本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種腫瘤組織的保存方法及保存試劑。

背景技術(shù)：

隨著腫瘤對(duì)人類的影響和危害性的增加，如何保護(hù)、保存并充分利用人類腫瘤遺傳資源，提高我國(guó)腫瘤防治水平，已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。作為腫瘤研究材料的活腫瘤組織標(biāo)本在促進(jìn)腫瘤研究進(jìn)展過程中扮演了重要角色，具有重要的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值，而活腫瘤組織保存技術(shù)成為實(shí)現(xiàn)這些價(jià)值的基礎(chǔ)。

目前活腫瘤組織保存的方式一般為直接冷凍保存，所需冷凍保護(hù)劑多采用dmso、血清和細(xì)胞培養(yǎng)液組成，需要現(xiàn)用現(xiàn)配，且這種組織凍存液的穩(wěn)定性較差，使得其保質(zhì)期較短，保存條件也較為苛刻。

使用現(xiàn)有的冷凍保存方法在凍存及解凍后無法保證腫瘤組織的結(jié)構(gòu)完整性，且極易丟失腫瘤自身的遺傳特性，降低了組織標(biāo)本的臨床研究?jī)r(jià)值。

目前急需一種更加長(zhǎng)效且更加便捷的腫瘤組織保存方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種腫瘤組織的保存方法及保存試劑。

本發(fā)明所提供的腫瘤組織保存方法，具體可包括如下步驟：

(1)將待保存的腫瘤組織置于腫瘤組織酶解試劑中，于20-25℃培養(yǎng)10-20min(如15min)，得到酶解后腫瘤組織；

所述腫瘤組織酶解試劑中含有透明質(zhì)酸酶和dna酶?。幻可瞿[瘤組織酶解試劑中含有40-150u的所述透明質(zhì)酸酶，含有高于40kunitzu的所述dna酶ⅰ。

其中，所述透明質(zhì)酸酶的酶活定義同sigma公司貨號(hào)為h3506的透明質(zhì)酸酶的酶活定義。所述dna酶ⅰ的酶活定義同sigma公司貨號(hào)為dn25-1g的dna酶ⅰ的酶活定義。

在本發(fā)明中，所述透明質(zhì)酸酶具體為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為h3506。所述dna酶ⅰ具體為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為dn25-1g。相應(yīng)的，所述透明質(zhì)酸酶在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度可為100-150mg/ml；所述dna酶ⅰ在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度可為100-120mg/ml。

(2)將所述酶解后腫瘤組織置于冷凍保存液中，在4℃預(yù)平衡10-20min(如15min)，得到預(yù)平衡后腫瘤組織；

(3)將所述預(yù)平衡后腫瘤組織進(jìn)行程序化冷凍，待溫度降至-150℃后，轉(zhuǎn)入液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存。

鑒于多數(shù)實(shí)體腫瘤組織含有大量的膠原結(jié)締組織，使其本身具備結(jié)構(gòu)致密的特性，因而本發(fā)明通過既定的腫瘤組織酶解試劑對(duì)其進(jìn)行室溫培養(yǎng)的操作，實(shí)現(xiàn)了腫瘤組織酶解試劑對(duì)膠原等組織進(jìn)行酶解的效果，使致密的實(shí)體腫瘤組織間質(zhì)疏松，進(jìn)而利于后續(xù)預(yù)平衡過程中冷凍保存液的順利滲透；進(jìn)而縮短了后續(xù)在冷凍保存液中的平衡時(shí)間。通過酶解處理之后，在預(yù)平衡的過程中，僅用10-20分鐘即可達(dá)到預(yù)平衡效果(冷凍保存液滲透到腫瘤組織中心)；與現(xiàn)有技術(shù)中常見的30-90分鐘的預(yù)平衡時(shí)間相比，大幅縮短了預(yù)平衡的時(shí)間，避免了由于預(yù)平衡時(shí)間過長(zhǎng)，進(jìn)而導(dǎo)致其冷凍保護(hù)劑對(duì)腫瘤組織的細(xì)胞毒性損傷。

在所述方法中，所述腫瘤組織酶解試劑由所述透明質(zhì)酸酶、所述dna酶ⅰ和含體積百分含量為10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液組成。

更加具體的，每升所述腫瘤組織酶解試劑中含有48-120u的所述透明質(zhì)酸酶，含有高于40kunitzu的所述dna酶ⅰ，余量為含體積百分含量為10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液。其中，所述透明質(zhì)酸酶的酶活定義同sigma公司貨號(hào)為h3506的透明質(zhì)酸酶的酶活定義。所述dna酶ⅰ的酶活定義同sigma公司貨號(hào)為dn25-1g的dna酶ⅰ的酶活定義。在本發(fā)明中，所述透明質(zhì)酸酶具體為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為h3506。所述dna酶ⅰ具體為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為dn25-1g。相應(yīng)的，所述透明質(zhì)酸酶在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度具體為120mg/ml；所述dna酶ⅰ在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度具體為100mg/ml。

所述冷凍保存液由dmso與蔗糖組成；在所述冷凍保存液中，dmso與蔗糖的濃度分別為1mol/l和0.1mol/l。

步驟(1)中，在將所述待保存的腫瘤組織置于所述腫瘤組織酶解試劑中之前，還可包括如下步驟：收集腫瘤組織，置于含體積百分含量為10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中，在5-10min內(nèi)用冰盒運(yùn)送至生物安全柜內(nèi)，更換新鮮的含體積百分含量為10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液，并將腫瘤組織剪切成(0.5mm-1.5mm)×(0.8mm-1.2mm)×(2.5mm-3.5mm)大小，得到所述待保存的腫瘤組織。

步驟(2)中，將所述酶解后腫瘤組織置于所述冷凍保存液中具體可為將2-4片所述酶解后腫瘤組織置于2ml所述冷凍保存液中。

步驟(3)中，所述“將所述預(yù)平衡后腫瘤組織進(jìn)行程序化冷凍，待溫度降至-150℃后，轉(zhuǎn)入液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存”，具體可包括如下步驟：將裝有所述預(yù)平衡后腫瘤組織的冷凍管放入程序降溫儀中，開始冷凍溫度設(shè)定為4℃，并以2.5℃/min的降溫速率將至-60℃，再以1℃/min的速度降至-80℃，最后以-30℃/min的降溫速率降至-150℃；將整個(gè)冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存。

本發(fā)明所提供的用于保存腫瘤組織的試劑，可為如下(a)或(b)：

(a)腫瘤組織酶解試劑；

(b)由所述腫瘤組織酶解試劑和冷凍保存液組成的試劑套裝；

所述腫瘤組織酶解試劑中含有透明質(zhì)酸酶和dna酶ⅰ；每升所述腫瘤組織酶解試劑中含有40-150u(如48-120u)的所述透明質(zhì)酸酶，含有高于40kunitzu的所述dna酶ⅰ。

其中，所述透明質(zhì)酸酶的酶活定義同sigma公司貨號(hào)為h3506的透明質(zhì)酸酶的酶活定義。所述dna酶ⅰ的酶活定義同sigma公司貨號(hào)為dn25-1g的dna酶ⅰ的酶活定義。

在本發(fā)明中，所述透明質(zhì)酸酶具體為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為h3506。所述dna酶ⅰ具體為sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為dn25-1g。相應(yīng)的，所述透明質(zhì)酸酶在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度可為100-150mg/ml(如120mg/ml)；所述dna酶ⅰ在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度可為100-120mg/ml(如100mg/ml)。

所述冷凍保存液由dmso與蔗糖組成；在所述冷凍保存液中，dmso與蔗糖的濃度分別為1mol/l和0.1mol/l。

所述的試劑在保存腫瘤組織中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

在本發(fā)明中，所述腫瘤組織可為人體腫瘤組織，具體可為任何人體實(shí)體惡性腫瘤組織。所述惡性腫瘤如胃癌、食道癌、胰腺癌、鼻咽癌、膀胱癌、腎癌、結(jié)腸癌、甲狀腺癌、乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌、惡性膠質(zhì)瘤、骨肉瘤、肝癌、肺癌等。

本發(fā)明所提供的腫瘤組織保存方法具有成瘤率高、移植后腫瘤組織能比較完整地保留患者來源組織的形態(tài)和分子特征等特點(diǎn)。

附圖說明

圖1為不同凍存時(shí)間對(duì)結(jié)腸癌移植瘤模型的成瘤率的影響。

圖2為腫瘤組織凍存、復(fù)蘇后蘇木精-伊紅染色(he染色)結(jié)果。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

透明質(zhì)酸酶：sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為h3506(400-1000units/mgsolid)。

dna酶ⅰ：sigma公司產(chǎn)品，貨號(hào)為dn25-1g(≥400kunitzunits/mgprotein)。

scid小鼠：北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1、人體腫瘤組織的保存

一、腫瘤組織保存試劑

腫瘤組織酶解試劑：由透明質(zhì)酸酶、dna酶ⅰ和含體積百分含量為10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)液組成。其中，所述透明質(zhì)酸酶在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度為120mg/ml；所述dna酶ⅰ在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度為100mg/ml。相當(dāng)于每升所述腫瘤組織酶解試劑中含有48-120u的所述透明質(zhì)酸酶，含有高于40kunitzu的所述dna酶ⅰ。

冷凍保存液：由dmso與蔗糖組成；且在所述冷凍保存液中，dmso與蔗糖的濃度分別為1mol/l和0.1mol/l。

二、本發(fā)明腫瘤組織保存方法

患者腫瘤組織標(biāo)本來源于一名56歲男性結(jié)腸癌伴肝轉(zhuǎn)移患者，標(biāo)本的獲取得到患者的知情同意以及倫理委員會(huì)的許可?；颊咝g(shù)前未接受過化療和其他相關(guān)治療。

1、將術(shù)中所取標(biāo)本置于含有10％(體積百分含量)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中；將裝有腫瘤組織的dmem培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至冰盒，在5-10min內(nèi)轉(zhuǎn)移至生物安全柜內(nèi)，更換為新鮮的含有10％(體積百分含量)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中；將腫瘤組織剪切成1mm×1mm×3mm大小，得到待冷凍的腫瘤組織。

2、將待凍存的腫瘤組織用腫瘤組織酶解試劑在室溫(20-25℃)下培養(yǎng)15min，得到酶解后腫瘤組織。

3、將2-4片所述酶解后腫瘤組織置于2ml所述冷凍保存液中，在4℃預(yù)平衡15min，得到預(yù)平衡后腫瘤組織。

4、將所述預(yù)平衡后腫瘤組織進(jìn)行程序化冷凍，使其溫度降至-150℃后，轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行儲(chǔ)存，具體包括：將裝有預(yù)平衡后腫瘤組織的冷凍管放入程序降溫儀中，開始冷凍溫度設(shè)定為4℃，并以2.5℃/min的降溫速率將至-60℃，再以1℃/min的速度降至-80℃，最后以-30℃/min的降溫速率降至-150℃；將整個(gè)冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存，以待接種。

三、常規(guī)腫瘤組織保存方法

1、將術(shù)中所取標(biāo)本置于含有10％(體積百分含量)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中；將裝有腫瘤組織的dmem培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至冰盒，在5-10min內(nèi)轉(zhuǎn)移至生物安全柜內(nèi)，更換為新鮮的含有10％(體積百分含量)胎牛血清的dmem培養(yǎng)液中；將腫瘤組織剪切成1mm×1mm×3mm大小，得到待冷凍的腫瘤組織。

2、將腫瘤組織置于常規(guī)冷凍保存液(配方：胎牛血清10％，dmso10％，余量為dmem培養(yǎng)基，％表示體積百分含量)中，在4℃預(yù)平衡60min，得到預(yù)平衡后腫瘤組織。

3、將所述預(yù)平衡后腫瘤組織進(jìn)行程序化冷凍，使其溫度降至-150℃后，轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行儲(chǔ)存，具體包括：將裝有預(yù)平衡后腫瘤組織的冷凍管放入程序降溫儀中，開始冷凍溫度設(shè)定為4℃，并以2.5℃/min的降溫速率將至-60℃，再以1℃/min的速度降至-80℃，最后以-30℃/min的降溫速率降至-150℃；將整個(gè)冷凍管轉(zhuǎn)移至液氮罐中進(jìn)行儲(chǔ)存，以待接種。

實(shí)施例2、在體腫瘤組織庫的建立

供試小鼠：scid小鼠(severecombinedimmunodeficientmice)，性別不限，鼠齡4～5周。

1、將實(shí)施例1冷凍保存中的腫瘤組織標(biāo)本置于37℃水浴中復(fù)蘇，復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移入冰浴的dmem培養(yǎng)基中(含體積百分含量為10％的胎牛血清)。

2、將步驟1復(fù)蘇后的腫瘤組織移植至小鼠前腋下被膜下。具體為：動(dòng)物用異氟烷麻醉后，消毒小鼠背腹部皮膚，無菌棉球擦拭干，用刀片在小鼠的一側(cè)前腋下附近切一個(gè)小口，18g穿刺針頭鈍性分離皮膚與皮下，使成一皮袋，將準(zhǔn)備好的腫瘤組織塊置放于其中，切口滴加一滴雙抗(100×青霉素/鏈霉素)。

3、待腫瘤生長(zhǎng)到預(yù)定大小后，處死小鼠，在無菌條件下暴露腫瘤，獲取影像資料后切取腫瘤組織，將小鼠身上獲取的部分腫瘤組織分為兩組，其中一組進(jìn)行冰凍保存。將另一組腫瘤組織重復(fù)步驟1和2進(jìn)行在體組織傳代，得到在體腫瘤組織庫?；蛘邔⑺霰鶅霰４娴哪[瘤組織復(fù)蘇后重復(fù)步驟1和2進(jìn)行腫瘤組織細(xì)胞傳代，得到在體腫瘤組織庫。

實(shí)施例3、不同凍存時(shí)間對(duì)結(jié)腸癌移植瘤模型的成瘤率的影響

將實(shí)施例1凍存4-52周(4、12、24、48、52周)的腫瘤組織根據(jù)實(shí)施例2的方法進(jìn)行移植瘤模型的建立(每個(gè)凍存時(shí)間均設(shè)置至少5只小鼠)，自移至腫瘤組織4周后統(tǒng)計(jì)不同凍存時(shí)間對(duì)結(jié)腸癌移植瘤模型的成瘤率的影響。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置新鮮未經(jīng)凍存的實(shí)施例1中的腫瘤組織作為對(duì)照。

結(jié)果如圖1所示。由圖可見：采用本發(fā)明的凍存方法復(fù)蘇腫瘤組織后，移植于免疫缺陷小鼠，在移植后的24周內(nèi)與移植新鮮腫瘤組織的小鼠相對(duì)比，兩者的移植成功率均為90％以上，兩者的移植成瘤成功率無明顯差異。

本發(fā)明實(shí)施例1所提供的實(shí)體腫瘤組織的凍存方法，可以使組織凍存、復(fù)蘇后復(fù)蘇率達(dá)到90％以上，極大提高了原代腫瘤組織的復(fù)蘇存活率。本發(fā)明提供的實(shí)體腫瘤組織的凍存方法，可使復(fù)蘇后的腫瘤組織與新鮮獲得的腫瘤組織保持同樣的組織、遺傳學(xué)生物特征，以保證其可以代替新鮮腫瘤組織進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞、分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究。

實(shí)施例4、腫瘤組織凍存、復(fù)蘇后蘇木精-伊紅染色(he染色)實(shí)驗(yàn)

將實(shí)施例1中凍存24周的腫瘤組織置于37℃水浴中復(fù)蘇，復(fù)蘇后用4％多聚甲醛固定處理，然后用石蠟包埋；常規(guī)石蠟切片；脫蠟后進(jìn)行he染色，具體如下：

1、二甲苯脫蠟2×10min；

2、無水乙醇洗去二甲苯2×5min；

3、95％、80％乙醇各10min，自來水洗lmin(不要讓急水直接沖至載玻片上的組織)，蒸餾水洗1min；

4、蘇木素染色4min，自來水洗2min；

5、1％鹽酸酒精分化20s(鏡下控制)，自來水洗2min；

6、1％稀氨水返藍(lán)30s(鏡下控制)，自來水洗2分鐘，蒸餾水洗1min；

7、伊紅染色90s；

8、80％乙醇脫水10s，95％酒精10s，無水乙醇5min；

9、無水乙醇10min；

10、二甲苯2×10min；

11、中性樹膠或加拿大樹膠封片。

在olympus顯微鏡下觀察，并進(jìn)行記錄。

實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置新鮮未經(jīng)凍存的實(shí)施例1中的腫瘤組織作為對(duì)照。

如圖2所示，a代表新鮮的腫瘤組織的he染色結(jié)果，b代表本發(fā)明凍存、復(fù)蘇后腫瘤組織的he染色結(jié)果。c代表常規(guī)方法凍存、復(fù)蘇后腫瘤組織的he染色結(jié)果。由圖可見：本發(fā)明方法凍存、復(fù)蘇后的腫瘤組織與常規(guī)凍存、復(fù)蘇后的腫瘤組織相比較，更接近新鮮腫瘤組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，提示本發(fā)明的凍存和復(fù)蘇過程未明顯影響腫瘤特性。