本發(fā)明涉及綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法。

背景技術(shù)：

綿羊精液保存技術(shù)自發(fā)明以來，成為提高優(yōu)良種畜利用率、加速品種改良最有效之一，而且能降低繁殖成本，對(duì)人工授精技術(shù)的推廣應(yīng)用，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展都產(chǎn)生了巨大的推動(dòng)作用。精液的保存方法分為冷凍保存、低溫保存和常溫保存。

冷凍保存是為了品種資源的保存和地域間種質(zhì)交流，可長(zhǎng)期保持；低溫保存(0～5℃)和常溫保存(15～25℃)可以擴(kuò)大精液量，提高種畜利用率，方法簡(jiǎn)單，但保存時(shí)間短。

目前，綿羊人工授精所用精液仍多為鮮精，其原因是綿羊的精液冷凍保存效果不盡理想，尚難在生產(chǎn)上推廣的現(xiàn)狀下，液態(tài)保存精液有很大的應(yīng)用前景。

現(xiàn)有的綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法中，稀釋液成分大多比較復(fù)雜、繁多，保存效果也并不十分理想，保存時(shí)間一般在5～72小時(shí)，降低了優(yōu)良種公羊利用率，增加養(yǎng)羊成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，以解決上述背景技術(shù)中提出的稀釋液成分大多比較復(fù)雜、繁多，保存效果也并不十分理想，保存時(shí)間一般在5～72小時(shí)，降低了優(yōu)良種公羊利用率，增加養(yǎng)羊成本的問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

1)、提取綿羊的新鮮精液，并將提取的新鮮精液放進(jìn)集精杯中；

2)、將步驟1)中盛有精液的集精杯放在保溫桶水浴，并將提取的精液運(yùn)回至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程中防止保溫桶劇烈震蕩；

3)、準(zhǔn)備制作稀釋液的原材料，tris、檸檬酸、乳糖、花青素、vc、青霉素和鏈霉素；

4)、采用步驟1)中的原材料分別配制以下四種稀釋液，其中稀釋液i的配方為tris1.92g，檸檬酸1.02g，乳糖0.10g，花青素0.031g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液ii的配方為tris2.64g，檸檬酸1.52g，乳糖0.36g，花青素0.096g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液iii的配方為tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液iii的配方為tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g，稀釋液iv的配方為tris3.53g，檸檬酸1.90g，乳糖1.01g，花青素0.204g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；

5)、將步驟4)制作的稀釋液放在37℃水浴鍋中，使稀釋液的溫度升溫到37℃，并使鮮精溫度和稀釋液溫度一致，達(dá)到溫度的平衡；

6)、對(duì)步驟2)中的鮮精進(jìn)行稀釋，取0.4ml鮮精加入到塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6ml等溫的稀釋液i，得到稀釋精液i，之后再取0.4ml鮮精加入到另一只新的塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6ml等溫的稀釋液ii，得到稀釋精液ii，依次制作稀釋精液iii與稀釋精液iv；

7)、對(duì)步驟6)中稀釋精液i、ii、iii、iv進(jìn)行保存，將離心管蓋蓋緊后放在泡沫的離心管架，室溫放置保存；

8)、對(duì)步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子活率進(jìn)行測(cè)定，先將分層的精液用移液槍輕輕吹打混勻，靜止5min后，吸取10μl稀釋精液i滴在37℃的載玻片上，蓋上蓋玻片，置400×光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察確定，至少觀察5個(gè)不同視野，每個(gè)視野觀察20個(gè)精子，記錄存活精子數(shù)，算出精子活率，運(yùn)動(dòng)的精子占精子總數(shù)的比例即為精子活力，精子中呈直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占精子總數(shù)的百分比即為精子活率，然后依次對(duì)稀釋精液ii、iii、iv的精子活率進(jìn)行測(cè)定；

9)、對(duì)步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子頂體完整率進(jìn)行檢查，取5μl稀釋精液i滴在37℃的載玻片然后加入5μlpbs液稀釋，將精子密度調(diào)整為每毫升1×10⁶個(gè)，在載玻片上涂片，采用烘片機(jī)烘干，然后滴加6.8％重鉻酸鉀固定30min，用自來水流水沖洗固定液，自然晾干，然后用瑞士-吉姆薩染色混合液染色1.5h，再次用自來水流水沖洗染液，自然晾干，放在400×顯微鏡下觀察200個(gè)精子，計(jì)數(shù)頂體完整的精子數(shù)量，計(jì)算出頂體完整率，然后依次計(jì)算出稀釋精液ii、iii、iv中的精子頂體完整率；

10)、對(duì)步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測(cè)，取10μl稀釋精液i用pbs液稀釋，將精子密度調(diào)整為每毫升1×10⁶個(gè)，孵育后取10μl調(diào)整后的懸液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在400×光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算彎尾占總精子數(shù)的百分率，其中精子尾部彎尾就是精子質(zhì)膜完整率，然后依次對(duì)稀釋精液ii、iii、iv中的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行計(jì)算。

優(yōu)選的，所述步驟1)中提取精液的對(duì)象為多浪羊和策勒黑羊公羊。

優(yōu)選的，所述步驟2)中，保溫桶水浴的溫度為37℃。

優(yōu)選的，所述步驟2)中運(yùn)輸時(shí)間不能超過半小時(shí)。

優(yōu)選的，所述步驟6)中加稀釋液時(shí)沿著離心管的管壁將稀釋液加入精液，邊加邊混勻。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：該綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，通過提取成活率較高的多浪羊和策勒黑羊公羊的精液，精子的存活率高達(dá)0.85以上，降低精子存活率低對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，對(duì)提取后的精液采用37℃保溫桶水浴保溫和有效的運(yùn)輸途徑，可提高綿羊精子的存活率，減少對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響的因素。通過四組不同配比的稀釋液分別對(duì)綿羊精子的活率、頂體完整率和質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測(cè)，從而測(cè)得稀釋液ⅲ的稀釋液配比更加有利于精子的存活，存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)7天。

附圖說明：

圖1為本發(fā)明稀釋液一對(duì)常溫保存綿羊精子活率的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖；

圖2為本發(fā)明稀釋液二對(duì)常溫保存綿羊精子活率的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖；

圖3為本發(fā)明稀釋液三對(duì)常溫保存綿羊精子活率的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖；

圖4為本發(fā)明稀釋液四對(duì)常溫保存綿羊精子活率的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖；

圖5為本發(fā)明稀釋液1-4對(duì)常溫保存綿羊精子頂體完整率和質(zhì)膜完整性的影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖1-5對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種綿羊精液常溫保存稀釋液的實(shí)驗(yàn)方法，包括以下步驟：

1)、提取綿羊的新鮮精液，并將提取的新鮮精液放進(jìn)集精杯中；

2)、將步驟1)中盛有精液的集精杯放在保溫桶水浴，并將提取的精液運(yùn)回至實(shí)驗(yàn)室，運(yùn)輸過程中防止保溫桶劇烈震蕩；

3)、準(zhǔn)備制作稀釋液的原材料，tris、檸檬酸、乳糖、花青素、vc、青霉素和鏈霉素；

4)、采用步驟1)中的原材料分別配制以下四種稀釋液，其中稀釋液i的配方為tris1.92g，檸檬酸1.02g，乳糖0.10g，花青素0.031g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液ii的配方為tris2.64g，檸檬酸1.52g，乳糖0.36g，花青素0.096g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液iii的配方為tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；稀釋液iii的配方為tris3.00g，檸檬酸1.65g，乳糖0.57g，花青素0.132g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g，稀釋液iv的配方為tris3.53g，檸檬酸1.90g，乳糖1.01g，花青素0.204g，vc0.1g，青霉素0.06g，鏈霉素0.06g；

5)、將步驟4)制作的稀釋液放在37℃水浴鍋中，使稀釋液的溫度升溫到37℃，并使鮮精溫度和稀釋液溫度一致，達(dá)到溫度的平衡；

6)、對(duì)步驟2)中的鮮精進(jìn)行稀釋，取0.4ml鮮精加入到塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6ml等溫的稀釋液i，得到稀釋精液i，之后再取0.4ml鮮精加入到另一只新的塑料離心管中，然后往離心管中緩慢加入1.6ml等溫的稀釋液ii，得到稀釋精液ii，依次制作稀釋精液iii與稀釋精液iv；

7)、對(duì)步驟6)中稀釋精液i、ii、iii、iv進(jìn)行保存，將離心管蓋蓋緊后放在泡沫的離心管架，室溫放置保存；

8)、對(duì)步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子活率進(jìn)行測(cè)定，先將分層的精液用移液槍輕輕吹打混勻，靜止5min后，吸取10μl稀釋精液i滴在37℃的載玻片上，蓋上蓋玻片，置400×光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察確定，至少觀察5個(gè)不同視野，每個(gè)視野觀察20個(gè)精子，記錄存活精子數(shù)，算出精子活率，運(yùn)動(dòng)的精子占精子總數(shù)的比例即為精子活力，精子中呈直線運(yùn)動(dòng)的精子數(shù)占精子總數(shù)的百分比即為精子活率，然后依次對(duì)稀釋精液ii、iii、iv的精子活率進(jìn)行測(cè)定；

9)、對(duì)步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子頂體完整率進(jìn)行檢查，取5μl稀釋精液i滴在37℃的載玻片然后加入5μlpbs液稀釋，將精子密度調(diào)整為每毫升1×10⁶個(gè)，在載玻片上涂片，采用烘片機(jī)烘干，然后滴加6.8％重鉻酸鉀固定30min，用自來水流水沖洗固定液，自然晾干，然后用瑞士-吉姆薩染色混合液染色1.5h，再次用自來水流水沖洗染液，自然晾干，放在400×顯微鏡下觀察200個(gè)精子，計(jì)數(shù)頂體完整的精子數(shù)量，計(jì)算出頂體完整率，然后依次計(jì)算出稀釋精液ii、iii、iv中的精子頂體完整率；

10)、對(duì)步驟7)中四組保存的稀釋精液中的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行檢測(cè)，取10μl稀釋精液i用pbs液稀釋，將精子密度調(diào)整為每毫升1×10⁶個(gè)，孵育后取10μl調(diào)整后的懸液滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在400×光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算彎尾占總精子數(shù)的百分率，其中精子尾部彎尾就是精子質(zhì)膜完整率，然后依次對(duì)稀釋精液ii、iii、iv中的精子質(zhì)膜完整率進(jìn)行計(jì)算。

上述實(shí)施例中，具體的，步驟1)中提取精液的對(duì)象為多浪羊和策勒黑羊公羊，多浪羊和策勒黑羊公羊的新鮮精液中的精子存活率在0.85以上，防止提取的綿羊精液中的精子存活率較低而影響后期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

上述實(shí)施例中，具體的，所述步驟2)中，保溫桶水浴的溫度為37℃，由于綿羊正常體溫在37℃左右，可使提取后精子的溫度與綿羊正常體溫保持一致，增加綿羊精子的存活率，從而防止保溫桶水浴溫度過高或者過低造成綿羊精子大量死亡。

上述實(shí)施例中，具體的，所述步驟2)中運(yùn)輸時(shí)間不能超過半小時(shí)，提取后的綿羊鮮精液中的精子，由于運(yùn)輸過程中保溫桶內(nèi)部水浴的溫度為37℃，正常溫度下綿羊鮮精液中的精子存活時(shí)間較短，會(huì)影響后期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

上述實(shí)施例中，具體的，所述步驟6)中加稀釋液時(shí)沿著離心管的管壁將稀釋液加入精液，邊加邊混勻，避免分步稀釋和快速稀釋，防止稀釋對(duì)精子造成的不可逆恢復(fù)。

盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。