專利名稱：檢測(cè)活組織中幽門螺桿菌的組合物、試劑盒和方法
背景技術(shù)：
(a)發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及引起腸胃失調(diào)的細(xì)菌源幽門螺桿菌(Helicobacter pylori)(下面稱之為H.pylori)的檢測(cè)，特別涉及一種將銨離子定量測(cè)定的酚鹽方法用于常規(guī)脲酶的酶試驗(yàn)而產(chǎn)生的檢測(cè)幽門螺桿菌用的組合物，和涉及使用該組合物的檢測(cè)試劑盒和方法。
(b)相關(guān)技術(shù)的描述幽門螺桿菌是已知的一種引起包括胃癌和胃十二指腸潰瘍的腸胃失調(diào)的細(xì)菌源，WHO已將幽門螺桿菌定為典型的致癌原。幽門螺桿菌的精確診斷，即準(zhǔn)確檢測(cè)，應(yīng)當(dāng)有助于治愈這種幽門螺桿菌引起的腸胃失調(diào)。迄今為止所使用的幽門螺桿菌檢測(cè)方法可以主要分為兩種類型，即不使用內(nèi)窺鏡的非侵襲性測(cè)試和使用內(nèi)窺鏡得到檢測(cè)用活檢組織的侵襲性測(cè)試。
非侵襲性測(cè)試包括血清學(xué)測(cè)試和13C或14C呼吸測(cè)試。測(cè)定幽門螺桿菌抗體的血清學(xué)測(cè)試的問題在于抗體的存在不一定就表示疾病的發(fā)展，因?yàn)榧膊≈斡罂贵w水平的降低要6個(gè)月以上。13C或14C呼吸測(cè)試應(yīng)用的原理是當(dāng)攝食由13C或14C標(biāo)記的脲時(shí)，如果幽門螺桿菌存在的話，則其轉(zhuǎn)化為胃中標(biāo)記的CO2，并且在呼出的空氣中檢測(cè)到。但是，該方法不經(jīng)常使用，因?yàn)槠渖婕鞍嘿F的儀器。
另一方面，比較通常使用的是侵襲性測(cè)試來檢測(cè)幽門螺桿菌。使用內(nèi)窺鏡內(nèi)窺期間采集的活檢組織樣品的侵襲性測(cè)試的檢測(cè)方法包括組織學(xué)方法、PCR(聚合酶鏈反應(yīng))方法、培養(yǎng)法和脲酶測(cè)試。組織學(xué)是通過一般的組織檢測(cè)證實(shí)幽門螺桿菌存在的方法；PCR方法是通過使用聚合酶鏈反應(yīng)證實(shí)幽門螺桿菌存在的方法；培養(yǎng)法是直接培養(yǎng)來自活檢組織的幽門螺桿菌的方法。但是，問題在于所有這些方法都較困難而且耗費(fèi)大量時(shí)間，所以不能商業(yè)化應(yīng)用。
脲酶的酶測(cè)試是容易在內(nèi)窺鏡室中使用的而且是最有效的方法，這是因?yàn)橛拈T螺桿菌產(chǎn)生的脲酶與其它微生物相比具有高得多的活性。也就是說，如果脲酶存在，則檢測(cè)試劑盒中加入的脲被分解，并且產(chǎn)生的氨引起pH增加，使pH指示劑反應(yīng)和變色。幽門螺桿菌檢測(cè)方法就是測(cè)定脲酶的這一活性大小。目前使用脲酶酶測(cè)試的商售試劑盒是“CLOtest”(USPNo.4748113)，“Hpfast”(USP No.5439801)，和“Pyloritek”(USP No.5314804和5420016)?！癈LOtest”中使用的組合物含有10-40g/l脲、1-5g/l殺細(xì)菌劑、有效量的pKa6.5-8.5指示劑(酚紅)和余量的是水，pH為5.0-6.5。但是CLOtest的問題在于因?yàn)樯鲜鼋M合物和幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶的反應(yīng)速度慢，所以陽性比例隨著各個(gè)讀數(shù)者變化。因此，只有在大約24小時(shí)之后才可能診斷，并且在內(nèi)窺鏡檢查日不能得到診斷結(jié)果，這很不方便，需要患者再次到醫(yī)院。此外，多于24個(gè)小時(shí)之后，出現(xiàn)各種顏色使得精確診斷困難。Hpfast在原理上類似于CLOtest，但是不同之處在于加入了細(xì)胞壁去污劑并且用酚紅、甲基紅、和溴麝香草酚藍(lán)的混合物作為指示劑。使用Hpfast，從pH6.2的深綠色測(cè)得幽門螺桿菌陽性和pH6.0的淺綠色測(cè)得幽門螺桿菌陰性。但是，深綠色和淺綠色的精確讀數(shù)困難。Pyloritek使用了多層試驗(yàn)裝置，不同于上面提到的CLOtest和Hpfast，其主要特征在于脲酶進(jìn)行反應(yīng)的部分和反應(yīng)產(chǎn)物作為氨檢測(cè)的部分是在不同的層上，并且各層的pH是不同的。盡管Pyloritek可以在一個(gè)小時(shí)內(nèi)產(chǎn)生診斷結(jié)果，但是如果測(cè)定時(shí)間超過一小時(shí)，則假陽性比例增大。因此，如果在內(nèi)窺鏡檢查期間不遵守精確的時(shí)間，則假陽性的可能性增加。
此外，上面提到的包括CLOtest和Pyloritek等的脲酶酶方法還能與例如人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、唾液球鏈菌(Streptococcus salivarius)、產(chǎn)氣假桿菌(E.aerofacienes)、發(fā)酵乳細(xì)菌(L.fermentum)等這些桿菌所具有的少量低活性的脲酶發(fā)生反應(yīng)，并且在長(zhǎng)的鑒定時(shí)間情況下假陽性比例會(huì)增大。
發(fā)明概述本發(fā)明的目的是要解決上面提到的常規(guī)技術(shù)中的問題，通過提供幽門螺桿菌檢測(cè)組合物、幽門螺桿菌試劑盒、和使用上述組合物快速和精確測(cè)定是否存在引起腸胃失調(diào)細(xì)菌源的幽門螺桿菌感染的方法。本發(fā)明還提供在一定時(shí)間過后的相同試驗(yàn)結(jié)果，并且其可以容易地在內(nèi)窺鏡室中使用。
為了實(shí)現(xiàn)上述本發(fā)明目的，本發(fā)明首先提供檢測(cè)幽門螺桿菌的檢測(cè)組合物，該組合物含有0.5-4vol％脲、0.05-0.2vol％KH2PO4、0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液、0.002-0.005vol％具有pKa值是6.5-8.5的指示劑和平衡量的水。在上述的組成中，所述0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液優(yōu)選的組成為0.5-1vol％硫酸錳溶液、0.2-0.5vol％次氯酸鹽試劑和0.1-0.2vol％酚鹽試劑，并且上述指示劑優(yōu)選是酚紅。此外，所述組合物更優(yōu)選含有0.5-2vol％膠凝劑。特別是所述組合物最優(yōu)選含有2vol％脲、0.05vol％KH2PO4、1vol％硫酸錳溶液、0.5vol％次氯酸鹽試劑、0.2vol％酚鹽試劑、0.0025vol％酚紅、1vol％瓊脂和平衡量的水。并且所述組合物的pH優(yōu)選為6.0-7.8。
其次，本發(fā)明得到了上述組合物并且提供了一種檢測(cè)幽門螺桿菌的試劑盒，該試劑盒包括活檢組織取樣試驗(yàn)裝置、向所述成分中進(jìn)一步加入10-20μl0.1N氫氧化鈉溶液而產(chǎn)生的陽性對(duì)照、和由不放活檢組織的成分制得的陰性對(duì)照。
第三，本發(fā)明提供一種從活檢組織中檢測(cè)幽門螺桿菌的方法，其檢測(cè)步驟包括用所述組合物等活檢組織反應(yīng)，和觀察所述組合物的顏色變化。
附圖的簡(jiǎn)要說明插入說明書并且構(gòu)成說明書的一部分的這些附圖詳細(xì)說明了本發(fā)明的實(shí)施方案，并且與說明書一起來解釋本發(fā)明的原理

圖1是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的透視圖；圖2是本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的截面圖；和圖3是說明本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用例的附圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)描述在下面的詳細(xì)描述中，通過簡(jiǎn)要說明本發(fā)明的發(fā)明人所設(shè)計(jì)的最佳方式只是表明和描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案。人們將會(huì)理解，本發(fā)明能作各種明顯相關(guān)的改變，而所有的各種改變均不能脫離本發(fā)明的范圍。因此，該附圖和說明書被認(rèn)為是舉例說明發(fā)明的實(shí)質(zhì)而不是限制。
下面，解釋本發(fā)明的更詳細(xì)的細(xì)節(jié)在檢測(cè)幽門螺桿菌中，發(fā)明人試圖顯著地降低由讀數(shù)的主觀性所造成的假陽性比例，為此將脲酶測(cè)試從傳統(tǒng)所用的方法改變?yōu)槭褂靡环N快速變化顏色的組合物，通過該測(cè)試結(jié)果同時(shí)進(jìn)行陽性對(duì)照和陰性對(duì)照的比較就能迅速做出準(zhǔn)確的測(cè)定。也就是說，因?yàn)槭褂秒迕笢y(cè)試的試劑盒檢測(cè)由OH-離子引起的pH增加(該OH-是由水和簡(jiǎn)單分解脲而生成氨的反應(yīng)所產(chǎn)生的)，為了提高pH變化的速度，發(fā)明人試圖減少銨離子本身。為此，發(fā)明人使用了在銨離子定量測(cè)定中所使用的酚鹽方法(“水和廢水的檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法”(Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater)第9版，1995，American Public Health Association，pp.4-80--4-82)。
通過脲酶的脲分解過程如下面的反應(yīng)式表示[反應(yīng)式1]
(脲)
總反應(yīng)本發(fā)明的這些成分由于上述脲分解過程的產(chǎn)物(即銨離子)轉(zhuǎn)化為靛酚藍(lán)使脲繼續(xù)分解，因此能很快提高pH。為了實(shí)現(xiàn)上述目的而使用的酚鹽方法是測(cè)定水溶液中氨濃度的非常有效的方法。酚鹽方法使用的原理是在錳催化劑存在下氨與次氯酸鹽堿反應(yīng)，使酚變?yōu)榈宸铀{(lán)，這可以由如下反應(yīng)式描述[反應(yīng)式2]
即，為了快速提高pH，在常規(guī)脲酶酶測(cè)試所使用的成分中加入酚鹽試劑溶液，并且通過上述脲酶將脲分解過程中產(chǎn)生的銨離子轉(zhuǎn)化為靛酚藍(lán)，從而本發(fā)明中這些成分能使反應(yīng)速度提高得更快。
另外，成分中有NaOCl，其起著降低假陽性的作用，這是由于來自桿菌的脲酶提高濃度之后而引起的，因?yàn)槠鋵?duì)弱的脲酶活性具有抑制作用。這也使測(cè)定結(jié)果在較長(zhǎng)測(cè)定時(shí)間之后獲得。
在本發(fā)明中，酚鹽試劑溶液的加入量被調(diào)節(jié)在一定范圍內(nèi)，使得幽門螺桿菌脲酶活性不受到抑制并且pH指示劑的顏色變化不受影響。本發(fā)明成分和各成分可能的含量范圍如下0.5-4vol％脲，0.05-0.2vol％KH2PO4，0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液，0.002-0.005vol％pKa值為6.5-8.5的指示劑和平衡量的水。
上述組合物中，脲起著幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶底物的作用，對(duì)于測(cè)定幽門螺桿菌產(chǎn)生的脲酶的活性，大約0.5-4vol％含量是合適的水平。起著緩沖液作用的KH2PO4含量應(yīng)當(dāng)是0.05-0.2vol％，即在低于0.05vol％時(shí)不能獲得所需pH范圍，并且在高于0.2vol％下有抑制pH變化的趨勢(shì)。起著將銨離子轉(zhuǎn)化為靛酚藍(lán)并且抑制其它微生物的脲酶活性作用的酚鹽試劑溶液含量應(yīng)當(dāng)是0.8-1.7vol％，即在低于0.8vol％下不足以起到減少銨離子而提高pH變化速度的作用和對(duì)其它微生物的脲酶活性的抑制作用，但高于1.7vol％時(shí)，pH提高得太高，并且其它微生物以及幽門螺桿菌的脲酶活性有被抑制的趨勢(shì)。pKa值是6.5-8.5的指示劑起著對(duì)pH變化敏感的作用，在本發(fā)明中酚紅是最合適的，對(duì)于精確測(cè)定，優(yōu)選在0.002-0.005vol％之間。酚紅具有在酸性溶液中表現(xiàn)出黃色和在堿性溶液中為紫紅色的特征。
上述酚鹽試劑溶液含有用作催化劑的硫酸錳溶液、用作與銨離子反應(yīng)的反應(yīng)物次氯酸鹽試劑和酚鹽試劑，其所需的具體組成為1vol％硫酸錳溶液，0.5vol％次氯酸鹽試劑和0.2vol％酚鹽試劑。此外，該組成中進(jìn)一步需要含有0.5-2vol％膠凝劑，例如瓊脂，因?yàn)檫@樣其可以軟凝膠形式方便地使用。優(yōu)選將成分pH控制在6.0-7.8范圍內(nèi)，因?yàn)樵谠摲秶鷥?nèi)有助于精確測(cè)定。
本發(fā)明組合物的具體組成和含量范圍如下2vol％脲，0.05vol％KH2PO4，1vol％硫酸錳溶液，0.5vol％次氯酸鹽試劑，0.2vol％酚鹽試劑，0.0025vol％酚紅，1vol％瓊脂和平衡量的水。
另一方面，本發(fā)明中使用的酚鹽試劑溶液的貯存溶液所需的成分和含量如下硫酸錳溶液；0.05vol％MnSO4.H2O，和平衡量的蒸餾水，次氯酸鹽試劑；1vol％NaOCl，和平衡量的水，酚鹽試劑；2.5vol％NaOH，8vol％苯酚，和平衡量的蒸餾水。
本發(fā)明將內(nèi)窺鏡獲得的活檢組織放置在由上述成分制備的凝膠上并觀察顏色變化。由上述成分制備凝膠，并且通過向上述成分加入少量的可以表現(xiàn)出陽性結(jié)果的NaOH(即10-20μl 0.1N NaOH溶液)來制備陽性對(duì)照凝膠。通過比較其中根本沒有加入NaOH的陰性對(duì)照凝膠的顏色可以測(cè)定是否存在幽門螺桿菌感染。因此，帶有陽性和陰性對(duì)照一起放置，用指示陽性或陰性的顏色來觀察結(jié)果并進(jìn)行比較，該測(cè)定裝置能減少由于讀數(shù)者主觀性所帶來的錯(cuò)誤測(cè)定結(jié)果。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒的透視圖在圖1中表示，側(cè)面圖在圖2中表示。根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定試劑盒的應(yīng)用實(shí)施例也在圖3中表示。參照上述圖1-3，1是蓋，2是容器，最好用丙烯酸材料制備的透明容器，3是本發(fā)明的檢測(cè)組合物，4是測(cè)試裝置，5是活組織檢查樣品區(qū)域，該區(qū)域需要進(jìn)行不透光處理，使得從側(cè)面看不到活檢樣品，6是陰性對(duì)照，7是陽性對(duì)照和8是活檢樣品。
以下描述了本發(fā)明所要求的實(shí)施例和對(duì)照例。但是，下面描述的實(shí)施例只是本發(fā)明許多實(shí)施例中的一部分，本發(fā)明并不限制于下面描述的實(shí)施例。制備幽門螺桿菌檢測(cè)組合物首先制備下面描述的貯備溶液的組合物20vol％脲，2vol％KH2PO4，0.01vol％酚紅，和2vol％瓊脂。
在向50mg MnSO4.H2O加蒸餾水制備100ml硫酸錳溶液的同時(shí)，通過向10ml 10％NaOCl加蒸餾水制備100ml次氯酸鹽試劑，并且用濃的次氯酸將pH調(diào)節(jié)到6.8。向2.5gNaOH和8ml苯酚加入蒸餾水制備100ml酚鹽試劑。上述瓊脂溶液高壓滅菌處理(121℃，1.5大氣壓)15分鐘后，將其單獨(dú)置放，直到在55℃水罐中使用，制備下述2×試劑。
將上述10ml脲貯備溶液，2.5ml KH2PO4貯備溶液，25ml酚紅貯備溶液，1ml硫酸錳溶液，0.5ml次氯酸鹽試劑和0.2ml酚鹽試劑并加入蒸餾水制備50ml混合物。通過0.2μm過濾器過濾上述制備的2×試劑的桿菌后，混合相同量2％瓊脂溶液。其結(jié)果是，各成分的終濃度如下(此時(shí)最終pH是7.5)2％脲，0.05％KH2PO4，0.0005％硫酸錳，0.005％NaOCl，0.2％酚鹽試劑(0.005％NaOH，0.016％苯酚)，0.0025％酚紅和1％瓊脂。制備幽門螺桿菌檢測(cè)試劑盒將自實(shí)施例1制備的組合物注射到裝有從內(nèi)窺鏡獲得的活檢組織測(cè)定裝置多孔板的一個(gè)孔中，向另一個(gè)孔注入制備的組合物并向上述組合物進(jìn)一步加入10μl 0.1N NaOH而制備陽性對(duì)照，將上述組合物注射到另一個(gè)孔中而制備陰性對(duì)照，從而制備幽門螺桿菌檢測(cè)試劑盒。上述檢測(cè)試劑盒稱之為“PET(Pylori Easy Test)試劑盒”。獲得患者活檢組織后，同時(shí)在該活檢組織上使用CLOtest和實(shí)施例2的PET，并且比較每小時(shí)的陽性比例，結(jié)果描述于下面的表1。每小時(shí)陽性比例
※7讀數(shù)難以測(cè)定。
結(jié)果，PET可確定在一個(gè)小時(shí)內(nèi)總陽性76.9％和3小時(shí)之后100％。另一方面，CLOtest只證實(shí)陽性的17.6-30％和只有在24小時(shí)之后為100％。但是，24小時(shí)之后出現(xiàn)不能被明確區(qū)分的難以辨別的顏色，并且根據(jù)觀察者的不同陽性比例從38.4％(10/26)至65.3％(17/26)變化。因此可見在本發(fā)明使用PET的情況下快速測(cè)定是可能的。
此后，我們觀察了PET結(jié)果與PCR方法的一致性程度。這里，PCR方法使用了26kDa蛋白質(zhì)基因的擴(kuò)增方法，這已知是幽門螺桿菌測(cè)定中最獨(dú)特和敏感的方法(Ho，S.等，1991，用于人和動(dòng)物中幽門螺桿菌測(cè)定的直接聚合酶鏈反應(yīng)(Direct Polymerase Chain Reaction Test for detection ofH.Pyori in Human and Animal)，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microbiol)，29pp2543-2549)。結(jié)果在下面的表2中描述與PCR方法一致性比
面的表2中看出，使用發(fā)明PET時(shí)，所有26份活檢組織與PCR方法的結(jié)果相一致，并且一致性比例范圍對(duì)于CLOtest是61.5-80.7％之間。因此，我們可以看到，判斷本發(fā)明PET比CLOtest更精確是可能的。內(nèi)窺鏡檢查獲得的活檢組織在-20℃冷凍1星期，然后根據(jù)試驗(yàn)例1中相同的方法進(jìn)行PET和CLOtest的試驗(yàn)，比較結(jié)果在表3和表4中表示。每小時(shí)的陽性比例
表4]與PCR的一致性
桿菌的脲酶活性降低到一定程度的活檢組織的精確測(cè)定是可能的，這一點(diǎn)是值得注意的。
本發(fā)明提供能快速精確地測(cè)定出是否存在幽門螺桿菌(引起腸胃失調(diào)的細(xì)菌源)感染的幽門螺桿菌檢測(cè)組合物，即使在時(shí)間已過去之后仍然可以獲得相同的結(jié)果，并且該組合物容易在內(nèi)窺鏡室中使用。本發(fā)明提供幽門螺桿菌檢測(cè)試劑盒和使用幽門螺桿菌檢測(cè)組合物的方法。為了檢查PET的幽門螺桿菌特性，對(duì)內(nèi)窺鏡檢查獲得的活檢組織中分離的幽門螺桿菌桿菌和人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)桿菌檢查了脲酶分解能力。
檢查方法包括首先培養(yǎng)幽門螺桿菌桿菌和人葡萄球菌桿菌，并且在滅菌蒸餾水中稀釋，這樣得到合適數(shù)目的桿菌，然后根據(jù)試驗(yàn)例1中描述的相同的方法進(jìn)行PET和CLOtest，并且比較。結(jié)果在表5中描述。幽門螺桿菌桿菌和人葡萄球菌桿菌的特性比較
從上述表5中注意到，如果使用本發(fā)明的PET，則能檢測(cè)出明顯不同的特性，即幽門螺桿菌的脲酶活性表現(xiàn)出快速反應(yīng)和其它桿菌的脲酶活性表現(xiàn)出慢的反應(yīng)。
以上已經(jīng)詳細(xì)描述了本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案，但應(yīng)該清楚地理解，這里所指出的對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是很清楚的基本發(fā)明概念的很多變化和/或修改將落在權(quán)利要求書中所定義的本發(fā)明的構(gòu)思和范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.用于檢測(cè)幽門螺桿菌的組合物，包括a)0.5-4vol％脲，b)0.05-0.2vol％KH2PO4，c)0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液，d)0.002-0.005vol％具有pKa值為6.5-8.5的指示劑，和e)平衡量的水。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述檢測(cè)幽門螺桿菌的組合物中的0.8-1.7vol％酚鹽試劑溶液包括a)0.5-1vol％硫酸錳溶液，b)0.2-0.5vol％次氯酸鹽試劑，和c)0.1-0.2vol％酚鹽試劑。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是檢測(cè)幽門螺桿菌的組合物，其中指示劑是酚紅。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是進(jìn)一步含有0.5-2vol％膠凝劑的檢測(cè)幽門螺桿菌的組合物。
5.權(quán)利要求4的組合物，其中所述組合物是檢測(cè)幽門螺桿菌的組合物，包括；a)2vol％脲，b)0.05vol％KH2PO4，c)1vol％硫酸錳溶液，d)0.5vol％次氯酸鹽試劑，e)0.2vol％酚鹽試劑溶，f)0.0025vol％酚紅，g)1vol％瓊脂，和h)平衡量的水。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述組合物是pH為6.0-7.8的幽門螺桿菌檢測(cè)組合物。
7.檢測(cè)幽門螺桿菌的試劑盒，包括a)由放置活檢組織的權(quán)利要求4的組合物制成的測(cè)定裝置；b)在權(quán)利要求4的組合物中進(jìn)一步加入10-20μl0.1N NaOH溶液而制得的陽性對(duì)照；和c)由沒有放置活檢組織的權(quán)利要求4的組合物制得的陰性對(duì)照。
8.檢測(cè)活檢組織中幽門螺桿菌的方法，包括下面的步驟a)使活檢組織與權(quán)利要求1的所述組合物反應(yīng)；和b)觀察與組合物反應(yīng)的所述活檢組織的顏色變化。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于檢測(cè)幽門螺桿菌的組合物,包括0.5—4vol%脲、0.05—0.2vol%KH
文檔編號(hào)C12Q1/10GK1266461SQ99800633
公開日2000年9月13日 申請(qǐng)日期1999年4月2日 優(yōu)先權(quán)日1998年4月3日
發(fā)明者李鐘和, 李學(xué)成, 盧姙奐, 金晸澤, 河泳七, 崔泰富 申請(qǐng)人:李鐘和, 李學(xué)成, 盧姙奐, 金晸澤, 河泳七, 崔泰富