本發(fā)明屬于珙桐培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種珙桐冬芽快速繁殖的培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

珙桐(gǒngtóng)為落葉喬木?？缮L到15～25米高，葉子廣卵形，邊緣有鋸齒，色花奇美，是1000萬年前新生代第三紀(jì)留下的孑遺植物，在第四紀(jì)冰川時期，大部分地區(qū)的珙桐相繼滅絕，只有在中國南方的一些地區(qū)幸存下來，成為了植物界今天的“活化石”，被譽(yù)為“中國的鴿子樹”，又稱“鴿子花樹”、“水梨子”，野生種只生長在中國西南四川省和中部湖北省和周邊地區(qū)，因此，珙桐已被列為國家一級重點(diǎn)保護(hù)野生植物，為中國特有的單屬植物，屬孑遺植物，也是全世界著名的觀賞植物，是國家一級保護(hù)植物。

由于珙桐野生體僅存在于中國西南四川省和中部湖北省和周邊地區(qū)，數(shù)量稀少，因此，需要建立一種人工快速繁殖的培養(yǎng)方法來培育珙桐，以達(dá)到保護(hù)和商業(yè)化利用的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中的上述不足，本發(fā)明提供一種珙桐冬芽快速繁殖的培養(yǎng)方法，以解決現(xiàn)有人工繁殖珙桐速度慢的問題。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種珙桐冬芽快速繁殖的培養(yǎng)方法，包括：

(1)采集1～2年生珙桐未萌發(fā)的冬芽為外植體材料；

(2)消毒滅菌；

將冬芽置于濃度為3～5g/ml的洗衣粉溶液中浸泡2～3min，修整冬芽，使其僅剩0.3～0.5cm的芽端，用75％乙醇浸泡10～30s，再用0.01％升汞溶液浸泡1～7min；或僅使用0.01％升汞溶液浸泡冬芽1～8min；

(3)冬芽初代培養(yǎng)

向wpm培養(yǎng)基中加入naa、6-ba、ga3和ac，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph值為5.8～6.0，于120～125℃滅菌20～25min，冷卻至室溫，備用；然后將步驟(2)中消毒后的冬芽接種至培養(yǎng)基中，于24±1℃、2000～2100lx條件下，光照8～10h/d，培養(yǎng)至冬芽萌發(fā)為帶芽莖段；其中，naa加入量為0～0.4mg/l、6-ba加入量為2.0～4.0mg/l、ga3加入量為0～2.0mg/l、ac加入量為1.0～1.5g/l；

(4)增殖培養(yǎng)

將步驟(3)所得產(chǎn)物接種至含有naa、6-ba和ac的wpm培養(yǎng)基中，于24±1℃、2000～2100lx條件下，光照8～10h/d，增殖培養(yǎng)，得到珙桐苗；其中，wpm培養(yǎng)基中naa加入量為0.2～0.6mg/l、6-ba加入量為1.0～4.0mg/l、ac加入量為0.5～1.5g/l；

(5)壯苗培養(yǎng)

用含有naa、6-ba、ga3和ac的wpm培養(yǎng)基，于24±1℃、2000～2100lx條件下，光照8～10h/d，培育步驟(4)中所得珙桐苗；其中，naa加入量為0.5～1.5mg/l、6-ba加入量為0.2～1.0mg/l、ga3加入量為0.5～1.5mg/l、ac加入量為0.5～1.5g/l；

(6)生根培養(yǎng)

選取步驟(5)中生長狀態(tài)良好的珙桐苗，采用含有iba、6-ba和ac的white培養(yǎng)基，于24±1℃、2000～2100lx條件下，光照8～10h/d，培養(yǎng)至生根；其中，iba的加入量為2.0～4.0mg/l、6-ba的加入量為0～1.5mg/l、ac的加入量為0.5～1.5g/l；

(7)煉苗移栽

在生根培養(yǎng)后7～15d，對珙桐苗進(jìn)行閉罐煉苗15～2d，遮陰度為50％～70％，再開罐煉苗3～7d，然后將珙桐苗移出，消毒滅菌，移栽至經(jīng)消毒處理的基質(zhì)中，澆足定根水，每5d噴施一次營養(yǎng)液；其中，基質(zhì)為草炭、珍珠巖和蛭石的混合物，草炭、珍珠巖和蛭石重量比為1～2:0.5～1:0.5～1；

(8)移栽后按常規(guī)方法進(jìn)行水肥管理，培育得到珙桐樹苗。

進(jìn)一步地，步驟(3)中wpm培養(yǎng)基中naa加入量為0.3mg/l、6-ba加入量為2.0mg/l、ga3加入量為2.0mg/l、ac加入量為1.5g/l。

進(jìn)一步地，步驟(4)中所述wpm培養(yǎng)基中naa加入量為0.4mg/l、6-ba加入量為4.0mg/l、ac加入量為1.5g/l。

進(jìn)一步地，步驟(5)中用于壯苗培育的wpm培養(yǎng)基中naa加入量為1.0mg/l、6-ba加入量為1.0mg/l、ga3加入量為1.0mg/l、ac加入量為1.0g/l。

進(jìn)一步地，步驟(6)中所述用于生根培育的white培養(yǎng)基中iba的加入量為3.0mg/l、6-ba的加入量為1.0mg/l、ac的加入量為1.0g/l。

進(jìn)一步地，步驟(7)中基質(zhì)中草炭、珍珠巖和蛭石的重量比為2:1:1。

進(jìn)一步地，步驟(7)中基質(zhì)的消毒過程如下：

將基質(zhì)置于0.1mpa的滅菌鍋中，保壓20～30min；或者采用5％的福爾馬林或0.3％的硫酸銅溶液淋透基質(zhì)，再以塑料布覆蓋7d。

進(jìn)一步對，步驟(7)中珙桐苗的消毒過程如下：

采用0.1％～0.3％的高錳酸鉀溶液或500倍多靈菌溶液清洗珙桐苗。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、由于冬芽外面存在有很厚的芽鱗保護(hù)，采用常規(guī)方法對冬芽進(jìn)行消毒時，會存在消毒不徹底，導(dǎo)致組培過程中染菌的問題，所以基本上沒有人使用珙桐冬芽來進(jìn)行珙桐的組培繁殖；因此，本發(fā)明方法在對冬芽進(jìn)行消毒除菌時，先使用濃度為3～5g/ml的洗衣粉浸泡，除去冬芽上的泥土等雜質(zhì)后，再使用75％乙醇和0.01％升汞處理，消毒方便，對芽的傷害低。

2、采用ph值為5.8～6.0的培養(yǎng)基，在2000～2100lx下對冬芽進(jìn)行初代培養(yǎng)，可促使冬芽快速的萌發(fā)為帶芽莖段，完成破休眠，并且，在此條件下，冬芽具有最大的萌發(fā)量和萌發(fā)效率。

3、根據(jù)冬芽初代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基組分及配比，在冬芽具有最大萌發(fā)效率和萌發(fā)量的前提下，增殖培養(yǎng)基與其相比在組分上減少了赤霉素，并調(diào)整了相應(yīng)組分的配比，可在保證具有最大增殖效率的前提下，進(jìn)一步的促進(jìn)冬芽萌發(fā)的莖段的生長，提升珙桐苗的成活率。

4、由于通過增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)后，即可初步得到珙桐苗，因此，在選用壯苗培養(yǎng)基組分時，以增殖培養(yǎng)基的組分為參考，壯苗培養(yǎng)基和增殖培養(yǎng)基的組分相比，增加了赤霉素，調(diào)整其中各組分配比，以使壯苗效果達(dá)到最大化。

5、采用本發(fā)明過程中提及的方法進(jìn)行煉苗，可使珙桐苗的成活率達(dá)到80％以上。

6、本發(fā)明以冬芽為外植體，建立了一套完整的珙桐組培快速繁殖技術(shù)體系，有效解決了冬芽在消毒、增殖、生根、煉苗過程中存在的問題，可在短期內(nèi)培育大量的珙桐苗，并且，煉苗技術(shù)成熟，成活率可達(dá)80％以上。

附圖說明

圖1為冬芽初代培養(yǎng)后生長狀況圖；

圖2和圖3均為冬芽誘導(dǎo)產(chǎn)生莖段的生長示意圖；

圖4為冬芽增殖培養(yǎng)后得到的珙桐苗。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實(shí)施例1：

一種珙桐冬芽快速繁殖的培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)采集1～2年生珙桐未萌發(fā)的冬芽為外植體材料；

(2)消毒滅菌

冬芽消毒滅菌：將野外采集的冬芽在濃度為3～5g/ml的洗衣粉溶液中浸泡2min，用軟毛筆輕輕的將芽鱗清洗干凈，用流水沖洗2h，然后在超凈工作臺上用0.1％升汞溶液浸泡冬芽20min后，用無菌水沖洗5次以上，洗凈后用滅菌濾紙吸干外植體表面水分，用鑷子剝?nèi)ザ咳亏[片，得到芽體，再采用75％乙醇+升汞或僅使用升汞對其進(jìn)行處理，每種處理接種30瓶，每瓶接種2個外植體，具體過程如下：

a、75％乙醇+0.01％升汞配合消毒滅菌(見表1)

剪掉芽體上全部亮黃色絨狀葉，使其僅剩0.5cm的芽端，用75％乙醇表面消毒10～30s，取出芽體，然后用無菌水沖洗2～5，再用0.01％升汞溶液浸泡芽體1～7min，用滅菌濾紙吸干芽體上水分，消毒處理結(jié)果見表2；

表175％乙醇+0.01％升汞配合消毒滅菌

表2采用表1消毒方式處理后的結(jié)果

b、0.01％升汞消毒滅菌(見表3)

將芽體置于0.01％升汞溶液中浸泡4～8min，取出芽體，用滅菌濾紙吸干水分，處理結(jié)果見表4；

表30.01％升汞消毒滅菌

表4采用表3消毒方式處理后的結(jié)果

根據(jù)表2和表4的消毒處理結(jié)果，可看出污染率與死亡率成反比，可能由于不同消毒處理對細(xì)胞的殺傷程度不同：消毒時間越短，對細(xì)胞的殺傷程度越小，因此它對應(yīng)的污染率較高，致死率較低；消毒時間越長，對細(xì)胞的殺傷越大，相應(yīng)的污染率低，致死率卻很高。由此可以得知表1中的消毒方式③是最好的，即先用75％酒精浸泡20s，然后再用0.01％升汞浸泡5min這種方式是冬芽消毒處理的最佳條件。

(3)冬芽初代培養(yǎng)

設(shè)立11組含有不同naa和6-ba含量的wpm培養(yǎng)基(見表3)，每組wpm培養(yǎng)基中均添加1.5g/l的ac，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基ph值為5.8～6.0，于121℃高壓滅菌20min，冷卻至室溫；然后將步驟(2)中消毒后的冬芽分別接種至1、4、5、6、7、8、9、10、11號培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10罐，每罐3個外植體，重復(fù)三次，接種后置于培養(yǎng)室內(nèi)，于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，培養(yǎng)至冬芽萌發(fā)為帶芽莖段，75d后統(tǒng)計(jì)冬芽萌發(fā)率，結(jié)果見表6；

表5用于冬芽初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基

表6初代培養(yǎng)基冬芽萌發(fā)的影響

注：相同字母表示無顯著差異(p＞0.05)

根據(jù)表6的培養(yǎng)結(jié)果，除4號培養(yǎng)基外其它培養(yǎng)基冬芽萌發(fā)誘導(dǎo)率均達(dá)100％，即都有新的葉片長出，另外，激素種類和濃度對珙桐冬芽萌發(fā)有明顯影響，9種培養(yǎng)基的芽體啟動時間和產(chǎn)生帶莖段的芽體個數(shù)均有極顯著差異(p<0.01)。5，6，8，11號培養(yǎng)基的冬芽萌發(fā)時間最短，芽增長個數(shù)最多，與其它培養(yǎng)基的萌發(fā)時間和產(chǎn)生帶莖段的芽體個數(shù)差異達(dá)到極顯著水平(p<0.01)，且5，6，8，11這4種培養(yǎng)基間無顯著差異，在這些培養(yǎng)基上冬芽啟動快，生長迅速，有帶芽莖段長出(見圖2、圖3)，能為進(jìn)一步莖段增殖提供材料。1，6，7，9，10號培養(yǎng)基的萌發(fā)啟動時間和帶莖段芽個數(shù)次之，且該5種培養(yǎng)基間無顯著差異；4號培養(yǎng)基的萌發(fā)啟動時間最長，帶芽莖段個數(shù)最少，與其它培養(yǎng)基差異均達(dá)到顯著水平(p<0.05)，在此培養(yǎng)基上的芽生長緩慢，大部分芽體隨時間推移而死亡。經(jīng)芽體啟動和生長狀況綜合比較，發(fā)現(xiàn)5、6、8、11號培養(yǎng)基均可作為珙桐冬芽萌發(fā)成帶芽莖段的適宜培養(yǎng)基，其中6號培養(yǎng)基由于加了赤霉素生長最快，最旺盛，所以最佳培養(yǎng)基為：wpm+naa0.3mg/l+6-ba2.0mg/l+ga32.0mg/l+ac1.5g/l。其中培養(yǎng)基均加了活性炭(1.5％)，以防止褐化。

(4)增殖培養(yǎng)

將步驟(3)所得產(chǎn)物分別接種至表5設(shè)立的2、3、5、6、7、8、9、10、11號培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種10罐，每罐3個外植體，重復(fù)三次，接種后置于培養(yǎng)室內(nèi)，于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，誘導(dǎo)產(chǎn)生叢生芽，增殖培養(yǎng)，得到珙桐苗，60d后統(tǒng)計(jì)生長結(jié)果(見表7)；

表7不同激素組合對珙桐冬芽直接誘導(dǎo)叢生芽的影響

其中，1、芽誘導(dǎo)率(％)＝分化出叢生芽的外植體數(shù)量/(接種外植體數(shù)量-外植體污染數(shù)量)×100％；新增芽平均個數(shù)＝叢生芽總數(shù)/分化出叢生芽的外植體數(shù)量。

2、數(shù)字后面含有一個或幾個相同的字母，均表示數(shù)據(jù)間無顯著差異(p＞0.05)。

用單因素方差多重分析比較法(lsd)分析，由表7可知，供試的9種培養(yǎng)基均可直接誘導(dǎo)冬芽產(chǎn)生叢生芽，在沒有或低濃度naa下，水解乳蛋白(lh)有利于叢生芽的增殖與生長。經(jīng)分析檢驗(yàn)，11號培養(yǎng)基對珙桐冬芽直接誘導(dǎo)叢生芽的芽誘導(dǎo)率最高，與6號培養(yǎng)基無顯著差異(p＝0.061)，與其它培養(yǎng)基均存在顯著差異(p<0.05)。11號培養(yǎng)基對珙桐冬芽直接誘導(dǎo)叢生芽的新增芽平均個數(shù)最多，與10號培養(yǎng)基無顯著差異(p＝0.132)，與其它培養(yǎng)基均存在顯著性差異(p<0.05)。綜合比較，珙桐冬芽直接誘導(dǎo)叢生芽的最佳培養(yǎng)基為11號培養(yǎng)基，其具體配比為：wpm+naa0.4mg/l+6-ba4.0mg/l+ac1.5g/l，在此培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高為87％，產(chǎn)生的叢生芽最多(4.0)，且芽生長健壯(見圖4)。

(5)壯苗培養(yǎng)

用含有不同量的naa、6-ba和ga3的9組wpm培養(yǎng)基(見表8)，每組培養(yǎng)基中ac的加入量為1.0g/l，分別于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，培育步驟(4)中的珙桐苗36天，統(tǒng)計(jì)平均苗高(見表9)；

表8壯苗培養(yǎng)基

表9壯苗培養(yǎng)結(jié)果

以無根苗為材料研究了ga3、naa、6-ba對壯苗培養(yǎng)的影響，由表9可知，三種因素的極差(r值)大小依次是b＞a＞c，因此三種因素對平均苗高的影響大小依次是ga3＞naa＞6-ba。同時，經(jīng)方差分析表明，ga3和naa對壯苗培養(yǎng)均達(dá)到了顯著水平，因此ga3、naa是影響壯苗培養(yǎng)平均苗高的主要因素。因此，壯苗培養(yǎng)的適宜培養(yǎng)基為wpm+ga31.0mg/l+naa1.0mg/l+6-ba1.0mg/l+ac1.0g/l，在此培養(yǎng)基上培養(yǎng)的珙桐苗平均苗高可達(dá)2.42cm。

(6)生根培養(yǎng)

采用含有不同量的iba、6-ba和ac的white、wpm和1/4ms培養(yǎng)基(見表10)，采用3因素3水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，于24±1℃、2000lx下，光照10h/d，分別培養(yǎng)步驟(5)中生長狀態(tài)良好的珙桐苗至生根，并對生根結(jié)果進(jìn)行分析(見表11)；

表10生根培養(yǎng)基

表11生根培養(yǎng)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表11可知，四種因素的極差(r值)大小依次是a＞c＞b＞d，因此四種因素對平均苗高的影響大小依次是培養(yǎng)基＞6-ba＞iba＞ac，由表11中的生根率可知，珙桐苗進(jìn)行生根培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為9號培養(yǎng)基，生根率達(dá)到85.49％，其具體配比為：white+iba3.0mg/l+6-ba1.0mg/l+ac0.5g/l。

(7)煉苗移栽

煉苗過程包括閉罐煉苗和開罐煉苗，其具體過程如下：

閉罐煉苗：生根培養(yǎng)后7～15d，將裝有珙桐苗的組培罐移至室外遮陰棚或溫室中進(jìn)行閉罐煉苗15～20d，遮陰度為50％～70％；

開罐煉苗：閉罐煉苗結(jié)束后，再打開組培罐蓋，在自然光下進(jìn)行開罐煉苗3～7d，開罐煉苗分為三個階段，首先松開組培罐蓋1～2d，然后部分開罐1～2d，最后完全開罐1～3d；在開罐煉苗過程中，光照較強(qiáng)時應(yīng)注意采取措施，避免珙桐苗被灼傷；

煉苗結(jié)束后，用鑷子將珙桐苗從組培罐中移出，洗凈珙桐苗根部，避免根部殘留的蔗糖和營養(yǎng)物質(zhì)成為致病微生物生長的培養(yǎng)基，可有效防止珙桐苗移栽后爛根死亡；

然后直接移栽，或使用0.1％～0.3％的高錳酸鉀溶液或500倍多靈菌溶液清洗珙桐苗2～3次，再用清水清洗后，再分別移栽至4組消毒滅菌后的基質(zhì)中，澆足定根水，每5天噴施一次營養(yǎng)液，并注意遮陰和通風(fēng)換氣，以50孔育苗盤為一區(qū)，3個重復(fù)，生長60d后統(tǒng)計(jì)成活率和平均株高；

基質(zhì)各組分重量比如下：

(1)珍珠巖+蛭石(1:1)；(2)腐殖質(zhì)土；(3)泥炭+珍珠巖(1:1)；(4)草炭+珍珠巖+蛭石(2:1:1)

基質(zhì)消毒滅菌過程為：

(1)于120℃將基質(zhì)置于烘箱中烘烤20min，或在0.1mpa的滅菌鍋中，保壓20～30min；

(2)用5％的福爾馬林或0.3％硫酸銅溶液淋透基質(zhì)，然后覆蓋塑料布，7d后揭開，并翻動基質(zhì)，使氣味揮發(fā)。

根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果可得珙桐苗的最佳生長基質(zhì)為草炭+珍珠巖+蛭石(2:1:1)。

(8)移栽后的管理

移栽后需定期施肥，并按常規(guī)方法進(jìn)行水肥管理，培育得到珙桐樹苗。

本發(fā)明方法采用珙桐冬芽為外植體進(jìn)行培養(yǎng)，消毒方便，可在短期內(nèi)培育得到大量的珙桐樹苗，且成活率可達(dá)到80％以上。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。