huán)內(nèi)酯類抗生素并將其命名為“MI198物質(zhì)”。我們發(fā)現(xiàn)MI198物質(zhì)有殺線蟲、殺螨及殺蟲活性。進(jìn)一步研究的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)MI198物質(zhì)是一種混合物或復(fù)合物，它包括MI198-Z1，MI198-Z2，MI198-Z3，MI198-Z4，MI198-Z5，MI198-Z6，MI198-Z7，MI198-Z8，MI198-Z9，MI198-Z10，MI198-Z11，MI198-Z12，MI198-Z13。我們又成功地從MI198物質(zhì)的復(fù)合物中分別分離出了Z1～Z13十三種組成物質(zhì)。我們還發(fā)現(xiàn)這十三種物質(zhì)Z1～Z13都具有殺線蟲、殺螨和殺蟲活性。然后，我們測定這13種組分物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)從而認(rèn)定它們是新的化合物。我們也發(fā)現(xiàn)它們可用下述的通式(Ⅰ)來表示。
在本說明書中，當(dāng)化合物被簡稱為MI198物質(zhì)時(shí)，除非另有說明，一般是指從MI198-Z1物質(zhì)到MI198-Z13物質(zhì)的全體或其中一個(gè)，它們中兩個(gè)或多個(gè)的混合物或它們的一個(gè)分離物質(zhì)。
本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供了抗生MI198物質(zhì)，它是由下列通式表示的化合物
其中，R1為具有下列通式的?；?
其中R3，R4，R5和R6各自代表氫原子，甲基或乙基;R2為甲基，乙基或異丙基。
本發(fā)明的MI198物質(zhì)具有類似于milbemycin的結(jié)構(gòu)，但它卻具有比包括milbemycin在內(nèi)的具有抗寄生蟲活性的所有商品抗生素都高得多的殺自由生活線蟲(aenorhabditiselegans)的活性。此外，MI198物質(zhì)還具有殺滅諸如棉葉螨的成蟲和卵的強(qiáng)殺螨活性以及殺滅諸如尖音庫蚊淡色亞種的昆蟲的成蟲，幼蟲和卵的強(qiáng)殺蟲活性。
MI198物質(zhì)毒性極低，作為其主要成分的MI198-Z1和MI198-Z3物質(zhì)在對小鼠(ICR，雌性)口服給藥時(shí)的LD50值為2000mg/kg以上。
MI198物質(zhì)是穩(wěn)定的中性物質(zhì)，它的0.1%的煤油或丙酮溶液在室溫下保存2個(gè)月后，其殺線蟲活性也不變低。MI198物質(zhì)的1mcg/ml的水溶液在4℃下保存一個(gè)月后，其殺線蟲活性也不變低。
因此，MI198物質(zhì)和其他已知的殺線蟲大環(huán)內(nèi)酯抗生素一樣，可用于消滅，驅(qū)除寄生在人和包括家畜、家禽和龐物(如豬、綿羊、山羊、牛、馬、狗、貓和雞)的內(nèi)部或外部的線形動物，例如一般稱為蠕蟲的后生動物(metazoan)(和狗和雞身上的蛔蟲);MI198還可以用于消滅和驅(qū)除寄生在植物上的線形動物或節(jié)肢動物，以及消滅和驅(qū)除損害食物或紡織物的節(jié)肢動物。
本發(fā)明的包括在MI198物質(zhì)中的從MI198-Z1到MI198-Z13的化學(xué)結(jié)構(gòu)表示在下表Ⅰ中。
通過NMR分析已證實(shí)MI198-Z2，MI198-Z7和MI198-Z8物質(zhì)各自包括這樣的異構(gòu)體，即R1表示的?；鶠轫樖胶头词降漠悩?gòu)體。因而，得到的MI198-Z2，MI198-Z7和MI198-Z8物質(zhì)各自為?；鵕1為順式的化合物和?；鵕1為反式的化合物的混合物。現(xiàn)在我們還不能把這些異構(gòu)體分離開來。
本發(fā)明的MI198-Z1物質(zhì)，MI198-Z2物質(zhì)直至MI198-Z13物質(zhì)的理化性質(zhì)描述如下(a)MI198-Z1物質(zhì)(1)外觀白色無定形固體(2)質(zhì)譜FDMSm/e627(M+1)EIMSm/e526，508，181，153(3)分子量626(4)UV吸收光譜表示于附


圖1，λEtOHmax(ε)235nm(27，500)，243nm(27，700)，252nm(sh)(5)紅外吸收光譜(KBr)表示于附圖2(6)核磁共振譜400MHz在室溫下在氘氯仿中測定的NMR譜表示于圖3中。
(7)溶解性易溶于乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇、氯仿和苯中，難溶于水(8)薄層色譜Rf值0.24懸浮劑硅膠薄層板(20×20cm)“kiesel gel 60F254”(西德Merch公司產(chǎn)品)展開溶劑己烷/乙酸乙酯(3∶1)
(9)高效液相色譜保留時(shí)間9.12分柱子SenshuKagaku公司(日本)制SSC-ODS-161溶劑75%乙腈水溶液流速1.5ml/分鐘檢測UV240nmb)從MI198-Z2物質(zhì)到MI198-Z13物質(zhì)(1)MI198-Z2、MI198-Z3、MI198-Z4、MI198-Z5、MI198-Z6、MI198-Z7、MI198-Z8、MI198-Z9、MI198-Z10、MI198-Z11、MI198-Z12、和MI198-Z13物質(zhì)各自為無定形白色固體，該固體易溶于乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙醇、氯仿和苯中，但難溶于水。
(2)從MI198-Z2物質(zhì)到MI198-Z13物質(zhì)的EI質(zhì)譜的數(shù)據(jù)列于表2中，其中有各自的分子式以及MI198-Z1物質(zhì)的數(shù)據(jù)。
(3)從MI198-Z2物質(zhì)到MI198-Z13物質(zhì)各自在乙醇溶液中得到的UV吸收光譜的數(shù)據(jù)和它們各自在氯仿溶液中得到的紅外光譜數(shù)據(jù)列于表3，同時(shí)還列有MI198-Z1物質(zhì)的數(shù)據(jù)。
(4)從MI198-Z2物質(zhì)到MI198-Z13物質(zhì)的薄層色譜的Rf值(20×20cm的硅膠薄層板“kiesel gel 60 F254”，用不同的展開劑體系展開)列于表4，同時(shí)還列有MI198-Z1物質(zhì)的值。
表4
展開劑Ⅰ四氯化碳/二氧六環(huán)(85∶15)展開劑Ⅱ苯/乙酸乙酯(80∶20)展開劑Ⅲ己烷/乙酸乙酯(75∶25)展開劑Ⅳ己烷/丙酮(70∶30)展開劑Ⅴ氯仿/乙酸乙酯(75∶25)
下面描述本發(fā)明MI198物質(zhì)的制備將屬于吸水鏈霉菌種的本發(fā)明人從土壤樣中分離出來的新菌柱MI198-fF29進(jìn)行培養(yǎng)，從其培養(yǎng)物，特別是培養(yǎng)菌體中可得到MI198物質(zhì)。當(dāng)首先用合適的有機(jī)溶劑對培養(yǎng)物，特別是培養(yǎng)菌體進(jìn)行提取時(shí)，可以得到由MI198-Z1(主要成分)和MI198＝Z2及MI198-Z13(次要或輔助組分)組成的MI198-Z物質(zhì)復(fù)合物。當(dāng)將MI198物質(zhì)復(fù)合物，即混合的MI198-Z物質(zhì)送往硅膠薄層色譜和/或高效液相色譜時(shí)，MI198物質(zhì)的復(fù)合物被分成單個(gè)的組分物質(zhì)，即MI198-Z1、MI198-Z2、MI198-Z3、MI198-Z4、MI198-Z5、MI198-Z6、MI198-Z7、MI198-Z8、MI198-Z9、MI198-Z10、MI198-Z11、MI198-Z12和MI198-Z13。
本發(fā)明的第二個(gè)方面提供了一種制備具有上述通式(Ⅰ)的抗生MI198物質(zhì)的方法，該方法包括在有氧條件下，在含有可同化的碳源和可同化的氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)屬于鏈霉菌屬的可產(chǎn)生MI198物質(zhì)的菌株，直至在培養(yǎng)物中產(chǎn)生并聚集相當(dāng)量的MI198物質(zhì)，然后，再從得到的培養(yǎng)物中回收具有通式(Ⅰ)的抗生MI198物質(zhì)。
用于本發(fā)明第二方面所述方法的產(chǎn)生MI198物質(zhì)的合適菌株的一個(gè)例子是上述的MI198-fF29。該新菌株是1983年8月從在東京大田區(qū)萩中公園收集的土壤樣品中分離出來的放線菌，菌株編號為MI198-fF29。MI198-fF29的微生物學(xué)性質(zhì)如下。
1，形態(tài)學(xué)在顯微鏡下，可以得到MI198-fF29菌株在其分枝的基層菌絲上伸出氣生菌絲。氣菌絲形成螺旋線，看不到輪生枝和孢子囊。由于用常規(guī)電子顯微鏡來觀察該菌株，難以辨別每個(gè)孢子，因此采用了冷凍系統(tǒng)。這樣發(fā)現(xiàn)在氣生菌絲的頂部形成具有10個(gè)以上孢子的鏈，孢子的大小約為0.7～0.8×0.9～1.0μm，其表面呈突起狀。
2，在各種培養(yǎng)基中的生長特征在括號中記載的顏色的標(biāo)準(zhǔn)為美國Container公司的“Colorharmorymanual”。
(1)蔗糖硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(27℃培養(yǎng))在無色～淺黃色(2gc，Bamboo)生長物上稀疏地形成白色氣生菌絲。未發(fā)現(xiàn)可溶性色素。
(2)葡糖天冬酰胺瓊脂培養(yǎng)基(27℃培養(yǎng))在淺黃(29c亮到中等黃褐色～11/2gc，灰黃色)～棕黃色的生長物上，形成淡黃灰(11/2ca，奶油色)～明灰褐色(2ge，林蔭色～2ig，棕褐暗藍(lán)灰色)的氣生菌絲。可溶性色素為淡黃色。培養(yǎng)2周后，發(fā)現(xiàn)氣生菌絲發(fā)生吸濕。生長物和可溶性色素不顯示由HCl或NaOH造成的色澤變化。
(3)甘油-天冬酰胺培養(yǎng)基(ISP-培養(yǎng)基5，在27℃下培養(yǎng))在淺黃～棕黃色生長物上，形成淡黃灰～亮棕灰的氣生菌絲?？扇苄陨貫榈S色。培養(yǎng)約2周后，發(fā)現(xiàn)氣菌絲發(fā)生吸濕。
(4)淀粉無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基(ISP-培養(yǎng)基4，27℃培養(yǎng))在淺黃(11/2gc，灰黃色)～暗黃色(11/2ne，古金色)生長物上，形成淡黃灰(1ea，鮮黃色)～亮棕灰色(2ge，林蔭色～2gi，棕褐暗藍(lán)灰色)氣生菌絲。在培養(yǎng)的后期氣生菌絲發(fā)生吸濕?？扇苄陨爻实S色。
生長物和可溶性色素不顯示任何由HCl或NaOH造成的顏色變化。
(5)酪氨酸-瓊脂培養(yǎng)基(ISP-瓊脂培養(yǎng)基7，27℃培養(yǎng))在淺黃(2gc，亮到中等黃褐色～11/2ic，淺古金色)～暗黃色的生長物上，形成淡黃灰(1ea，鮮黃色)～亮棕灰色(2ge，林蔭色)～亮灰(2fe，林蔭灰色)的氣生菌絲?？扇苄陨卦谂囵B(yǎng)初期呈淺粉色，在培養(yǎng)的后期變?yōu)楠?dú)特的強(qiáng)暗黃色。生長物和可溶性色素不顯示任何由HCl或NaOH造成的顏色變化。
(6)營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(27℃培養(yǎng))在淺黃(2gc，亮到中等黃褐色)生長物上，形成白色氣菌絲。無可溶性色素。
(7)酵母-麥芽瓊脂培養(yǎng)基(ISP-培養(yǎng)基2，27℃培養(yǎng))在淺黃(11/2ic，Lt.，古金色)～黃棕色的生長物上，形成淡黃灰(11/2ca，奶油色)～亮灰(2fe，林蔭灰色)～亮棕灰色(2ig，棕褐暗藍(lán)灰色)的氣生菌絲?？扇苄陨貫辄S色(11/2ga，黃油色)。在培養(yǎng)的后期，氣生菌絲發(fā)生吸濕。生長物和可溶性色素不顯示任何由HCl或NaOH造成的顏色變化。
(8)燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基(ISP-培養(yǎng)基3，27℃培養(yǎng))在無色～淺黃色的生長物上，形成淺黃灰～亮灰(3fe，銀灰色)～亮棕灰色(3ig，米褐色)的氣生菌絲。有時(shí)該氣生菌絲會發(fā)生吸濕?？扇苄陨爻瘦p微的淡黃色。
(9)甘油-硝酸鹽瓊脂培養(yǎng)基(在27℃下培養(yǎng))在無色～淺黃色的生長物上，形成白色氣生菌絲。沒有可溶性色素。
(10)淀粉瓊脂培養(yǎng)基(在27℃下培養(yǎng))在無色～淺黃色的生長物上，形成白色氣生菌絲。沒有發(fā)現(xiàn)可溶性色素。
(11)蘋果酸鈣-瓊脂培養(yǎng)基(27℃下培養(yǎng))在無色～淺黃色的生長物上，形成極薄的白色氣生菌絲。沒有發(fā)現(xiàn)可溶性色素。
(12)葡糖(含有濾紙碎片的合成液，27℃培養(yǎng))
生長物無色，氣生菌絲灰白～亮棕灰色。沒有可溶性色素。
(13)明膠穿刺培養(yǎng)在15%單純的明膠培養(yǎng)基中(20℃和24℃下培養(yǎng))，在無色～淺黃生長物上，形成薄的白色氣生菌絲。在萄糖-胨-明膠培養(yǎng)基中(27℃下培養(yǎng))，在淺黃色的生長物上，沒有氣生菌絲形成。在兩種培養(yǎng)基中都未發(fā)現(xiàn)可溶性色素。
(14)脫脂乳(37℃下培養(yǎng))生長物為淺黃色(2gc，亮到中等黃褐色)。即沒有形成氣生菌絲又沒有發(fā)現(xiàn)可溶性色素。
3，生理學(xué)性質(zhì)(1)生長溫度范圍在使用淀粉-無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基(ISP-培養(yǎng)基4)及在20℃，24℃，27℃，30℃，37℃和50℃下培養(yǎng)菌株的試驗(yàn)中，除37℃和50℃外，在其他溫度下都能生長。但生長的最佳溫度范圍約為27℃～30℃。另外，在脫脂乳中，在37℃下可生長。
(2)明膠液化(在15%的單純明膠培養(yǎng)基中，在20℃及24℃下培養(yǎng);在萄糖-胨-明膠培養(yǎng)基中，在27℃下培養(yǎng))在24℃下在15%單純明膠培養(yǎng)基中的大約在培養(yǎng)的第10天，開始液化，在萄糖-胨-明膠培養(yǎng)基中約在培養(yǎng)的第7天開始液化。程度中等。另外，在20℃培養(yǎng)的15%的單純明膠培養(yǎng)基的情況下，約在培養(yǎng)的第18天，出現(xiàn)相當(dāng)弱的液化。
(3)淀粉的水解(淀粉-無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基及淀粉瓊脂培養(yǎng)基都在27℃下培養(yǎng))在淀粉-無機(jī)鹽瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后約第5天，在淀粉-瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后約第7天，開始水解，水解程度中等。
(4)脫脂乳的凝固和胨化(脫脂乳，在37℃下培養(yǎng))培養(yǎng)后約第7天呈現(xiàn)凝固狀，2～3天后完成凝固，然后開始胨化。胨化程度中等。
(5)類黑素色素的形成(胰胨-酵母肉湯，ISP培養(yǎng)基1;胨-酵母-鐵瓊脂培養(yǎng)基，ISP培養(yǎng)基6;酪氨酸-瓊脂培養(yǎng)基，ISP培養(yǎng)基7;分別在27℃下培養(yǎng))在各培養(yǎng)基中類黑素的形成都呈陰性。
(6)各種碳源的利用(Pridham-Gottlieb瓊脂培養(yǎng)基，ISP培養(yǎng)基9;在27℃下培養(yǎng))D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-木糖，D-果糖，蔗糖，肌醇，鼠李糖，棉子糖和D-甘露醇可用于生長。
(7)蘋果酸鈣的液化(蘋果酸鈣瓊脂培養(yǎng)基，在27℃下培養(yǎng))蘋果酸鈣的液化大約發(fā)生在培養(yǎng)的第15天，液化的程度從中等強(qiáng)烈。
(8)硝酸鹽的還原(含0.1%硝酸鉀的胨水溶液，ISP培養(yǎng)基8，在27℃下培養(yǎng))還原反應(yīng)呈陽性。
(9)纖維素的分解(含有濾紙碎片的合成試驗(yàn)溶液，在27℃下培養(yǎng))纖維素的分解呈陰性。
綜上所述的微生物學(xué)特性，MI198-fF29菌株的形態(tài)學(xué)特征在于氣生菌絲形成螺旋形，但是輪生式和孢子囊均未觀察到。此外，成熟孢子鏈具有10個(gè)或更多的孢子，并且孢子表面有龐狀物。在各種培養(yǎng)基中的淺黃色到棕黃色或暗棕色的生長物上茂盛地形成淡灰黃色到亮灰色到亮灰褐色的氣生菌絲?？扇苄陨氐念伾珵閺?qiáng)烈的暗黃色或輕微的淡黃色，或有時(shí)根本不產(chǎn)生顏色。類黑色素的形成呈陰性。淀粉水解活性和蛋白質(zhì)分解活性的程度是適中的。
存在于細(xì)胞壁中的2，6-二氨基庚二酸為LL-型。
鑒于上述微生物學(xué)特性，我們斷定MI198-fF29菌株屬于鏈霉菌屬。當(dāng)根據(jù)MI198-fF29菌株的特性來尋找類似的已知品種時(shí)，吸水鏈霉菌(Streptomyceshygnroscopicus)[文獻(xiàn)1，“國際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)雜志”，第22卷，307頁(1972);文獻(xiàn)2，“放線菌”，S.A.Waksman著，第2卷，230頁(1961)]看來與MI198-fF29菌株相似，同樣，吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種(Strepromyceshygroscopicussubsp.aureolacrimosus)[文獻(xiàn)3，“Milbemycins，一類新的大環(huán)內(nèi)酯抗生素生產(chǎn)生物體及其突變體”;“抗生素雜志”，第36卷，438頁(1983)]所產(chǎn)生的抗生素“Milbemycins”與本發(fā)明的MI198-fF29菌株所產(chǎn)生的MI198物質(zhì)相似，可認(rèn)為該菌株是另一個(gè)類似的品種。然后，我們對MI198-fF29菌株的特性與在如上文獻(xiàn)中所述的吸水鏈霉菌和吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種的特性作了對比研究。這些比較的結(jié)果總結(jié)于下面的表5中。
表5MI198-fF29吸水鏈霉菌氣生菌絲的性質(zhì)形成螺旋形形成螺旋形形成螺旋形孢子表面有龐狀物有龐狀物有龐狀物(光滑＊)氣生菌絲的顏色淡灰黃色～灰棕色～灰棕色～亮灰色～帶有淡棕紅(黃色斑點(diǎn))亮灰棕色色的明灰色氣生菌絲的吸濕性+++生長物的顏色淡黃色～(生長物反淡黃色～棕黃色，面的顏色)深黃棕色暗黃色無色～淡黃色，淡橄欖棕色可溶性色素?zé)o～淡黃色無或微黃色黃色～～暗黃色亮橄欖灰色類黑素的形成在ISP培養(yǎng)基1中---在ISP培養(yǎng)基6中---在ISP培養(yǎng)基7中---淀粉水解++＊+脫脂乳的凝固+-＊+(弱)脫脂乳的胨化++＊+(弱)
明膠液化在15%單純明膠培養(yǎng)基中 + +＊+在葡萄糖-胨-明膠培養(yǎng)基中+硝酸鹽的還原 + -＊+碳源利用＊＊D-葡萄糖++++L-阿拉伯糖+±+D-木糖+±+D-果糖++++蔗糖+-++肌醇+±+鼠李糖++++棉子糖+-+甘露醇++++＊;吸水鏈霉菌按照文獻(xiàn)2＊＊;+，++可利用的，±不肯定，-不可利用的從上面的表5可以看出，MI198-fF29菌株與吸水鏈霉菌和吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種極為相似。但從生長物和可溶性色素獨(dú)特的，強(qiáng)烈的黃色，脫脂乳的凝固，硝酸鹽的還原，蔗糖和棉子糖的利用等方面，可斷定MI198-fF29菌株與吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種更為類似。另一方面，根據(jù)以下特性可區(qū)別吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種與吸水鏈霉菌(1)在氣生菌絲上沉積著金黃色的小水滴，(2)生長物顏色為棕黃色，(3)可用蔗糖和鼠李糖作為碳源，(4)吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種可產(chǎn)生“Milbemycins”，參照上述文獻(xiàn)可找出這些不同點(diǎn)。據(jù)觀察MI198-fF29菌株具有全部上述四個(gè)特征，因此認(rèn)定該菌株為吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種，也就是MI198-fF29。
MI198-fF29菌株已于1987年9月5日貯存在日本工業(yè)科技廳“發(fā)酵研究所”，貯存號為“FERMP-9566”，現(xiàn)按布達(dá)佩斯條約進(jìn)行了貯存，貯存號為“FERMBP-2059”。
在實(shí)施本發(fā)明的第二方面MI198物質(zhì)的生產(chǎn)方法時(shí)，可用已知的培養(yǎng)放線菌屬微生物的普通方法培養(yǎng)產(chǎn)生MI198物質(zhì)的菌株。MI198物質(zhì)主要在所培養(yǎng)的細(xì)胞中產(chǎn)生和積累。在此過程中，最好在適宜的條件下通過培養(yǎng)MI198-fF29菌株來生產(chǎn)MI198物質(zhì)。用于培養(yǎng)的培養(yǎng)基可含有碳源，氮源和無機(jī)鹽等，這些成份通常用于放線菌屬微生物的培養(yǎng)。適用的碳源包括那些已知的材料，諸如甘露糖，葡萄糖，麥芽糖，糊精，淀粉，小米，糖漿和豆油。適用的氮源包括那些已知的材料，諸如大豆粉，肉膏，胨，酵母膏，干酵母，NZ-胺，硝酸鹽，銨鹽等?？捎糜贛I198物質(zhì)的工業(yè)化生產(chǎn)的生產(chǎn)性培養(yǎng)基可含有適宜和谷物(如大米，小麥和大麥)，可以是谷粒，也可以是谷粉，以及適宜的氮源，也可適當(dāng)?shù)丶尤霟o機(jī)鹽。
培養(yǎng)可在有氧條件下進(jìn)行，培養(yǎng)溫度可以在25-30℃范圍內(nèi)，最好是27℃～30℃，培養(yǎng)時(shí)間可為5-14天。
總之，可利用MI198物質(zhì)是穩(wěn)定的中性物且難溶于水而從產(chǎn)生MI198物質(zhì)的微生物培養(yǎng)物中回收MI198物質(zhì)。
從產(chǎn)生MI198物質(zhì)的微生物培養(yǎng)物中回收MI198物質(zhì)最好采用下列方法。將得到的培養(yǎng)物或液體培養(yǎng)基過濾或離心以收集培養(yǎng)的細(xì)胞，用可與水混溶的有機(jī)溶劑(如低級醇類或丙酮)萃取所收集的細(xì)胞，然后蒸餾萃取液以除去有機(jī)溶劑，所得濃縮液與不能與水混溶的有機(jī)溶劑(如乙酸乙酯)，以及水?dāng)嚢杌旌?，所得液體混合物分成水相和含MI198物質(zhì)的有機(jī)相，接著濃縮有機(jī)相至干，得到的殘余物為MI198物質(zhì)的粗產(chǎn)物。在該方法中，得到的干燥殘余物一般含有大約10%的MI198物質(zhì)(為復(fù)合物)，只要產(chǎn)生MI198的微生物已適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行了培養(yǎng)。實(shí)際上為了某些目的可直接應(yīng)用這種干燥殘余物作為粗的MI198物質(zhì)(復(fù)合物)。
為了提高所得粗MI198物質(zhì)(復(fù)合物)的純度，可用非極性烴類(如煤油)進(jìn)一步萃取，和/或通過硅膠柱層析法提純含有粗MI198物質(zhì)的上述殘余物。必要的話，可使這種部分純化的MI198物質(zhì)在低級烷醇(如甲醇和乙醇)中通過裝有分子篩劑(如“葡聚糖凝膠LH20”的柱來進(jìn)一步提純所制得的MI198物質(zhì)的部分純化產(chǎn)物，這樣MI198物質(zhì)純化產(chǎn)物的純度可達(dá)95%或更高(仍以含MI198-Z1物質(zhì)-MI198-Z13物質(zhì)復(fù)合物形式存在)。
為了從MI198物質(zhì)的復(fù)合物或混合物中分離出單獨(dú)存在的各成分物，即MI198-Z1物質(zhì)-MI198-Z13物質(zhì)，可采用高效液相色譜法(例如，在硅烷化硅膠反向柱上用乙腈和水的混合溶劑展開)，該法也可與硅膠薄層層析法結(jié)合使用。
按照本發(fā)明第二方面所述方法的特定實(shí)施方案，可用下述方法獲得含有MI198-Z1物質(zhì)，MI198-Z2物質(zhì)，MI198-Z3物質(zhì)，MI198-Z4物質(zhì)，MI198-Z5物質(zhì)，MI198-Z6物質(zhì)，MI198-Z7物質(zhì)，MI198-Z8物質(zhì)，MI198-Z9物質(zhì)，MI198-Z10物質(zhì)，MI198-Z11物質(zhì)，MI198-Z12物質(zhì)，和MI198-Z13物質(zhì)的復(fù)合物或混合物在含有可同化碳源和可同化氮源的培養(yǎng)基中，在有氧條件下，于25～35℃培養(yǎng)吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種(FERM BP-2059)直到在培養(yǎng)物中產(chǎn)生和積累這些抗生素的復(fù)合物或混合物，然后從培養(yǎng)物中回收這些抗生素的復(fù)合物或混合物，并根據(jù)需要通過一種或多種色譜法將這些抗生素的復(fù)合物或混合物分離成單獨(dú)存在的組成物Z1～Z13。
MI198物質(zhì)可適當(dāng)?shù)夭捎孟铝蟹椒?1)或(2)來測定。
(1)生物測定法將200-300條L階段的線蟲(Caenorhabditis elegans N2(IBR)品系)的幼蟲和成蟲，懸浮于1ml含有0.3%NaCl和0.25%Bacto-胨(Difico公司產(chǎn)品)的水溶液(調(diào)PH至7.0)中并使之于25-27℃自由移動。向該水溶液中，加入適量的含待測MI198物質(zhì)的試驗(yàn)溶液，放置40分鐘后，在立體顯微鏡下計(jì)數(shù)溶液中可自由移動的線蟲數(shù)目。
(2)HPLC測定法對含有待測MI198物質(zhì)的溶液進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析，色譜柱為日本SenshuKagaku公司生產(chǎn)的SSC-ODS-161反相柱(直徑為56mm，高度為10cm，3μ)，展開劑為75%乙腈-水混合溶劑，流速為1.5ml/分鐘。
用紫外線吸收檢測儀測定含MI198物質(zhì)的洗脫液在240nm波長處的吸收百分率，從而可測得MI198-Z物質(zhì)在溶液中的濃度。在上述高效液相色譜條件下，MI198物質(zhì)各組分Z1-Z13的保留時(shí)間(Rt)見下面的表6。
表6MI198-Z物質(zhì)保留時(shí)間的組成成分(分鐘)Z19.12Z211.22Z311.97Z412.56Z511.99Z616.61Z714.10Z820.90Z916.47Z1016.47
Z1117.19Z1217.19Z1319.85色譜柱SSC-ODS-161(裝有硅烷化硅膠的反相色譜柱，為日本SenshuKagaku公司的產(chǎn)品)溶劑75%乙腈-水流速1.5m/分鐘檢測在240nm處用UV檢測如前所述，本發(fā)明的MI198物質(zhì)顯示出抵抗并殺傷寄生于動物，植物或人體內(nèi)的線蟲，尤其是線形動物門的成蟲和幼蟲的高活性，也顯示出抵抗并殺傷害蟲和螨，特別是節(jié)肢動物的成蟲，幼蟲和卵的高活性，但它對哺乳動物的急性毒性較弱。因此，本發(fā)明的MI198物質(zhì)適于用作殺昆蟲劑，抗線形動物門和節(jié)肢動物門害蟲的殺寄生蟲劑和/或驅(qū)蟲劑。
因此，在本發(fā)明的第三方面，提供一種抵抗能夠寄生于人，動物或植物體內(nèi)的節(jié)肢動物門害蟲的成蟲和幼蟲的藥劑，其有效成分為抗生素MI198物質(zhì)，該物質(zhì)以下列通式表示
其中R1為?；Y(jié)構(gòu)式如下
R3，R4，R5和R6各自代表氫原子，甲基或乙基;R2代表甲基，乙基或異丙基。
本發(fā)明第三方面所述的藥劑或殺蟲劑可以組合物的形式存在，有效成分為MI198物質(zhì)，即通式(Ⅰ)化合物，與適用的液體或固體載體組合在一起。
本發(fā)明的第四個(gè)方面是提供一種消滅節(jié)肢動物害蟲的成蟲、幼蟲或卵的藥劑，該藥劑包括由如下通式所表示的作為活性組分的MI198物質(zhì)
其中，R1為具有下式的?；?
(其中，R3、R4、R5和R6各自代表氫原子、甲基或乙基)，R2代表甲基、乙基或異丙基。
本發(fā)明第四方面的藥劑，包括殺螨劑或殺昆蟲劑，可以組合物的形式存在，該組合物中含有作為活性組分的MI198物質(zhì)(即通式(Ⅰ)化合物)，以及適用于該活性組分化合物的固體或液體載體。
本發(fā)明第三和第四方面所提供的藥劑可以含有MI198物質(zhì)的粗產(chǎn)品或純化產(chǎn)品作為活性組分，具體地講，本發(fā)明的藥劑可含有至少一種MI198-Z1物質(zhì)，以及MI198-Z2至MI198-Z13物質(zhì)作為活性組分。這些物質(zhì)可以是粗產(chǎn)品或純化產(chǎn)品?？梢愿鶕?jù)常規(guī)的配制方法，即根據(jù)其用途將MI198物質(zhì)，即MI198-Z1至MI198-Z13物質(zhì)(既可單獨(dú)使用，也可以其混和物形式使用)與適宜的固體或液體載體混合，制備各種制劑。此外，如果需要，可以通過加入其它輔劑將MI198物質(zhì)配制成片劑、粉劑、粗粉劑、顆粒劑、細(xì)顆粒劑、可濕性粉劑、乳油、懸浮液和膠囊劑等。還可以任何純度將MI198物質(zhì)部分提純并以得到的部分純化的MI198物質(zhì)作為活性成分。如果以制得的粗的或部分純化的產(chǎn)品作為活性成分，所要進(jìn)行的提純處理的程度只要能使其以適當(dāng)?shù)幕钚曰衔餄舛冗_(dá)到顯著的殺蟲活性或效力即可。本身為培養(yǎng)基的制劑或是經(jīng)簡單加熱滅菌或干燥的培養(yǎng)基制劑也可經(jīng)口服給藥對家畜或家禽進(jìn)行治療。
適宜的固體載體可以是那些常用的固體載體，例如無機(jī)材料如粘土、滑石、硅石、硅藻土、高嶺土、膨潤土、碳酸鈣和合成硅酸鈣，天然或合成樹脂如curoman樹脂、醇酸樹脂和聚氯乙烯，蠟類如巴西棕櫚蠟、石蠟，以及堅(jiān)果的外殼、大豆粉等。
適宜的液體載體的實(shí)例包括水，醇類如乙醇、異丙醇和1，2-亞乙基二醇，乙二醇醚如乙二醇單苯醚和二甘醇一乙醚，酮類如丙酮、甲基異丁基酮、環(huán)己酮和苯乙酮，醚類如四氫呋喃和二惡烷，芳烴如苯、甲苯、二甲苯和甲基萘，氯代烴如三氯乙烷和四氯化碳，石油餾分如煤油和輕質(zhì)油等。
根據(jù)本發(fā)明的第三和第四方面，可以將表面活性劑摻入殺蟲劑中以改進(jìn)其性能，如改進(jìn)其乳化性，分散性，可濕性和伸展性。為此目的，可以使用一種或幾種離子型或非離子型表面活性劑。適宜的陰離子表面活性劑的實(shí)例包括木素磺酸的鈉鹽或鈣鹽、油酸的鈉鹽或鉀鹽、十二烷基磺酸鈉，十二烷基苯磺酸的鈉鹽或鈣鹽等。
適宜的陽離子表面活性劑的實(shí)例包括高級脂肪酸胺、高級脂肪酸胺與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物等。
適宜的非離子表面活性劑的實(shí)例包括脂肪酸的甘油酯、脂肪酸的蔗糖酯、高級脂族醇與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、高級酯肪酸與環(huán)氧乙烷的縮合產(chǎn)物、環(huán)氧乙烷與1，2-環(huán)氧丙烷的共聚物等。
本發(fā)明第三方面的殺線性蠕蟲的殺蟲劑可以經(jīng)口服作為殺線蟲(特別是寄生于人體或動物的蛔蟲或蠕蟲)的殺寄生蟲藥或殺蠕蟲劑使用。此外，本發(fā)明的第三和第四方面的殺蟲劑可以任何常規(guī)的方式用于農(nóng)業(yè)和園藝。
本發(fā)明的MI198物質(zhì)對下述螨類的成蟲和卵(包括蛛螨)具有很高的殺蟲活性寄生在果樹、蔬菜和花瓣上的葉螨(如雙斑蛛螨)，全爪螨(如歐洲紅螨)和刺螨(如桔赤螨)，以及寄生在動物如家禽和寵物上的硬蜱科、皮刺螨科和疥螨科螨。此外，MI198物質(zhì)還對蚜蟲、鱗翅目害蟲的幼蟲、黃麻根瘤線蟲和phizoglyphus螨(如球莖根螨)等具有很高的殺蟲活性。此外，MI198物質(zhì)還對寄生在動物和家禽體外的外寄生害蟲如羊鼻蠅(Oestrus)、絲光綠蠅(Lucilia)、牛皮蠅(Hypoderma)、虻(Gautrophilus)、蚤和虱具有很高的殺蟲活性，對有害環(huán)境的居家害蟲如蟑螂、德國蟲和家蠅也有很高的殺蟲活性。
此外，本發(fā)明的MI198物質(zhì)對可侵襲動物、家禽和寵物如豬、綿羊、山羊、牛、馬、狗、貓和雞的寄生害蟲具有較高的殺寄生蟲活性，這些寄生蟲屬于下列屬血予線蟲屬;結(jié)節(jié)線蟲屬;類圓線蟲屬(Strongylondes);毛圓線蟲屬;(Trichostrongylus);夏氏線蟲屬;異刺線蟲屬;胃線蟲屬;鞭便蟲屬;弓蛔蟲屬;細(xì)頸屬;圓線蟲屬;雞蛔蟲屬;庫柏絲蟲屬;Trichonema;尖尾線蟲屬;蛔蟲屬;網(wǎng)尾線蟲屬;鉤口線蟲屬;Bunostomum;毛細(xì)線蟲屬;鉤蟲屬;弓蛔線蟲屬;和Parascaris。
還有，本發(fā)明的MI198物質(zhì)對各種能感染人類、侵襲人的消化道的各種寄生物具有較高的殺寄生蟲活性，這些寄生蟲屬于下列屬鉤口線蟲屬;
板口線蟲屬;
蛔蟲屬;
類圓線蟲屬;
毛線蟲屬;
毛細(xì)線蟲屬;
鞭蟲屬;和蟯蟲屬。
當(dāng)本發(fā)明的MI198物質(zhì)在農(nóng)業(yè)或園藝上作為殺昆蟲劑、殺螨劑或殺線蟲劑使用時(shí)，可用任何常規(guī)的方法將其配制成可濕性粉劑、乳油、顆粒劑、片劑或粉塵劑等。可以用水將可濕性粉劑和乳油稀釋，制備含有有效量(如5-100ppm)活性MI198物質(zhì)的可噴灑溶液，然后將其噴灑在被感染的植物和/或噴灑在植物生長的土壤上。作為殺線蟲劑時(shí)，可將顆粒劑和片劑直接施用到被感染的植物生長的土壤里。
當(dāng)將MI198物質(zhì)作為動物(包括人)和家禽的殺寄生蟲藥時(shí)，最好以含有有效量(如0.01-0.5%(重量)]MI198物質(zhì)的口服液、片劑、丸劑或膠囊劑的形式口服。MI198的適宜劑量將隨需治療的動物的種類、寄生物感染的類型、感染的程度以及其它各種因素而變化，但口服時(shí)，0.01-100毫克/公斤劑量的MI198物質(zhì)對于服用者來說是可以接受的。局部施用MI198物質(zhì)也是可行的，例如將含有有效量的MI198物質(zhì)的乙醇或二甲亞砜溶液直接噴灑在動物的表皮上。
本發(fā)明的另一方面是提供一種新的微生物吸水鏈霉菌aureolocrimosus亞諱I198-fF29(FERMBP-2059)。
本發(fā)明的另一方面是提供將MI198物質(zhì)用于殺寄生蟲醫(yī)藥組合物或獸藥組合物中的用途。
現(xiàn)通過下述實(shí)施例和試驗(yàn)實(shí)例說明本發(fā)明。
實(shí)施例1將鉑環(huán)量的吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種MI198-fF29菌株(FERMBP-2059)從其瓊脂斜面培養(yǎng)基中接種到容積為1升的盛有200毫升經(jīng)過滅菌的含1%可溶性淀粉和0.2%酵母膏的培養(yǎng)基(PH值調(diào)節(jié)至7.0)的Ruex玻瓶中，然后在30℃下靜止培養(yǎng)13天。
在25個(gè)Ruex瓶中，用上述方法于同樣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)MI198-fF29菌株。將這樣得到的肉湯匯集在一起，過濾收集溫育的微生物菌絲。將菌絲與300毫升乙醇混合，即使乙醇的體積為濕細(xì)胞體積的2倍，然后將細(xì)胞的乙醇懸浮液攪拌30分鐘，隨后過濾，以濾液的形式得到含MI198物質(zhì)的乙醇萃取液。
將上述萃取過程重復(fù)兩次。將乙醇溶液(萃取液)合并，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮，然后用300毫升水稀釋，在用一蒸發(fā)器中再進(jìn)一步濃縮至體積為200毫升，由此得到乙醇?xì)埓媪啃∮?%的濃縮液。然后，將該濃縮液與加入的150毫升乙酸乙酯一起搖動，使所有的油性物質(zhì)溶解并轉(zhuǎn)移到乙酸乙酯層中。分離出乙酸乙酯層。用50毫升乙酸乙酯進(jìn)一步萃取余下的水層，將得到的乙酸乙酯萃取液與前面分離出來的乙酸乙酯層合并。用無水硫酸鈉干燥合并后的乙酸乙酯溶液，然后蒸發(fā)干燥，得到450毫克含MI198物質(zhì)的粗產(chǎn)品。以檢定的MI198-Z1物質(zhì)的檢定含量為基準(zhǔn)計(jì)算，該粗產(chǎn)品含7%MI198物質(zhì)，MI198-Z1物質(zhì)為MI198物質(zhì)(復(fù)合物)的主要成分。
當(dāng)使用47克硅膠的柱子(Kiesel膠60，MerckCo.的產(chǎn)品，用氯仿裝填)進(jìn)行柱色譜分離時(shí)，將具有較低殺線蟲活性的副餾分洗脫出并棄掉。隨后，洗脫出含有需要物質(zhì)的主餾分，其總體積為35毫升，這一餾分是在445毫升洗脫液收集體積與410毫升洗脫液收集體積之間取得的。當(dāng)用氯仿-甲醇(10∶1)溶劑體系進(jìn)一步進(jìn)行柱分離時(shí)，得到的是具有較低殺線蟲活性的親水餾分。
將上述洗脫液中的主餾分濃縮干燥，得到76毫克固體產(chǎn)物。根據(jù)檢定的MI198-Z1物質(zhì)的量，計(jì)算得到該固體產(chǎn)物含45%MI-198物質(zhì)。
實(shí)施例2將鉑含量的MI198-fF29菌株從其瓊脂斜面培養(yǎng)基中接種到100個(gè)容積為500毫升、每瓶中盛有50毫升含1%葡萄糖、1%淀粉、0.75%肉汁、0.5%酵母膏和0.3%氯化鈉的培養(yǎng)基(PH＝7.0)的振搖玻瓶中，在20℃下振搖培養(yǎng)10天。過濾合并后的培養(yǎng)基肉湯收集微生物菌絲。將菌絲與1升的異丙醇(體積為濕菌絲的3倍)一起攪拌1小時(shí)后，將混合物吸濾，保存濾液。將該濾液，即異丙醇萃取液，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮，然后與一定體積的水混合，再濃縮，得到300毫升混合物，該混合物含有水和焦油狀物質(zhì)。將該混合物與200毫升乙酸丁酯一起振搖進(jìn)行萃取后，將混和液濃縮。分離于乙酸丁酯中的萃取液，然后用同樣的方法用150毫升乙酸丁酯再一次萃取殘余的焦油狀物質(zhì)。將兩次得到的乙酸丁酯萃取液(萃取層)合并，蒸發(fā)干燥。得到860毫克固體粗產(chǎn)物，如以滴定檢測的MI198-Z1物質(zhì)的量計(jì)算的話，該粗產(chǎn)物含9%MI198物質(zhì)。
實(shí)施例3將鉑含量的MI198-fF29菌株從其瓊脂斜面培養(yǎng)基中接種到2個(gè)體積為2升、每瓶中盛有400毫升含1%甘露糖、1%糊精、0.2%酵母膏、0.5%奶粉、0.2%氯化鈉和0.1%硫酸鎂(7H2O)的培養(yǎng)基(PH＝7.0)的振搖玻瓶中，在28℃下振搖培養(yǎng)5天。將得到的種子培養(yǎng)移到盛有20升同樣組成的培養(yǎng)基的容積為30升的瓶培養(yǎng)桶中，在通氣條件下于28℃進(jìn)行好氣培養(yǎng)7天。
將得到的培養(yǎng)基肉湯過濾，收集微生物菌絲。將菌絲與2.5升異丙醇(其體積為濕細(xì)胞的3倍)混和后，攪拌1小時(shí)以進(jìn)行萃取，將該混和物吸濾，得到濾液。將濾液，即異丙醇中的萃取液，在旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器中濃縮，用水稀釋，再濃縮，最后得到600毫升濃縮混合物。向濃縮混合物中分批加入500毫升乙酸丁酯進(jìn)行萃取，隨后分離乙酸丁酯相(萃取液)。用無水硫酸鈉干燥水相與乙酸丁酯相內(nèi)表面之間的乳化相層，得到澄清的宜岫□ゲ恪＝幸宜岫□ゲ悖ㄝ腿∫海┖喜?，蒸发干枣| 由此得到1.95克含有MI198物質(zhì)的棕色粗產(chǎn)物，如果以滴定檢測的MI198-Z1物質(zhì)計(jì)算的話，該產(chǎn)物含有7%MI198物質(zhì)。向該粗產(chǎn)物中加入200毫升石油醚，攪拌2小時(shí)進(jìn)行萃取。將固體殘余物與100毫升石油醚一起再攪拌1小時(shí)，將石油醚中的萃取液合并，蒸發(fā)干燥。
得到1.05克作為殘余物的棕色焦油狀物質(zhì)，如果以滴定檢測的MI198的含量計(jì)算的話，該焦油狀物質(zhì)含10%MI198。
實(shí)施例4
用硅膠柱(23克Kiese膠60F254，用甲苯裝填)對實(shí)施例1中通過濃縮至干從硅膠柱上洗脫的洗脫液主要餾分而得到的76克固體產(chǎn)物進(jìn)行柱色譜分離，用甲苯-丙酮(4∶1)混合溶劑作展開劑展開。
按5毫升1份收集硅膠柱的洗脫液。對每份餾分進(jìn)行硅膠薄層色譜分離。在該薄層色譜硅膠板上，用紫外線照射，以檢測出顯色明顯的物質(zhì)。檢測發(fā)現(xiàn)，按照洗脫順序，每種活性餾分分別含有28-脫氧-25-甲基milbemycinB、28-脫氧-6-羥基-25-甲基milbemycinB、milbemycinα2，MI198-Z物質(zhì)的復(fù)合物(11.8毫克)和milbemycinβ。將含有MI198-Z物質(zhì)復(fù)合物的餾分濃縮，得到含有MI198-Z1至Z13物質(zhì)復(fù)合物的黃色油狀產(chǎn)物。
為了從粗MI198物質(zhì)復(fù)合物(即上述黃色油狀物)中分離出Z1至Z13成分，用兩塊硅膠板(Kiesel膠60 F254板，每塊板的尺寸為20厘米×20厘米×0.5毫米，西德Merck Co.的產(chǎn)品)進(jìn)行制備性硅膠薄層色譜分離(用己烷-乙酸乙酯(3∶1)混合溶劑展開3次)，得到6.8毫克MI198-Z1。
在上述制備性硅膠薄層色譜分離中，沒有分離出MI198-Z2、MI198-Z4和MI198-Z物質(zhì)。因此，用反相色譜柱(SSC-ODS-762硅烷化硅膠柱，日本Senshu Kagaku Co.的產(chǎn)品)對含有粗MI198物質(zhì)復(fù)合物的黃色油狀產(chǎn)物進(jìn)行高性能液相色譜分離和提純(以75%乙腈-水作展開劑展開，用240nm紫外線檢測)。將MI198-Z2、MI198-Z3和MI198-Z4物質(zhì)按上述順序分別從洗脫液的不同餾分中分離出來。將每一餾分濃縮至干分別得到1.1毫克MI198-Z2、2.3毫克MI198-Z3和0.5毫克MI198-Z4。
實(shí)施例5按照上述實(shí)施例4的柱色譜分離步驟，在更大的規(guī)模上，將實(shí)施例1中得到的洗脫液的主餾分在硅膠柱上進(jìn)行色譜分離，得到835毫克含有MI198-Z物質(zhì)復(fù)合物的粗產(chǎn)物，該粗產(chǎn)物為黃色油狀。對該黃色油狀產(chǎn)物(含有粗MI198物質(zhì)復(fù)合物)用反相色譜柱(SSC-ODS-762柱，Senshu Kagaku Co.產(chǎn)品)進(jìn)行高性能液相色譜分離(以75%乙腈-水作展開劑展開，用2nm紫外線檢測)，再用硅膠板(Kiesel膠60 F254板，尺寸為20厘米×20厘米×0.5毫米，Merck Co.的產(chǎn)品)進(jìn)行制備性硅膠薄層色譜分離(以己烷-乙酸乙酯(3∶1)作展開劑展開3次)，以從粗MI198物質(zhì)復(fù)合物中分離出次要成分，即MI198-Z5至MI198-Z13。
結(jié)果，得到8.1毫克MI198-Z5、2.8毫克MI198-Z6、3.9毫克MI198-Z7、1.4毫克MI198-Z8、4.3毫克MI198-Z9、4.1毫克MI198-Z10、1.8毫克MI198-Z11、3.3毫克MI198-Z12和5.0毫克MI198-Z13。
實(shí)施例6將大約20克脫殼的、已用水通霄浸泡而被水充分浸漬的稻?；螓溋Ｖ糜谌莘e為100毫升的錐形瓶中，然后用棉塞密封，于120℃下在釜中消毒3次，每次30分鐘。
冷卻至室溫后，將1毫升MI198-fF29菌株(FERMBP-2059)的孢子懸浮液接種到已消毒的稻粒或麥粒上，該懸浮液是通過在1毫升蒸餾水中懸浮鉑環(huán)量的MI198-fF29株的斜面培養(yǎng)基而制備的。將稻?；螓溋Ｅc上述懸浮液充分混合，由此均勻地接種MI198-fF29菌株的菌絲體。接種后，在27℃下靜止溫育12～15天，使菌絲很好地生長以生成芽孢。
得到的培養(yǎng)物，即MI198-fF29菌株已經(jīng)生長到生成芽孢的階段的接種過的稻粒或麥?？勺鳛闅⒓纳x藥被動物口服。如果需要，們翱 用高頻電磁波照射滅菌。此外，可用適宜的有機(jī)溶劑如丙酮、甲醇和乙醇萃取該培養(yǎng)物，制備含MI198物質(zhì)的萃取液，然后濃縮至干燥。這樣得到的固體物可作為活性組分配制在農(nóng)業(yè)制劑或獸藥制劑中。
用下述試驗(yàn)例說明MI198物質(zhì)的生物活性。
試驗(yàn)例1用水將MI198-Z物質(zhì)在甲醇中的0.1%溶液稀釋100倍，制備含有10mcg/ml的MI198-Z物質(zhì)的溶液。然后，將適當(dāng)不同量的MI198-Z物質(zhì)溶液加到1毫升含活性Caenorhabditiselegans線蟲的水懸浮液中，輕微振蕩后，于26℃下靜置40分鐘。在立體顯微鏡下，計(jì)數(shù)處理后仍有活動能力的線蟲數(shù)目和試驗(yàn)的線蟲總數(shù)。計(jì)算了仍有活動能力的線蟲數(shù)占試驗(yàn)線蟲總數(shù)的百分比(即活動線蟲的游動率(%))。兩次重復(fù)試驗(yàn)的平均值示于表7。為了對比，以相同的方式試驗(yàn)了milbemycins。
測定了有活動能力的存活線蟲數(shù)占試驗(yàn)線蟲總數(shù)的百分比，即活動線蟲的死亡率(%)。兩個(gè)重復(fù)試驗(yàn)的平均值示于下面表7。為便于對比，對milbemycins是以相同的方式試驗(yàn)的。
表7
試驗(yàn)例2用水稀釋含有0.1%MI198物質(zhì)樣品(含有58%MI198-Z1、10%MI198-Z2、24%MI198-Z3和3%MI198-Z4的復(fù)合物)的丙酮溶液，制備如表8所示含有不同預(yù)定濃度的MI198-Z1組分的試驗(yàn)溶液。
另外，將其一片菜豆葉切成3cm直徑的園片，面朝下放在一個(gè)9cm直徑的玻璃盤中的瓊脂膠層上。將10只雌性成年普通紅葉螨(Tetranychusurticae)置于葉片上。然后以2ml/cm的速率噴灑試驗(yàn)溶液。于25℃放置48小時(shí)后，測定擊倒的螨的百分比，三次重復(fù)試驗(yàn)的平均值示于表8。
表8MI198-Z1的濃度 0.005 0.01 0.025 0.05 0.1 0.25(mcg/ml)擊倒螨的%31394853100100為了對比，以相同的方式試驗(yàn)了市場可供的殺螨劑“Polynartin”。當(dāng)以10mcg/ml的濃度施用Polynactin時(shí)，擊倒的螨的百分比為93%。
試驗(yàn)例3用水稀釋與試驗(yàn)例2所用相同的含有0.1%MI198物質(zhì)的丙酮溶液，制備如表9所示含有不同預(yù)定濃度的MI198-Z1組分的試驗(yàn)溶液。另外，將一片菜豆葉切成3cm直徑的圓片，面朝下放在一個(gè)9cm直徑的玻璃盤中的瓊脂膠層上。將10只雌性成年普通紅葉螨(Tetranychusurticae)置于葉片上并使其產(chǎn)卵。24小時(shí)后，將成年螨移開，以2ml/cm2的速率噴灑試驗(yàn)溶液。于25℃保持9天后，計(jì)算死卵和死幼蟲的數(shù)目。然后計(jì)算卵的死亡率和幼蟲死亡率。試驗(yàn)結(jié)果列于表9。
表9MI198-Z1的濃度 0.5 1.0卵死亡率(%)563幼蟲死亡率(%)00為了對比，同時(shí)以相同的方式試驗(yàn)了“Polynactin”，其濃度為10mcg/ml，測定的卵死亡率和幼蟲死亡率分別為100%和0%。
試驗(yàn)例4用含有少量展開劑的水溶液稀釋與例2所孟嗤暮 .1%MI198物質(zhì)的丙酮溶液，制備如表10所示含有不同預(yù)定濃度的MI198-Z1組分的試驗(yàn)溶液。同時(shí)，將10只成年雌性普通紅葉螨(Tetranychus urticae)置于并使其停留在盆栽菜豆植物上。1天以后，以每兩盆15ml的量噴灑試驗(yàn)溶液，并將處理過的植物置于玻璃溫室中。噴灑處理3天以后，計(jì)算成年螨的死亡率。噴灑處理12天后，根據(jù)下式計(jì)算子代螨的控制率(即處理后成長起來的成年螨的控制率(%))子代螨控制率(%)＝(1- (處理區(qū)域成年螨的數(shù)量)/(未處理區(qū)域成年螨的數(shù)量) )×100%表10列出了試驗(yàn)結(jié)果。
表10MI198-Z1的濃度 0.01 0.03 0.1 0.3 1.0(mcg/ml)成年螨死亡率4483100100100子代螨控制率39476379100
為了對比，同相同的方法同時(shí)試驗(yàn)含有40%活性化合物、呈乳油形式的市場可供殺螨劑“kelthan”。當(dāng)以活性化合物濃度為10mcg/ml施用時(shí)，成年螨的死亡率和子代螨的控制率分別為39%和32%。
試驗(yàn)例5在裝有400ml水的玻璃瓶中放入20只紅家蚊(Culex pipiens pollens)幼蟲，然后加入表11所示給定體積的0.1%MI198-Z物質(zhì)的丙酮溶液或通過用水稀釋該丙酮溶液制成的含不同預(yù)定濃度MI198-Z1成分的試驗(yàn)水溶液。使所得混合物于20-25℃靜置1天后，計(jì)算蚊幼蟲的死亡率。試驗(yàn)結(jié)果示于表11。
表11
為了對比，以同樣的方法試驗(yàn)了市場可供的殺蟲劑“Ivomec”，其濃度分別為0.01mcg/ml、0.1mcg/ml和1mcg/ml，蚊幼蟲的死亡率分別為50%、90%和100%。
試驗(yàn)例7本例說明MI198物質(zhì)對狗胃寄生蠕蟲(Toxocaracaris)的驅(qū)蟲活性。
根據(jù)其EPG值(即每克排泄物中排出的蟲卵數(shù))，將自發(fā)感染胃寄生蠕蟲的幼狗分為不同的組，每組4只。
采用胃探示器，強(qiáng)制使這些狗口服50%MI198-Z1物質(zhì)的乙醇溶液，劑量為每公斤體重0.1mg和0.03mg活性物質(zhì)。自給藥1周前至殺死處理過的狗，連續(xù)計(jì)算排泄物中排出的蠕蟲數(shù)和排泄物中的蟲卵數(shù)。給藥7天后將狗殺死并進(jìn)行解剖，計(jì)算小腸中殘存的活蟲數(shù)。根據(jù)下式計(jì)算驅(qū)除寄生蟲的百分比以評價(jià)驅(qū)蟲活性驅(qū)蟲百分比＝ (排出的蟲的總數(shù))/((排出的蟲的總數(shù))+(存留的蟲數(shù))) ×100%試驗(yàn)結(jié)果示于下面表12。
表12試驗(yàn)物質(zhì)劑量(mg/kg)排出的蟲存留的蟲數(shù)驅(qū)蟲百分比的總數(shù)MI198-Z10.1 31 0 100MI198-Z10.03 30 2 93.8未處理-2404.8試驗(yàn)例8本例說明MI198物質(zhì)對雞胃寄生蟲(Ascaridiagalli)的驅(qū)蟲活性。
將人工感染胃寄生蟲的雞分為不同的組，每組5只。采用胃探示器強(qiáng)制使各組雞口服含50%MI198-Z1的乙醇溶液，劑量為每公斤體重0.1mg和0.03mg。在給藥至殺死經(jīng)處理過的雞的這段期間內(nèi)，計(jì)算排泄物中排出的蠕蟲數(shù)。給藥7天后將雞殺死并解剖。計(jì)算其小腸中殘存的蠕蟲數(shù)。用試驗(yàn)例7所給的計(jì)算式計(jì)算排出的寄生蟲的百分比，評價(jià)驅(qū)蟲活性。
表13試驗(yàn)物質(zhì)劑量(mg/kg)排出的蟲存留的蟲數(shù)驅(qū)蟲百分比的總數(shù)MI198-Z10.1 112 0 100MI198-Z10.03 62 20 75.6未處理-258223，4
圖1是在乙醇中測得的MI198物質(zhì)的UV吸收光譜;圖2是在KBr中研片測得的MI198-Z1物質(zhì)的IR吸收光譜;圖3是室溫下在氘氯仿中測量的MI198-Z1物質(zhì)的HNMR譜(400MHz)。
權(quán)利要求
1.抗生素MI198，該物質(zhì)是由下列通式代表的化合物
其中R1是具有下式的?；?br> 式中R3、R4、R5和R6各自為氫原子、甲基或乙基；R2是甲基、乙基或異丙基。
2.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3和R4同時(shí)為甲基、R2是甲基的抗生素MI198-Z1。
3.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3是甲基、R4是氫原子、?；鵕1為反式且R2是甲基的抗生素MI198-Z2-反式。
4.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3是原子、R4是甲基、酰基R1為順式且R2是甲基的抗生素MI198 Z2-順式。
5.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3和R4同時(shí)為甲基、R2是乙基的抗生素MI198-Z3。
6.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3和R4同時(shí)為甲基、R2是異丙基的抗生素MI198-Z4。
7.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R5和R6同時(shí)為甲基、R2是甲基的抗生素MI198-Z5。
8.權(quán)利要求1的化合物齷銜鍤峭ㄊ劍á瘢┧鏡幕銜鎦蠷5和R6同時(shí)為甲基、R2是乙基的抗生素MI198-Z6。
9.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3是乙基、R4是甲基、?；鵕1為反式且R2是甲基的抗生素MI198-Z7-反式。
10.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3是乙基、R4是甲基、?；鵕1為順式且R2是甲基的抗生素MI198-Z7-順式。
11.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3是乙基、R4是甲基、?；鵕1為反式且R2是乙基的抗生素MI198-Z8-反式。
12.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3是乙基、R4是甲基、?；鵕1為順式且R2是乙基的抗生素MI198-Z8-順式。
13.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R5是乙基、R6是甲基、R2是甲基的抗生素MI198-Z9。
14.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R5是乙基、R6是甲基、R2是乙基的抗生素MI198-Z10。
15.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3和R4是乙基、R2是甲基的抗生素MI198-Z11。
16.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R3和R4是乙基、R2是乙基的抗生素MI198-Z12。
17.權(quán)利要求1的化合物，所述化合物是通式(Ⅰ)所示的化合物中R5和R6是乙基、R6是甲基的抗生素MI198-Z13。
18.權(quán)利要求1所述的具有通式(Ⅰ)的抗生素MI198的生產(chǎn)方法，包括在厭氧條件下于含有可同化的碳源和可同化的氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)可產(chǎn)生MI198物質(zhì)的鏈霉菌屬菌株，直至培養(yǎng)基中產(chǎn)生并聚集可觀量的MI198物質(zhì)，然后從培養(yǎng)基中收集抗生素MI198，它是一種通式(Ⅰ)所示的化合物(其中R1和R2如權(quán)利要求1所定義)
19.權(quán)利要求18的方法，其中可產(chǎn)生MI-198物質(zhì)的菌株是吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種MI198-fF29菌株(FERM BP-2059，日本保存單位“Fermentation Research Institnte”的保存號)。
20.權(quán)利要求18的方法，其中吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種MI198-fF29菌株(FERM BP-2059)在厭氧條件下于25-35℃培養(yǎng)5-14天。
21.權(quán)利要求18的方法，其中通過在厭氧條件下于25-35℃在含有可同化的碳源和可同化的氮源的培養(yǎng)基中培養(yǎng)吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種(FERM BP-2059)直至在培養(yǎng)基中產(chǎn)生并聚集抗生素混合物，然后從培養(yǎng)基中回收抗生素混合物，得到含有MI198-Z1、MI198-Z2、MI198-Z3、MI198-Z4、MI198-Z5、MI198-Z6、MI198-Z7、MI198-Z8、MI198-Z9、MI198-Z10、MI198-Z11、MI198-Z12和MI198-Z13抗生素物質(zhì)的混合物，必要時(shí)，可以使用一種或多種色譜法將所得抗生素混合物分離成單一的抗生素物質(zhì)。
22.抵抗可寄生于人體、動物或植物的線形動物門的成蟲和幼蟲的藥劑，含有抗生素MI-198作為活性成分，該物質(zhì)是由下列通式表示的化合物
其中R1是具有下式的?；?br> 式中R3、R4、R5和R6各自為氫原子、甲基或乙基;R2是甲基、乙基或異丙基。
23.權(quán)利要求22的藥劑，該藥劑是一種含有作為活性成分的MI198物質(zhì)(即通式(Ⅰ)的化合物)以及液體或固體載體的藥物組合物。
24.抵抗節(jié)肢動物的成蟲、幼蟲或卵的藥劑，含有作為活性成分的MI198物質(zhì)，該物質(zhì)是由下列通式表示的化合物
其中R1是具有下式的?；?br> 式中R3、R4、R5和R6各自為氫原子、甲基或乙基;R2是甲基、乙基或異丙基。
25.權(quán)利要求24的藥劑，該藥劑是一種含有作為活性成分的MI198物質(zhì)(即通式(Ⅰ)的化合物)以及液體或固體載體的藥物組合物。
26.一種新的微生物，即吸水鏈霉菌aureolacrimosus亞種MI198-fF29菌株，該菌株作為培養(yǎng)物保存在“Fermentation Resesrch Institute”(FERM BP2059)，其特征在于該菌株能產(chǎn)生抗生素MI198物質(zhì)，該物質(zhì)是權(quán)利要求1限定的通式(Ⅰ)所示的化合物。
全文摘要
本發(fā)明提供一類抗生物質(zhì)，分別被命名為MI198—Z
文檔編號A01N43/90GK1032815SQ8810916
公開日1989年5月10日 申請日期1988年10月9日 優(yōu)先權(quán)日1987年10月9日
發(fā)明者田中亙, 土橋和之, 長繩博, 浜田雅, 竹內(nèi)富雄, 佐藤圣 申請人:財(cái)團(tuán)法人微生物化學(xué)研究會, 北化學(xué)工業(yè)株式會社