本發(fā)明屬于植物的組織培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及一種大花六道木的組織培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)：

六道木(abeliabiflora)是忍冬科(caprifoliaceae)六道木屬(abelia)植物，原產(chǎn)于我國江西、湖南、湖北、四川等地，是較為珍貴的觀賞性花灌木，從半落葉到常綠都有。六道木不僅觀賞性好，而且適應(yīng)性非常強。

大花六道木(abeliagrandiflora)是在六道木中較早出現(xiàn)的園藝種，為六道木的矮化品種，目前國內(nèi)已有引進(jìn)，但數(shù)量非常有限。它是原產(chǎn)中國的糯米條(a.chinensis)和單花六道木(a.uniflora)雜交而成，后經(jīng)國外育種，形成了幾種更有特色的園藝品種。

大花六道木生長快，株型非常美麗，枝條柔順下垂，樹姿婆娑，無論是作為園中配植，還是用作綠籬和花徑的群植，都非常合適?；ㄆ陂L，每年從初夏至仲秋都是大花六道木的盛花期，開花時節(jié)滿樹白花，玉雕冰琢，晶瑩剔透。在陽光照射下微微泛著熒光，襯以粉紅的花萼、墨綠的葉片，分外醒目。即使白花凋謝，紅色的花萼還可宿存至冬季，極為壯觀。大花六道木不但很美，而且適應(yīng)性非常強。它對土壤要求不高，酸性和中性土都可以；對肥力的要求也不嚴(yán)格，耐干旱、瘠薄，萌蘗力、萌芽力很強盛，同時可反復(fù)修剪。華東、西南及華北可露地栽培，是庭院綠化觀賞的好樹種。

盡管大花六道木的品種繁多，觀賞效果極佳，但目前大花六道木在園林中并不常用。這可能與我國園藝品種引進(jìn)晚，認(rèn)識不夠，很多苗圃沒有生產(chǎn)有關(guān)系。

隨著國外品種的逐漸引入，這種情況得到改善，大花六道木越來越多地被廣泛運用。然而，由于大花六道木種子小，不易收獲，很難進(jìn)行種子繁殖，其生產(chǎn)常用扦插、分株或壓條繁殖，但是，這些繁殖方法繁殖系數(shù)較低，育苗周期長，并且易傳染病菌，品種退化快，尤其對于大花六道木中的花葉品種，引種很少，在市場上罕見，這些花葉品種扦插繁殖系數(shù)更加低，并且生根率低。

目前，對于大花六道木組織培養(yǎng)方法的報道寥寥無幾，呂朝萍(金邊大花六道木組織培養(yǎng)研究，南京林業(yè)大學(xué)碩士論文，2008)對金邊大花六道木進(jìn)行了組織培養(yǎng)，增殖三代后的增殖系數(shù)最大只有4.9，而且，其幼苗生根率較低，最大只有65％，整個繁育周期為165天，周期仍然較長。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種大花六道木的組織培養(yǎng)方法，將育苗周期縮短到90-120天，繁殖系數(shù)可提高至6.1，生根率為95-98％，且，獲得的無菌苗能夠保持母株的優(yōu)良性狀，可周年生產(chǎn)，能實現(xiàn)六道木良種苗木的規(guī)?；S生產(chǎn)。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種大花六道木的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

1)準(zhǔn)備外植體

選取大花六道木的帶腋芽莖段作為外植體，清洗后消毒，再沖洗干凈，備用；

2)初代培養(yǎng)

將長度為0.5-1cm的帶腋芽莖段，接入初代培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-30天，長出腋芽；

培養(yǎng)條件：白天培養(yǎng)溫度為25-26℃，夜間培養(yǎng)溫度23-24℃，光照時間14-16小時，光照強度為2000-3000勒克斯；

所述初代培養(yǎng)基以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加了6-芐基腺嘌呤1.5-2mg/l和萘乙酸0.01-0.02mg/l；

3)增殖培養(yǎng)

將長1-2cm的枝條切下，接入增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為50-60天，培養(yǎng)條件同步驟2)，得到增殖的莖段；

所述的增殖培養(yǎng)基以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加6-芐基腺嘌呤0.8-1.2mg/l和萘乙酸0.1-0.2mg/l；

4)生根培養(yǎng)

將2-3cm的莖段切下接入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)20-30天后生根，得到生根苗，培養(yǎng)條件同步驟2)；

所述生根培養(yǎng)基以wpm培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，并添加吲哚丁酸0.5-1mg/l和萘乙酸1-1.5mg/l；

5)煉苗、移栽

打開培養(yǎng)生根苗的培養(yǎng)瓶瓶蓋，室溫下煉苗2-3天，移栽至基質(zhì)中，保持溫度20-26℃，蓋上塑料薄膜，保濕、遮蔭培養(yǎng)2-3天，得到幼苗。

優(yōu)選地，步驟1)中，所述外植體來自田間種植的大花六道木，在4-6月份取材，選取當(dāng)年萌發(fā)出的帶腋芽的莖段為外植體，莖段長度為5-7cm，在消毒時，在消毒液中加入吐溫-20溶液。

優(yōu)選地，步驟1)中，消毒過程為：用流水沖洗1-2小時后，用0.1％生汞消毒8-12分鐘，或者先用70％的酒精消毒30-60秒，再用2％次氯酸鈉消毒10-15分鐘，沖洗，備用。

進(jìn)一步，在步驟3)中，進(jìn)行增殖培養(yǎng)的莖段，在20-30天的時候，將長度大于2cm的腋芽切分成包含一個芽的莖段，轉(zhuǎn)接入新鮮的增殖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)20-30天。

進(jìn)一步，步驟2)-4)中所述初代培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和/或生根培養(yǎng)基中添加蔗糖20-30g/l、瓊脂6-8g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。

又，步驟3)、4)中所述增殖培養(yǎng)基和/或生根培養(yǎng)基中添加活性炭0.4-0.6g/l，可以防止莖段褐化和增加生根率。

進(jìn)一步，步驟4)所述生根培養(yǎng)基中添加抗壞血酸0.3-0.6g/l，可以防止莖段褐化和增加生根率。

優(yōu)選地，步驟5)中所述基質(zhì)為：草炭土：珍珠巖＝3-4：1，體積比。

本發(fā)明所述的的wpm(woodyplantmedium)培養(yǎng)基中含有大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分，由lloyd和mccown于1980發(fā)表公布(commerciallyfeasiblemicropropagationofmountainlaurel,kalmialatifolia,byuseofshoot-tipculture.procintplantpropsoc30：420–427)。

wpm培養(yǎng)基與常用的ms培養(yǎng)基相比，減少了硝酸銨(nh4no3)含量，具有較低濃度的銨離子，同時，以硝酸鈣(ca(no3)2)替代了ms培養(yǎng)基中的硝酸鉀(kno3)，具有較低濃度的鉀離子和硝酸鹽離子，更適合大花六道木的生長，結(jié)合本發(fā)明選用的激素，將大花六道木的育苗周期縮短到90-120天，將繁殖系數(shù)提高至6.1，生根率達(dá)到95-98％。

本發(fā)明的組織培養(yǎng)方法中，腋芽經(jīng)初代培養(yǎng)，得到枝條，切分后進(jìn)行增殖，再進(jìn)行生根培養(yǎng)，得到幼苗。

本發(fā)明的初代培養(yǎng)基中，添加了6-芐基腺嘌呤1.5-2mg/l和萘乙酸0.01-0.02mg/l，其作用是促進(jìn)腋芽的伸出，使外植體經(jīng)過20-30天培養(yǎng)，就可以伸出腋芽；添加蔗糖20-30g/l時，其可為植物提供碳源，讓植物正常生長；添加瓊脂6-8g/l時，其作用是讓培養(yǎng)基凝固成固體，使莖段可以豎直生長。

本發(fā)明的增殖培養(yǎng)基中，添加了6-芐基腺嘌呤(6-ba)0.8-1.2mg/l和萘乙酸(naa)0.1-0.2mg/l，可增加莖段的生長速度和增殖系數(shù)，使莖段進(jìn)行良好的增殖，添加蔗糖20-30g/l時，其可為植物提供碳源，讓植物正常生長；添加瓊脂6-8g/l時，其作用是讓培養(yǎng)基凝固成固體，使莖段可以豎直生長。添加活性炭0.4-0.6g/l時，可以防止莖段褐化，加快植物生長。

本發(fā)明的生根培養(yǎng)基中，添加了吲哚丁酸(iba)0.5-1mg/l和萘乙酸1-1.5mg/l，其作用是誘導(dǎo)莖段生根，獲得較高的生根率。添加蔗糖20-30g/l時，其可為植物提供碳源，讓植物正常生長；添加瓊脂6-8g/l時，其作用是讓培養(yǎng)基凝固成固體，使莖段可以豎直生長；在生根培養(yǎng)基中添加活性炭0.4-0.6g/l和/或抗壞血酸0.3-0.6g/l時，可以防止莖段褐化，增加生根率。

本發(fā)明可在消毒液中添加吐溫-20，吐溫-20是表面活性劑，能促進(jìn)植物吸收在水中不能溶解的大分子，也能幫助水分透過一些含脂高的生物膜，可以增加消毒效果。

本發(fā)明利用組織培養(yǎng)，可以解決大花六道木的快速繁殖問題，獲得的無菌苗能夠保持母株的優(yōu)良性狀，可周年生產(chǎn)，能實現(xiàn)六道木良種苗木的規(guī)?；S生產(chǎn)，為大花六道木的推廣提供技術(shù)支持，使大花六道木的應(yīng)用更加廣泛，充分體現(xiàn)其的景觀價值和經(jīng)濟效益。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

本發(fā)明在培養(yǎng)過程中使用了wpm培養(yǎng)基，并且添加了6-芐基腺嘌呤和萘乙酸，提高了增殖系數(shù)，增殖系數(shù)達(dá)到6.1。

本發(fā)明在生根培養(yǎng)基中，添加了吲哚丁酸、萘乙酸、提高了生根率，使生根率達(dá)到95-98％。

利用本發(fā)明，形成能夠高效廣泛應(yīng)用的組培體系，大大縮短了大花六道木的育苗周期，將育苗周期縮短到90-120天，獲得的無菌苗能夠保持母株的優(yōu)良性狀，可周年生產(chǎn)，能實現(xiàn)六道木良種苗木的規(guī)?；S生產(chǎn)，在大花六道木的繁殖、推廣和應(yīng)用中起到重要作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實施例1中大花六道木花葉品種‘belladonna’在增殖培養(yǎng)基上的生長圖。

圖2為本發(fā)明實施例2中大花六道木花葉品種“glossy”在生根培養(yǎng)基上的生長圖。

圖3為本發(fā)明實施例3中大花六道木花葉品種“twistoflime”的生根圖。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實施例1一種大花六道木花葉品種‘貝拉夫人(belladonna)’的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

外植體來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院奉浦園區(qū)苗圃中種植的大花六道木植株；在4-6月份取材，選取當(dāng)年萌發(fā)出的帶腋芽的莖段為外植體。

外植體的消毒：取大花六道木5cm帶腋芽莖段作為外植體，切除枝條上多余葉片，外植體用細(xì)毛刷蘸洗潔精清洗干凈后，用流水沖洗1-2個小時，在超凈臺上用70％的酒精消毒30-60秒，2％次氯酸鈉消毒10-15分鐘，溶液中加入0.5％的吐溫-20溶液，最后無菌水沖洗3次，備用。

初代培養(yǎng)：將消毒的外植體剪成0.5-1cm的帶腋芽莖段，接入包含6-芐基腺嘌呤1.5mg/l和的萘乙酸0.01mg/l的wpm培養(yǎng)基中，分別添加蔗糖20-30g/l，瓊脂6-8g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。

莖段培養(yǎng)20-30天，培養(yǎng)溫度為白天25-26℃，夜間23-24℃，光周期16/8小時，光照強度為2000-3000勒克斯。

增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)基中長出的長度為1-2cm的枝條切下，接入wpm培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，并添加6-芐基腺嘌呤0.8mg/l、萘乙酸0.1mg/l、蔗糖20-30g/l，瓊脂6g/l和活性炭0.4g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。

培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)步驟，在30天的時候，將長于2cm的枝條剪成包含芽的莖段，轉(zhuǎn)入新鮮的中增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，增殖培養(yǎng)周期共50-60天，得到增殖的莖段，增殖系數(shù)為5.2，參見圖1，由圖1可見植物生長健壯。

生根培養(yǎng)：將2-3cm的莖段切下，接入含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，用含吲哚丁酸(iba)0.5mg/l和乙酸(naa)1mg/l萘的wpm培養(yǎng)基培養(yǎng)20-30天后生根，培養(yǎng)基中分別添加20-30g/l的蔗糖，瓊脂6g/l，活性炭0.4g/l，抗壞血酸0.3g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)步驟，得到生根苗，生根率95％。

組培苗煉苗和移栽：將生根苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開，室溫下煉苗2天后，取出幼苗，洗去根上的培養(yǎng)基，移栽在裝有草炭土和珍珠巖(體積比3：1)的穴盤中，保持溫度20-26℃，蓋上塑料薄膜，并覆蓋遮陽網(wǎng)，培養(yǎng)2-3天，去掉塑料薄膜和遮陽網(wǎng)，得到幼苗。

所述的wpm培養(yǎng)基含有大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分：

所述的大量元素為硝酸銨(nh4no3)400mg/l，硝酸鈣(ca(no3)2)386mg/l，氯化鈣(cacl2)72.5mg/l，硫酸鎂(mgso4)180.7mg/l，硫酸鉀(k2so4)990mg/l，磷酸二氫鉀(kh2po4)170mg/l。

所述的微量元素為，硼酸(h3bo3)6.2mg/l，鉬酸鈉(na2moo4·2h2o)0.25mg/l，硫酸錳(mnso4·4h2o)22.3mg/l，硫酸銅(cuso4·5h2o)0.25mg/l，硫酸鋅(znso4·7h2o)8.6mg/l。

所述的鐵鹽為乙二胺四乙酸二鈉(na2·edta)37.3mg/l，硫酸亞鐵(feso4·7h2o)27.85mg/l。

所述的有機成分為：肌醇(c6h12o6·2h2o)100mg/l，煙酸(nc5h4·cooh)0.5mg/l，鹽酸硫胺素(c12h17n4os·hcl)1mg/l，甘氨酸(c2h5no2)2mg/l，維生素b6(c8h11no3·hcl)0.5mg/l。

實施例2一種大花六道木花葉品種‘glossy’的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

外植體來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院奉浦園區(qū)苗圃中種植的大花六道木植株，在4-6月份取材，選取當(dāng)年萌發(fā)出的帶腋芽的莖段為外植體。

外植體的消毒：取大花六道木5cm帶腋芽莖段作為外植體，切除枝條上多余葉片，外植體用細(xì)毛刷蘸洗潔精清洗干凈后，用流水沖洗1-2個小時，在超凈臺上用0.1％生汞消毒8-12分鐘，溶液中加入0.5％的吐溫-20溶液，最后無菌水沖洗3次，備用。

初代培養(yǎng)：將消毒的外植體剪成0.5-1cm的帶腋芽莖段，接入包含6-芐基腺嘌呤1.8mg/l和萘乙酸0.015mg/l的wpm培養(yǎng)基中，分別添加蔗糖20-30g/l，瓊脂7g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。莖段培養(yǎng)20-30天，培養(yǎng)溫度為白天25-26℃，夜間23-24℃，光周期16/8小時，光照強度為2000-3000勒克斯。

增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)基中長出的長度為1-2cm的枝條切下，接入wpm培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，添加6-芐基腺嘌呤(6-ba)1mg/l和萘乙酸(naa)0.15mg/l，并添加蔗糖20-30g/l，瓊脂7g/l，活性炭0.5g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。

培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)步驟，在30天的時候，將長于2cm的腋芽剪成包含芽的莖段(一個莖段上一個芽)，轉(zhuǎn)入新鮮的增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，培養(yǎng)周期共為50-60天，得到增殖的莖段，增殖系數(shù)為5.6％，參見圖2，由圖2可見植物生長健壯。

生根培養(yǎng)：將2-3cm的莖段切下接入含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，用含吲哚丁酸(iba)0.8mg/l和萘乙酸(naa)1.25mg/l的wpm培養(yǎng)基培養(yǎng)20-30天后生根，培養(yǎng)基中分別添加蔗糖20-30g/l，瓊脂7g/l，活性炭0.5g/l，抗壞血酸0.4g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)步驟，得到生根苗，生根率97％。

組培苗煉苗和移栽：將生根苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開，室溫下煉苗2天后，取出幼苗，洗去根上的培養(yǎng)基，移栽在裝有草炭土和珍珠巖(體積比3：1)的穴盤中，保持溫度20-26℃，蓋上塑料薄膜，并覆蓋遮陽網(wǎng)，培養(yǎng)2-3天，去掉塑料薄膜和遮陽網(wǎng)，得到幼苗。

所述的wpm培養(yǎng)基中含有大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分：

所述的大量元素為硝酸銨(nh4no3)400mg/l，硝酸鈣(ca(no3)2)386mg/l，氯化鈣(cacl2)72.5mg/l，硫酸鎂(mgso4)180.7mg/l，硫酸鉀(k2so4)990mg/l，磷酸二氫鉀(kh2po4)170mg/l。

所述的微量元素為，硼酸(h3bo3)6.2mg/l，鉬酸鈉(na2moo4·2h2o)0.25mg/l，硫酸錳(mnso4·4h2o)22.3mg/l，硫酸銅(cuso4·5h2o)0.25mg/l，硫酸鋅(znso4·7h2o)8.6mg/l。

所述的鐵鹽為乙二胺四乙酸二鈉(na2·edta)37.3mg/l，硫酸亞鐵(feso4·7h2o)27.85mg/l。

所述的有機成分為：肌醇(c6h12o6·2h2o)100mg/l，煙酸(nc5h4·cooh)0.5mg/l，鹽酸硫胺素(c12h17n4os·hcl)1mg/l，甘氨酸(c2h5no2)2mg/l，維生素b6(c8h11no3·hcl)0.5mg/l。

實施例3一種大花六道木花葉品種‘青檸(twistoflime)’的組織培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

外植體來自上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院奉浦園區(qū)苗圃中種植的大花六道木植株；

外植體的消毒：取大花六道木5-7cm帶腋芽莖段作為外植體，切除枝條上多余葉片，外植體用細(xì)毛刷蘸洗潔精清洗干凈后，用流水沖洗1-2個小時，在超凈臺上用70％的酒精消毒30-60秒，2％次氯酸鈉消毒10-15分鐘，溶液中加入0.5％的吐溫-20溶液，最后無菌水沖洗3次，備用。

初代培養(yǎng)：將消毒的外植體剪成0.5-1cm的帶腋芽莖段，接入包含6-芐基腺嘌呤(6-ba)2mg/l和萘乙酸(naa)0.02mg/l的wpm培養(yǎng)基中，分別添加蔗糖20-30g/l，瓊脂8g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。

莖段培養(yǎng)20-30天，培養(yǎng)溫度為白天25-26℃，夜間23-24℃，光周期16/8小時，光照強度為2000-3000勒克斯。

增殖培養(yǎng)：將初代培養(yǎng)基中長出的長度為1-2cm的枝條切下，轉(zhuǎn)接到wpm培養(yǎng)基增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，添加6-芐基腺嘌呤1.2mg/l和萘乙酸0.2mg/l，添加蔗糖20-30g/l，瓊脂8g/l，活性炭0.6g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8。培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)步驟，在30天的時候，將長于2cm的枝條剪成包含芽的莖段，轉(zhuǎn)入新鮮的增殖培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20-30天，培養(yǎng)周期共為50-60天，得到增殖的莖段，增殖系數(shù)為6.1。

生根培養(yǎng)：將2-3cm的莖段切下接入含生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，用含吲哚丁酸1mg/l和萘乙酸1.5mg/l的wpm培養(yǎng)基培養(yǎng)20-30天后生根，培養(yǎng)基中分別添加蔗糖20-30g/l，瓊脂8g/l，活性炭0.6g/l，抗壞血酸0.6g/l，培養(yǎng)基ph值為5.6-5.8，培養(yǎng)條件同初代培養(yǎng)步驟，得到生根的幼苗(參見圖3)，由圖3可見幼苗生根良好，生根率為98％。

組培苗煉苗和移栽：將生根幼苗的培養(yǎng)基瓶蓋打開，室溫下煉苗3天后，取出幼苗，洗去根上的培養(yǎng)基，移栽在裝有草炭土和珍珠巖(體積比3：1)的穴盤中，保持溫度20-26℃，蓋上塑料薄膜，并覆蓋遮陽網(wǎng)，培養(yǎng)2-3天，去掉塑料薄膜和遮陽網(wǎng)，得到大花六道木幼苗。

所述的wpm培養(yǎng)基含有大量元素、微量元素、鐵鹽和有機成分：

所述的大量元素為硝酸銨(nh4no3)400mg/l，硝酸鈣(ca(no3)2)386mg/l，氯化鈣(cacl2)72.5mg/l，硫酸鎂(mgso4)180.7mg/l，硫酸鉀(k2so4)990mg/l，磷酸二氫鉀(kh2po4)170mg/l。

所述的微量元素為，硼酸(h3bo3)6.2mg/l，鉬酸鈉(na2moo4·2h2o)0.25mg/l，硫酸錳(mnso4·4h2o)22.3mg/l，硫酸銅(cuso4·5h2o)0.25mg/l，硫酸鋅(znso4·7h2o)8.6mg/l。

所述的鐵鹽為乙二胺四乙酸二鈉(na2·edta)37.3mg/l，硫酸亞鐵(feso4·7h2o)27.85mg/l。

所述的有機成分為：肌醇(c6h12o6·2h2o)100mg/l，煙酸(nc5h4·cooh)0.5mg/l，鹽酸硫胺素(c12h17n4os·hcl)1mg/l，甘氨酸(c2h5no2)2mg/l，維生素b6(c8h11no3·hcl)0.5mg/l。