專(zhuān)利名稱(chēng)：蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果糖的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及由蔗糖制備工業(yè)量的葡萄糖和/或果糖的方法和實(shí)施所述方法的反應(yīng)器。特別是本發(fā)明涉及由蔗糖通過(guò)蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶和/或葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，接著分離葡萄糖和果聚糖(polyfructan)，果糖和葡聚糖(polyglucan)或二者以制備葡萄糖和/或果糖的方法。
背景說(shuō)明葡萄糖和果糖是從自然界發(fā)現(xiàn)的糖類(lèi)，或以單糖形式或加入多糖中。葡萄糖在臨床上用作液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，在微生物培養(yǎng)中用作碳源，并廣泛用作食品添加劑。果糖在臨床上也用作液體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑并廣泛用作食品添加劑。
在工業(yè)上葡萄糖由淀粉(Dean，Gottfried，Advan.Carbohyd.Chem.5，127(1950))和用酸水解蔗糖制備。果糖用旋復(fù)花粉水解(Bates et al.Natl.Bur.Std (U.S.)Circ.C440，39(1942))，由右旋糖(Cantor，Hobbs US2,354,664)和由蔗糖酶催化(Koepsell et al.US 2,729,587)制備。不管制備葡萄糖和果糖原料的可利用性，相對(duì)于原料的費(fèi)用這些物質(zhì)的費(fèi)用仍然是高的。因此，葡萄糖和果糖二者的工業(yè)合成可以改進(jìn)。
旋復(fù)花粉是屬于果聚糖類(lèi)的多糖，其存在于包括例如菊芋、大麗花根(dahlia tubers)和菊苣屬根(chicory roots)的不同植物中。旋復(fù)花粉含有連接在αD-葡糖苷上的β-2，1-連接的果糖鏈，具有直鏈結(jié)構(gòu)和一般包括許多β-O-呋喃果糖單元。平均鏈長(zhǎng)度和分子量分布取決于植物種類(lèi)，生長(zhǎng)期和制備方法。一般的平均鏈長(zhǎng)度為10-25，在該情況下各個(gè)鏈含有約9-24個(gè)果糖單元。
旋復(fù)花粉的性質(zhì)根據(jù)鏈長(zhǎng)而變化。含有聚合度約3-7個(gè)果糖單元的短鏈旋復(fù)花粉的組分用作低熱糖的代用品(DE4,003,140)。
葡聚糖是葡萄糖單元的多糖，一般由α-1，3，α-1，6，β-1，2，β-1，3，和β-1，4，鍵連接。含有α-1，3和α-1，6鍵的葡聚糖類(lèi)實(shí)質(zhì)上由許多口腔細(xì)菌例如變異鏈球菌(S.mutans)菌叢產(chǎn)生，并認(rèn)為其參與由產(chǎn)生齲齒病態(tài)的這些細(xì)菌引起的口腔移生。完全基于β-1，4鍵的葡聚糖由像纖維素的植物產(chǎn)生。完全基于β-1，3鍵的葡聚糖由像愈創(chuàng)葡聚糖的植物產(chǎn)生。基于無(wú)規(guī)則鍵的一般用山梨糖醇終止的其他葡聚糖被稱(chēng)為聚糊精，作為食品填充劑使用。
Stoudt等人的US4,340,673報(bào)道了用于改進(jìn)牙斑研究由葡糖基轉(zhuǎn)移酶，蔗糖和內(nèi)α-1，3-葡聚糖-3-葡聚糖水解酶用生物合成法制備的改進(jìn)的葡聚糖。
Gaffar等人的US5,095,106和US5,002,759報(bào)道了有至少一個(gè)巖藻糖部分或半乳糖部分的低聚糖，不含雙半乳糖和N-乙?；窠?jīng)氨基乳糖的所述的低聚糖用于抑制釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)粘附于咽和口腔粘膜細(xì)胞上。
Taubman等人的US4,150,116報(bào)道了變異鏈球菌(Strepotcoccusmutan)的移生可以通過(guò)用提純形式的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的免疫接種抑制。
Eigen等人的US4,619,825報(bào)道了斑的抑制可通過(guò)用水分散乳液處理。
Hillman等人的US4,133,875報(bào)道了變異鏈球菌(Streptococcusmutans)的效應(yīng)物菌株可以有效的控制齲齒的發(fā)生和加重。
在果糖生產(chǎn)領(lǐng)域中Kerkhoffs等人的US4,277,563報(bào)道了用果聚糖例如旋復(fù)花粉水解分離果糖。
Bichsel等人的US4,263,052報(bào)道了用呋喃果糖苷例如蔗糖的水解生產(chǎn)果糖和用鈣-果糖絡(luò)合物的沉淀濃縮果糖。
Fan等人的US4,774,183報(bào)導(dǎo)了通過(guò)與優(yōu)選使用葡萄糖的微生物例如出芽茁霉(pullularia pullulans)接觸可以由果糖和葡萄糖的混合物中分離果糖。
Bringer等人的US4,742,006報(bào)道了由果糖和葡萄糖的混合物通過(guò)與運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的葡萄糖分解突變種接觸生產(chǎn)果糖。
在葡萄糖的生產(chǎn)領(lǐng)域，Nagle等人的US4,637,835報(bào)道了由α-纖維素用氯化鈣催化劑和氫離子制備葡萄糖和其他糖。
Miyawaki等人的US5,524,075報(bào)道了通過(guò)用酶糖化液化的淀粉生產(chǎn)高純度的葡萄糖。
Venkatasubramanian等人的US4,299,677報(bào)道了用離子交換膜由葡萄糖和果糖的混合物直接分離果糖和葡萄糖。
Harada等人的US5,169,679報(bào)道了使用主要含有β-2，1-鍵的分子量2,000-20,000,000的果聚糖作為食品添加劑，例如生產(chǎn)低熱食品的填充劑或脂肪替代物。
Kurz等人的US5,478,732報(bào)道了通過(guò)用水解酶處理粗的旋復(fù)花粉懸浮液得到中鏈(例如聚合度10-12)旋復(fù)花粉的方法。在酶催化處理中，短鏈組分降解為單和二糖而長(zhǎng)鏈旋復(fù)花粉被分離，然后轉(zhuǎn)變?yōu)楦稍镄问健?br> Adachi等人的US4,681,771中報(bào)道了在蔗糖(G-F)與具有果糖轉(zhuǎn)移活性的酶(下文稱(chēng)為果糖基轉(zhuǎn)移酶)接觸時(shí)，得到低熱、低生齲的增甜劑組合物，包括葡萄糖、蔗糖、三糖(GF2)、四糖(GF3)以及少量果糖、五糖(GF4)和六糖(GF5)。高級(jí)旋復(fù)花粉的量顯著地降低，大部分是GF2-3。
Kono等人的US5,314,810報(bào)導(dǎo)了在蔗糖的反應(yīng)中使用的固定化的果糖基轉(zhuǎn)移酶的半存留期可以通過(guò)載于顆粒載體例如脫乙酰殼多糖衍生物或陰離子交換樹(shù)脂改進(jìn)。已報(bào)道上述載體上的酶可用于工業(yè)生產(chǎn)低生齲的增甜劑組合物。
Heady等人的US4,317,880報(bào)道了通過(guò)果糖基轉(zhuǎn)移酶和葡萄糖異構(gòu)酶制劑的結(jié)合作用由蔗糖生產(chǎn)新的果糖聚合物和高果糖糖漿。
Heady等人的US4,335,207報(bào)道了從蔗糖通過(guò)與果糖基轉(zhuǎn)移酶接觸接著用酵母制劑發(fā)酵制備果糖聚合物和乙醇的兩步方法。
然而，現(xiàn)存的由蔗糖制備葡萄糖和果糖的方法效率低劣，以致于可以改進(jìn)工業(yè)量葡萄糖和果糖的生產(chǎn)。
此外，仍需要制備工業(yè)量的多糖方法，例如旋復(fù)花粉，特別是GF4-5和葡聚糖，例如聚糊精代用品、纖維素、淀粉，和可用于治療齲齒的那些。
發(fā)明概要本發(fā)明的目的是提供由蔗糖制備工業(yè)量的葡萄糖和/或果糖的方法。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供由蔗糖制備工業(yè)量的葡萄糖和果聚糖的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供由蔗糖制備工業(yè)量的果糖和葡聚糖的方法。
這些和其他目的可以用制備工業(yè)量的葡萄糖和/或果糖的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法包括反應(yīng)器中蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶和/或葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，和從其中分離工業(yè)量的葡萄糖和/或果糖。
上述目的也可以用制備工業(yè)量的葡萄糖的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法通過(guò)在反應(yīng)器中蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，產(chǎn)生含有葡萄糖和果聚糖的反應(yīng)產(chǎn)物，接著分離工業(yè)量的葡萄糖。
上述目的也可以用制備工業(yè)量的果糖的方法實(shí)現(xiàn)，所述方法通過(guò)在反應(yīng)器中蔗糖與葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸，產(chǎn)生含有果糖和葡聚糖的反應(yīng)產(chǎn)物，接著分離工業(yè)量的果糖。
本發(fā)明部分根據(jù)發(fā)現(xiàn)果糖基轉(zhuǎn)移酶可以用于由蔗糖(GF)制備工業(yè)量的葡萄糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以用于由蔗糖(GF)制備工業(yè)量的果糖。此外，在用蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)生成葡萄糖中產(chǎn)生的果聚糖和在用蔗糖與葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)生成果糖中產(chǎn)生的葡聚糖可以以工業(yè)量分離，以進(jìn)一步提高本方法的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明正如考慮附圖時(shí)通過(guò)參考下列詳細(xì)的說(shuō)明會(huì)更好地理解一樣，對(duì)本發(fā)明及其許多伴隨優(yōu)點(diǎn)將更易獲得較完整的了解。


圖1描繪蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果聚糖的流程圖；圖1a描繪在裝有葡萄糖外部分離器的反應(yīng)器中蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果聚糖的流程圖；圖2描繪在兩個(gè)反應(yīng)器中蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果聚糖的流程圖2a描繪在兩個(gè)都裝有葡萄糖外部分離器的反應(yīng)器中蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果聚糖的流程圖；圖3描繪蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和葡聚糖的流程圖；圖4描繪在兩個(gè)反應(yīng)器中蔗糖轉(zhuǎn)化成果糖和葡聚糖的流程圖；和圖5描繪由蔗糖生產(chǎn)葡萄糖和果糖的聯(lián)合方法的示意圖。
優(yōu)選實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明葡萄糖是商業(yè)上的主要商品并以醫(yī)藥和食品用途銷(xiāo)售。果糖也是商業(yè)上的主要商品并也以醫(yī)藥和食品用途銷(xiāo)售。GF4-5用作食品組合物的填充劑。在與增甜劑結(jié)合使用時(shí)，可以得到具有類(lèi)似糖的體積和稠度的增甜組合物。GF4-5幾乎沒(méi)有甜味。含有α-1，3和α-1，6鍵的葡聚糖可以用于治療和預(yù)防齲齒。合成的β-1，4葡聚糖是可以用于制造高質(zhì)量紙的高純度纖維素的原料。由5-11個(gè)葡萄糖單元組成的含有不止一種類(lèi)型葡糖苷鍵和分支鍵的合成的葡聚糖可以用作食品填充劑聚糊精的代用品。因此，制備葡萄糖、果糖、果聚糖和葡聚糖的方法和設(shè)備具有實(shí)用性。
在這里使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“果糖基轉(zhuǎn)移酶”指的是能夠?qū)⒐遣糠洲D(zhuǎn)移到蔗糖或另一糖(例如果聚糖)上的任一種酶或多種酶。蔗糖的果糖部分轉(zhuǎn)移的結(jié)果是產(chǎn)生葡萄糖單元。在優(yōu)選實(shí)施方案中，果糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移蔗糖的果糖部分，生成β-2，1鍵，以致由蔗糖產(chǎn)生旋復(fù)花粉，例如GF4-5。
得到合適的果糖基轉(zhuǎn)移酶的非限定性的例子可來(lái)自下列微生物曲霉素(Aspergillus)，例如米曲霉(A.Oryzae)ATCC20498、A.sp.ATCC20524、泡盛曲霉(A.awamori)、薩氏曲霉(A.Sydowi)和黑色曲霉(A.niger)ATCC20611；青霉屬(Penicillium)，例如詹司克氏青霉(P.jancezewskii)ATCC10115和26546、變黑青霉(P.nigricans)；鐮孢屬(Fusarium)，例如亞麻鐮孢(F.Lini)IAM5011；和短柄霉屬(Aureobasidium)，例如出芽短柄霉(A.pullulans)ACTT9348；變異鏈球菌(Streptococcus mutans)ATCC25175；和(A.pullulans Var.melanigenum)A-8ATCC20612。合適的酶也可以從酵母和下列其他微生物得到如糖酵母屬(Saccharomyuces)，例如啤酒糖酵母(S.cerevisiae)；紅酵母屬(Rhodotorcula)，例如孕激素紅酵母(R.lutinis)；畢赤氏酵母屬(Pichia)，例如豆醬畢赤氏酵母(P.miso)；漢遜氏酵母屬(Hansenula)，例如豆醬漢遜氏酵母(H.miso)；假絲酵母屬(Candida)，例如熱帶假絲酵母(C.tropicalis)；和從高等植物例如天門(mén)冬屬、大麗花根、菊苣屬根和JP-A-56-154967和JP-B-59-53834中說(shuō)明的菊芋。也可以使用產(chǎn)生活性的具有β-2，6鍵的另一種果糖基轉(zhuǎn)移酶(也稱(chēng)為果聚糖合成酶)?？梢砸黄鹗褂卯a(chǎn)生活性的具有β-2，1和β-2，6鍵的果糖基轉(zhuǎn)移酶組合物，生成具有β-2，1和β-2，6鍵均勻分布的果聚糖或含有β-2，1鍵的嵌段和含有β-2，6鍵的嵌段。
一個(gè)特別優(yōu)選的酶是可以從變異鏈球菌中分離的基因得到的細(xì)菌果糖基轉(zhuǎn)移酶。特別是變異鏈球菌ATCC25175，可以是果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的源。果糖基轉(zhuǎn)移酶可以作為具有異源蛋白質(zhì)序列的融合結(jié)構(gòu)得到。合適的融合蛋白質(zhì)例如是從融合在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶C-末端上的變異鏈球菌中分離的果糖基轉(zhuǎn)移酶。
缺少預(yù)計(jì)信號(hào)序列的變異鏈球菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的編碼序列可以用PCR從變異鏈球菌株中分離，PCR可以用于生成表達(dá)果糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)化子。從變異鏈球菌株GS-5分離的另一個(gè)合適的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因序列是由Shiroza，T.和Kuramitsu，H.K.在J.Bacteriol.，170，810-816(1988)中報(bào)道的。
根據(jù)US5,314,810中說(shuō)明的果糖基轉(zhuǎn)移酶可以固定在具有伯胺-季銨的載體上。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，果糖基轉(zhuǎn)移酶至少部分地提純。在這里使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“提純”的意思是所述酶已被提純，至少部分不含天然產(chǎn)生的宿主生物體。提純優(yōu)選導(dǎo)致至少部分除去降解酶，例如可降解果聚糖的旋復(fù)花酶和可降解果糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白酶。所述酶優(yōu)選提純至無(wú)降解酶的程度。在所述酶源是轉(zhuǎn)移的大腸桿菌(E.coli)微生物并且該轉(zhuǎn)移大腸桿菌不含天然降解酶時(shí)可以使用粗的細(xì)胞裂解物。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，提純的果糖基轉(zhuǎn)移酶的合成與降解活性的比例≥1,000∶1，優(yōu)選≥1,500∶1，更優(yōu)選≥2,000∶1(例如對(duì)于每次果聚糖鍵裂解，優(yōu)選至少有1,000的果糖鍵生成)。在1單位等于每分鐘轉(zhuǎn)移至受體1μmol單糖時(shí)，粗的黑色曲霉生長(zhǎng)的上清液含有～90單位/mg蛋白質(zhì)，而DEAE-提純的黑色曲霉制劑含有～2,000單位/mg蛋白質(zhì)。在50℃約2.5天，250mlDEAE-提純的制劑具有足夠的活性將1升50％蔗糖完全轉(zhuǎn)化成葡萄糖和果聚糖。用另一種方法，在50℃連續(xù)地加入蔗糖時(shí)，相同的酶制劑可以連續(xù)地操作至少兩周無(wú)效率的降低。
果糖基轉(zhuǎn)移酶可以提純至活性90-3,000U/mg，優(yōu)選100-2,000U/mg。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，果糖基轉(zhuǎn)移酶的活性≥100U/mg，優(yōu)選≥150U/mg，更優(yōu)選≥200U/mg。
在這里使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“葡糖基轉(zhuǎn)移酶”指的是能夠?qū)⑵咸烟遣糠洲D(zhuǎn)移至葡萄糖或其他糖(例如葡聚糖)上的任一種酶或多種酶。葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以含有許多能夠轉(zhuǎn)移葡萄糖部分的許多酶，提供含有不止一種鍵的葡聚糖。在一個(gè)實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移蔗糖的葡萄糖部分生成葡聚糖。轉(zhuǎn)移蔗糖的葡萄糖部分的結(jié)果是產(chǎn)生果糖單元。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶形成α-1，3和/或α-1，6鍵，以致產(chǎn)生可以用于治療齲齒的葡聚糖。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶形成許多線性鍵和分支鍵，以致產(chǎn)生聚糊精代用品。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶形成β-1，4鍵，以致產(chǎn)生纖維素。在另一個(gè)優(yōu)選方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶形成β-1，3鍵，以致產(chǎn)生愈創(chuàng)葡聚糖。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶形成α-1，4或α-1，6鍵，以致產(chǎn)生淀粉。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶的混合物形成α-1，4和α-1，6鍵，可以產(chǎn)生淀粉。
合適的葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以用本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法得到。例如，葡糖基轉(zhuǎn)移酶由J.F.Robyt在Adv Carbohydr.Chem.Biochem.1995，51133-168中描述。植物纖維素合酶的克隆由J.RPear等人在Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.)(1996)93，(22)，12637-12642中描述。植物愈創(chuàng)葡聚糖合酶的分離由Kamat等人在Archbiochem.Biophys，298(2)731-739中和Kudlicka和Brown在plantphysiol(1997)115(2)643-656中描述。變異鏈球菌合成酶的克隆由Ueda等人在Gene(1988)69，(1)101-109中，Shiroza等人在J.Bacteriol(1987)(9)，4263-4270中和Honda等人在J.Gen.Micro-biol(1990)136，2099-2105中發(fā)表。細(xì)菌糖原(淀粉酶)的克隆由Buttcher等人在J.Bacteriol.(1997)179(10)33244-3330中描述。
合適的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的非限定的例子也可以從US4,438,200中描述的變異鏈球菌和US4,774,183中描述的出芽茁霉得到。
葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以用與US5,314,810中描述的相似方法固定在含有伯胺-季胺的載體上。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶至少部分提純。在這里使用時(shí)，術(shù)語(yǔ)“提純”的意思是所述酶被提純，至少部分不含從天然產(chǎn)生的宿主生物體。提純優(yōu)選導(dǎo)致至少部分除去降解酶，例如可以降解葡聚糖的淀粉酶和可以降解葡糖基轉(zhuǎn)移酶的蛋白酶。所述酶優(yōu)選提純至無(wú)降解酶的程度。在所述酶源是轉(zhuǎn)移的大腸桿菌微生物并且該轉(zhuǎn)移大腸桿菌不含天然的降解酶時(shí)可以使用粗的細(xì)胞裂解物。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，提純的葡糖基轉(zhuǎn)移酶的合成與降解活性比例≥1,000∶1，優(yōu)選≥1,500∶1，更優(yōu)選≥2,000∶1(例如對(duì)于每次葡聚糖鍵裂解，優(yōu)選至少有1,000的葡萄糖鍵生成)。
葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以提純至活性90-3000U/mg，優(yōu)選100-2,000U/mg。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性≥100U/mg，優(yōu)選≥150U/mg，更優(yōu)選≥200U/mg。
本方法的原料是蔗糖或含有蔗糖的組合物。蔗糖指的是從任何蔗糖原料源例如甘蔗或制糖甜菜得到的溶液或干燥形式的精制或粗的二糖。在蔗糖原料中含有的蔗糖量?jī)?yōu)選≥10wt.％，較優(yōu)選≥20wt.％，更優(yōu)選≥50wt.％，最優(yōu)選≥70wt.％。原料可以含有其他物質(zhì)，只要這些物質(zhì)不顯著影響蔗糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖和/或果糖。
蔗糖可以以上述任何形式加入。但是，為了保持總離子強(qiáng)度和反應(yīng)介質(zhì)的濃度，蔗糖以干燥形式或溶液形式連續(xù)地或間歇地加入。蔗糖加入反應(yīng)混合物中的速度和頻率應(yīng)保持多糖高的生產(chǎn)率，且部分取決于轉(zhuǎn)移酶的特性和比活性，反應(yīng)溫度和是否分離葡萄糖和果聚糖。蔗糖加入的最佳速度和頻率由常規(guī)試驗(yàn)測(cè)定，這在本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員的知識(shí)范圍內(nèi)。
本發(fā)明的方法優(yōu)選在水溶液中進(jìn)行。
反應(yīng)介質(zhì)中蔗糖的濃度無(wú)特別的限制，可以是50mM直到飽和。以反應(yīng)混合物的總重量為基準(zhǔn)，按照重量百分?jǐn)?shù)計(jì)，反應(yīng)溶液中蔗糖的量可以是1-80％(按重量計(jì))，一般40-80％W/W，優(yōu)選50-70％W/W，更優(yōu)選約60％W/W。
為了達(dá)到蔗糖充分轉(zhuǎn)化成希望的單糖，優(yōu)選在至少兩個(gè)步驟中進(jìn)行反應(yīng)，用大約50wt.％的蔗糖開(kāi)始轉(zhuǎn)移酶與蔗糖的反應(yīng)。
例如在使用果糖基轉(zhuǎn)移酶生成葡萄糖時(shí)，蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶最初的反應(yīng)產(chǎn)生包括主要的葡萄糖和低級(jí)果聚糖例如GF2和GF3的反應(yīng)混合物。在該步驟葡萄糖優(yōu)選用本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法分離。然后，包括主要的果聚糖和可選擇的葡萄糖的反應(yīng)混合物與果糖基轉(zhuǎn)移酶和附加的蔗糖接觸。在第二次加入蔗糖中，和起果糖轉(zhuǎn)移受體作用的蔗糖分子不同，大多數(shù)蔗糖分子與果聚糖反應(yīng)以致產(chǎn)生葡萄糖和高級(jí)果聚糖。在生產(chǎn)GF2中由2摩爾蔗糖生成1摩爾葡萄糖，而由于生成高級(jí)果聚糖，所以使產(chǎn)生葡萄糖更有效，說(shuō)明如下G-F+G-F→G-F-F+GG-F+G-F+G-F→G-F-F-F+2GGF+G-F+G-F+G-F→G-F-F-F-F+3GG-F+G-F+G-F+G-F+G-F→G-F-F-F-F-F+4G在由2摩爾蔗糖生產(chǎn)GF2時(shí)，作為葡萄糖回收的蔗糖僅約25wt.％。在由3摩爾蔗糖生產(chǎn)GF3時(shí)，作為葡萄糖回收的蔗糖約33wt.％。對(duì)于GF4作為葡萄糖回收的蔗糖約37wt.％，對(duì)于GF5約40wt.％而對(duì)于GF6約41.6wt.％。因此，通過(guò)進(jìn)行兩步反應(yīng)可以得到高收率(以反應(yīng)蔗糖為基準(zhǔn)，＞25wt.％)的葡萄糖，供給工業(yè)合成葡萄糖。
果聚糖GF2和GF3分別由3個(gè)或4個(gè)單糖單元組成，因此，一般可以稱(chēng)為DP3和DP4，說(shuō)明單糖單元的數(shù)目，與它們的本性無(wú)關(guān)。高級(jí)果聚糖可以用單糖單元，例如分別與GF4，GF5和GF6相對(duì)應(yīng)的DP5，DP6和DP7的數(shù)目識(shí)別。同樣，葡聚糖可以用其中包含的單糖單元，例如分別含有3，4，5和6個(gè)單糖單元的葡聚糖的DP3，DP4，DP5和DP6的數(shù)目識(shí)別。
用相似方法在葡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用下由蔗糖合成果糖可以在至少兩個(gè)步驟中進(jìn)行。
蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶或葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)可以在寬的溫度范圍內(nèi)進(jìn)行。反應(yīng)溫度可以是室溫，即18-25℃，直到低于發(fā)生果糖基轉(zhuǎn)移酶或葡糖基轉(zhuǎn)移酶快速失活的溫度。優(yōu)選的溫度是25-60℃。反應(yīng)更優(yōu)選在溫度35-55℃下進(jìn)行。最優(yōu)選的溫度是30-50℃。
含水的反應(yīng)溶液可以不緩沖或用已知的緩沖組分，例如檸檬酸鹽、磷酸鹽和TRIS緩沖劑，在合適的pH下緩沖。在反應(yīng)進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間例如兩周時(shí)優(yōu)選使用緩沖劑。
蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶或葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)可進(jìn)行到足以產(chǎn)生工業(yè)量的葡萄糖和/或果糖的時(shí)間。反應(yīng)時(shí)間可以是2-48天，取決于批料的多少。在用連續(xù)方法進(jìn)行時(shí)，10ml容積可以以2.5g/hr的速度反應(yīng)2-4周，無(wú)明顯的活性損失。
蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶或葡糖基轉(zhuǎn)移酶反應(yīng)的pH無(wú)特別限制，反應(yīng)的最佳pH可以根據(jù)使用的具體酶而變化。一般，pH是4.0-8.0，優(yōu)選5.0-7.5，更優(yōu)選約6.0。
本方法可以用間歇或連續(xù)方式進(jìn)行。連續(xù)反應(yīng)可以通過(guò)用超濾設(shè)備循環(huán)反應(yīng)混合物進(jìn)行，由此，產(chǎn)物從超濾器中以滲透液形式連續(xù)地分離，轉(zhuǎn)移酶保留在來(lái)自超濾器的滯留物中。在需要時(shí)可以加入新鮮的作用物和新鮮的酶以替換失活的作用物和酶，以從超濾器中分離滲透液相同的速度加入反應(yīng)混合物。
反應(yīng)可以在一個(gè)反應(yīng)器或一系列反應(yīng)器中進(jìn)行，反應(yīng)器也可以裝有合適的反應(yīng)物入口和產(chǎn)物出口?？梢赃x擇出口用來(lái)分離具體產(chǎn)物?？赏ㄟ^(guò)裝備分離產(chǎn)物和使其他物料返回反應(yīng)器的合適的分離器達(dá)到選擇。分離器可以是膜形式或色譜柱。在一些情況下，分離器可以包括為選擇分離希望的產(chǎn)物而裝備多個(gè)膜和/或色譜柱。
在生產(chǎn)葡萄糖和/或果糖的反應(yīng)之后，果糖基轉(zhuǎn)移酶和/或葡糖基轉(zhuǎn)移酶可以通過(guò)加熱反應(yīng)混合物至約100℃10-15分鐘失活。如果需要，可以在加熱失活之前或之后用通過(guò)合適大小的過(guò)濾器超濾從反應(yīng)混合物中分離所述酶。
為了說(shuō)明由蔗糖用果糖基轉(zhuǎn)移酶制備葡萄糖提供具體的細(xì)節(jié)。本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員會(huì)意識(shí)到用相似的方法由葡萄糖通過(guò)葡糖基轉(zhuǎn)移酶的作用可以制備果糖。
蔗糖和果糖基轉(zhuǎn)移酶在反應(yīng)器中反應(yīng)。反應(yīng)器可以包括蔗糖入口和葡萄糖的出口。隨著聚合度提高，葡萄糖濃度也提高，以致生成葡萄糖反應(yīng)的速度可能降低。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，在反應(yīng)中從反應(yīng)介質(zhì)中分離葡萄糖?？梢杂帽炯夹g(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法例如膜過(guò)濾或色譜分離葡萄糖。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，色譜包括本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的離子交換和凝膠排阻技術(shù)。可以使用泵提高對(duì)膜或色譜柱的壓力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，葡萄糖出口有使葡萄糖從反應(yīng)介質(zhì)中流出而不使蔗糖，果聚糖或果糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的膜。
葡萄糖可以連續(xù)地，間歇地或半間歇地分離，但是在優(yōu)選方案中，葡萄糖從反應(yīng)介質(zhì)中連續(xù)地分離。
葡萄糖可以用本技術(shù)領(lǐng)域普通技術(shù)熟練人員已知的通用方法例如還可以接著用結(jié)晶法的過(guò)濾法分離和提純。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，果聚糖也可以從反應(yīng)混合物中分離，更優(yōu)選從反應(yīng)混合物中連續(xù)地分離。果聚糖可以用本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法，例如膜過(guò)濾或色譜，如離子交換或凝膠排阻色譜分離。在優(yōu)選方案中，果聚糖出口有果聚糖從反應(yīng)介質(zhì)中流出而不使蔗糖、葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的膜。用另外的方法，果聚糖從反應(yīng)混合物中分離，蔗糖和葡萄糖返回反應(yīng)混合物中。
在優(yōu)選實(shí)施方案中。以起始的蔗糖重量為基準(zhǔn)，產(chǎn)生的果聚糖的量是≥10wt.％，優(yōu)選≥20wt.％，更優(yōu)選≥30wt.％，更優(yōu)選≥40wt.％，最優(yōu)選≥50wt.％。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的葡萄糖的收率，以反應(yīng)的蔗糖重量為基準(zhǔn)，是25～50wt.％，優(yōu)選≥25wt.％，優(yōu)選≥33wt.％，更優(yōu)選≥37wt.％，更優(yōu)選≥40wt.％，最優(yōu)選約≥50wt.％。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，工業(yè)量定義為葡萄糖的生產(chǎn)速度為103-105kg/天，優(yōu)選≥1,000kg/天，優(yōu)選≥2,000kg/天，更優(yōu)選≥5,000kg/天。另外，工業(yè)量的生產(chǎn)速度以蔗糖原料量為基準(zhǔn)。為此，上面定義的生產(chǎn)速度以加工6,000kg蔗糖的設(shè)備為基礎(chǔ)。因此，術(shù)語(yǔ)“工業(yè)量”不是絕對(duì)量，而寧可說(shuō)是工業(yè)上可接受的生產(chǎn)速度。
現(xiàn)在參考圖1，其中1是反應(yīng)器，2是蔗糖入口，3是葡萄糖出口，4是果聚糖出口，5是分離器，它可使葡萄糖透過(guò)而不使蔗糖，果糖基轉(zhuǎn)移酶或果聚糖透過(guò)。蔗糖經(jīng)過(guò)入口2加入含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)器1的一部分中。在該結(jié)構(gòu)中，建立分隔區(qū)以使果聚糖在分離器的一側(cè)被濃縮。反應(yīng)器裝備位于分離器5的葡萄糖側(cè)的葡萄糖出口3。果聚糖的出口4可以裝有使果聚糖通過(guò)但不使蔗糖、葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的分離器(未示出)。
現(xiàn)在參考圖1a，其中1是反應(yīng)器，1a是單獨(dú)的反應(yīng)器部分，2是蔗糖入口，3是葡萄糖出口，4是果聚糖出口，5是葡萄糖分離器。蔗糖經(jīng)過(guò)入口2加入反應(yīng)器1的含有果糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)器部分1a。在該結(jié)構(gòu)中，葡萄糖在經(jīng)過(guò)葡萄糖出口3放出之前從反應(yīng)介質(zhì)中用分離器5分離。在葡萄糖的分離中，剩余的物質(zhì)可以循環(huán)至反應(yīng)器部分1a中。果聚糖的出口4可以裝備使果聚糖通過(guò)但是不使蔗糖、葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的分離器(未示出)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包括蔗糖入口的反應(yīng)器裝備有外部分離器，能將葡萄糖和果聚糖與蔗糖分離。如果有未反應(yīng)的蔗糖，可以將其返回反應(yīng)器。
現(xiàn)在參考圖2，其中1是第一反應(yīng)器，2和11是蔗糖入口，3和8是葡萄糖出口，4是GF2-3或高級(jí)果聚糖出口，5和10是葡萄糖可透過(guò)而蔗糖、果糖基轉(zhuǎn)移酶或果聚糖不可透過(guò)的分離器，6是第二反應(yīng)器，7是GF2-3果聚糖入口，9是GF4-5或高級(jí)果聚糖的出口。使用兩個(gè)反應(yīng)器，分別用允許葡萄糖透過(guò)但不允許蔗糖、果糖基轉(zhuǎn)移酶或GF2和高級(jí)果聚糖透過(guò)的分離器5和10分隔。在第一反應(yīng)器1中，蔗糖的濃度達(dá)到供給GF2合成的程度，然后產(chǎn)物經(jīng)過(guò)GF2-3或高級(jí)果聚糖入口轉(zhuǎn)移到第二反應(yīng)器6中。在第二反應(yīng)器6中，其一部分中含有果糖基轉(zhuǎn)移酶，GF2-3或高級(jí)果聚糖與蔗糖反應(yīng)，其中蔗糖濃度比第一反應(yīng)器中的濃度低。通過(guò)經(jīng)入口11加入蔗糖使蔗糖濃度保持在希望的水平上。低的蔗糖濃度有利于合成高級(jí)果聚糖，因此，有效的合成葡萄糖。使葡萄糖通過(guò)分離器10，并經(jīng)過(guò)葡萄糖出口8排除。在葡萄糖分離中，剩余物質(zhì)可以循環(huán)至反應(yīng)器部分6中。高級(jí)果聚糖可以經(jīng)過(guò)果聚糖出口9排除。果聚糖出口9可以裝備使果聚糖通過(guò)但是不使蔗糖，葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的分離器(未示出)。
現(xiàn)在參考圖2a，其中1是第一反應(yīng)器，1a是單獨(dú)的反應(yīng)器部分，2和11是蔗糖入口，3和8是葡萄糖出口，4是GF2-3或高級(jí)果聚糖出口，5和10是葡萄糖可透過(guò)而蔗糖，果糖基轉(zhuǎn)移酶或果聚糖不可透過(guò)的外部分離器，6是第二反應(yīng)器，6a是單獨(dú)的反應(yīng)器部分，7是GF2-3果聚糖的入口，9是GF4-5或高級(jí)果聚糖出口。使用兩個(gè)反應(yīng)器，裝備葡萄糖可透過(guò)而蔗糖、果糖基轉(zhuǎn)移酶或GF2和高級(jí)果聚糖不可透過(guò)的外部分離器5和10。在第一反應(yīng)器部分1a中，蔗糖濃度要達(dá)到供給GF2合成的程度，然后，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)GF2-3或高級(jí)果聚糖入口7轉(zhuǎn)移至第二單獨(dú)的反應(yīng)器部分6a中。在第二反應(yīng)器6中，在單獨(dú)的反應(yīng)器部分6a中含有果糖基轉(zhuǎn)移酶，GF2-3或高級(jí)果聚糖與蔗糖反應(yīng)，其中蔗糖濃度比第一反應(yīng)器中的濃度低。通過(guò)經(jīng)入口11加入蔗糖使蔗糖濃度保持在希望的水平上。低的蔗糖濃度有利于高級(jí)果聚糖的合成，因此，葡萄糖有效合成。使葡萄糖通過(guò)分離器10，并經(jīng)過(guò)葡萄糖出口8排除。高級(jí)果聚糖可經(jīng)過(guò)果聚糖出口9排除。果聚糖出口9，可以裝備使果聚糖通過(guò)而不使蔗糖、葡萄糖或果糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的分離器(未示出)。在必要時(shí)分離器5和10用返回物料例如蔗糖和果聚糖而不是葡萄糖的循環(huán)管線描繪。
本發(fā)明的方法優(yōu)選在適合于制備工業(yè)量的GF4-5的反應(yīng)器中進(jìn)行。反應(yīng)器優(yōu)選包括一個(gè)或多個(gè)加入蔗糖和/或果糖基轉(zhuǎn)移酶的入口和從反應(yīng)器中分離工業(yè)量的GF4-5的設(shè)備。反應(yīng)器可以包括如圖2和2a中說(shuō)明的起反應(yīng)器系統(tǒng)作用的多個(gè)容器。
現(xiàn)在描述由蔗糖制備果糖的方法細(xì)節(jié)。
蔗糖和葡糖基轉(zhuǎn)移酶在反應(yīng)器中反應(yīng)。所述反應(yīng)器可以包括蔗糖入口和果糖出口。隨著聚合度的提高，果糖濃度也提高，致使生成的果糖反應(yīng)速度可能降低。因此，在優(yōu)選實(shí)施方案中，在反應(yīng)中，從反應(yīng)介質(zhì)中分離果糖。果糖可以用本技術(shù)領(lǐng)域中普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法例如膜過(guò)濾或色譜例如離子交換和凝膠排阻技術(shù)分離。泵可以包括在系統(tǒng)中以增加流體對(duì)分離器的壓力。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，果糖出口有使果糖從反應(yīng)介質(zhì)中流出而不使蔗糖、葡聚糖或葡糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的膜。
果糖可以連續(xù)地、間歇地或半間歇地分離。但是，在優(yōu)選方案中，果糖從反應(yīng)介質(zhì)中連續(xù)地分離。
果糖可以用本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法例如過(guò)濾、色譜和結(jié)晶分離和提純。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，葡聚糖也可以從反應(yīng)混合物中分離。在更優(yōu)選的實(shí)施方案中。葡聚糖從反應(yīng)混合物中連續(xù)地分離。葡聚糖可以用本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的通用方法例如膜過(guò)濾或色譜例如離子交換或凝膠排阻色譜分離。在優(yōu)選實(shí)施方案中，葡聚糖出口有使葡聚糖從反應(yīng)介質(zhì)中流出而不使蔗糖、果糖或葡糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的膜。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的葡聚糖量，以蔗糖起始重量為基準(zhǔn)，是≥10wt.％，優(yōu)選≥20wt.％，更優(yōu)選≥30wt.％，更優(yōu)選≥40wt.％，和最優(yōu)選≥50wt.％。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，產(chǎn)生的果糖收率，以反應(yīng)的蔗糖重量為基準(zhǔn)，是25～50wt.％，優(yōu)選≥25wt.％，優(yōu)選≥33wt.％，更優(yōu)選≥37wt.％，更優(yōu)選≥40wt.％，和最優(yōu)選約≥50wt.％。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)，工業(yè)量定義為果糖的生產(chǎn)速度為103-105kg/天，優(yōu)選≥1,000kg/天，優(yōu)選≥2,000kg/天，更優(yōu)選≥5,000kg/天。此外，工業(yè)量的生產(chǎn)速度以蔗糖原料量為基準(zhǔn)。為此，上面定義的生產(chǎn)速度以加工6,000kg蔗糖的設(shè)備為基礎(chǔ)。因此，術(shù)語(yǔ)“工業(yè)量”不是絕對(duì)量，而寧可說(shuō)是工業(yè)上可接受的生產(chǎn)速度。
現(xiàn)在參考圖3，其中12是反應(yīng)器，13是蔗糖入口，14是果糖出口，15是葡聚糖出口，16是果糖可透過(guò)而蔗糖、葡糖基轉(zhuǎn)移酶或葡聚糖不可透過(guò)的分離器。蔗糖經(jīng)過(guò)入口13加入含有葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)器12部分。在該結(jié)構(gòu)中，建立分隔區(qū)以致在分離器的一側(cè)果聚糖被濃縮。反應(yīng)器裝備位于分離器16果糖側(cè)的果糖出口14。葡聚糖出口15可以裝備使葡聚糖通過(guò)而不使蔗糖、果糖或葡糖基轉(zhuǎn)移酶通過(guò)的分離器(未示出)。
現(xiàn)在參考圖4，其中12是第一反應(yīng)器，13和22是蔗糖入口，14和19是果糖出口，15是DP3-4或高級(jí)葡聚糖出口，16和21是果糖可透過(guò)而蔗糖、葡糖基轉(zhuǎn)移酶或葡聚糖不可透過(guò)的分離器，17是第二反應(yīng)器，18是DP3-4或高級(jí)葡聚糖入口，20是DP5-6或高級(jí)葡聚糖出口。使用兩個(gè)反應(yīng)器，分別用果糖可透過(guò)而蔗糖、葡糖基轉(zhuǎn)移酶或DP3和高級(jí)葡聚糖不可透過(guò)的分離器16和21分隔。在第一反應(yīng)器12中，蔗糖濃度達(dá)到供給合成DP3的程度，然后，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)DP3-4葡聚糖入口18轉(zhuǎn)移到第二反應(yīng)器17中。在第二反應(yīng)器17的一部分中含有葡糖基轉(zhuǎn)移酶，DP3-4或高級(jí)葡聚糖與蔗糖反應(yīng)，其中蔗糖濃度比第一反應(yīng)器12中的濃度低。通過(guò)由入口22加入蔗糖保持蔗糖濃度在希望的水平上。低的蔗糖濃度有利于高級(jí)葡聚糖的合成，因此，有利于有效合成果糖。使果糖通過(guò)分離器21并由果糖出口19排除。高級(jí)葡聚糖可以由葡聚糖出口20排除。
通過(guò)常規(guī)的化學(xué)改進(jìn)或附加的酶催化改進(jìn)進(jìn)行酶催化生產(chǎn)的果聚糖或葡聚糖的附加改進(jìn)也在本發(fā)明的范圍內(nèi)?；瘜W(xué)改進(jìn)非限定的例子可以包括烷基化、酯化、脫水、環(huán)化和部分水解。酶催化改進(jìn)的非限定的例子可以包括糖基化。
本發(fā)明還提供通過(guò)果糖基轉(zhuǎn)移酶和葡糖基轉(zhuǎn)移酶兩者的作用由蔗糖生產(chǎn)葡萄糖和果糖的聯(lián)合方法。在該方法中蔗糖原料流加入含有果糖基轉(zhuǎn)移酶和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的分開(kāi)的反應(yīng)器中。各個(gè)反應(yīng)器分別生產(chǎn)葡萄糖和果糖。該方法的流程圖見(jiàn)圖5。含有果糖基轉(zhuǎn)移酶和葡糖基轉(zhuǎn)移酶的反應(yīng)器如同上面描述的或在圖1，1a，2，2a，3和4中說(shuō)明的。
本發(fā)明的方法和設(shè)備還在由蔗糖生產(chǎn)葡萄糖和果聚糖和/或果糖和葡聚糖中提供極大的靈活性，同一性和根據(jù)使用的具體酶和選擇的反應(yīng)條件可自由調(diào)節(jié)單糖與多糖的相對(duì)量。例如，葡萄糖與果聚糖的相對(duì)比例可以用改變蔗糖濃度，反應(yīng)時(shí)間或酶單位數(shù)目調(diào)節(jié)。提高蔗糖濃度有利于生產(chǎn)低分子量的果聚糖，降低蔗糖濃度，增加反應(yīng)時(shí)間和增加酶單位數(shù)目有利于生產(chǎn)高分子量的果聚糖和葡萄糖。具體的多糖也可以簡(jiǎn)單地通過(guò)改變使用的酶加以改變以滿足需要。因此，本方法可以快速適應(yīng)以滿足具體的單糖和多糖變化的需要，而不必明顯的改變?cè)O(shè)備。
葡聚糖可以通過(guò)給藥于口腔用于治療齲齒。水溶性的葡聚糖優(yōu)選具有包含β-1，3鍵合的葡萄糖殘基，β-1，6鍵合的葡萄糖殘基，或β-1，3-鍵合的和β-1，6鍵合混合的葡萄糖殘基的直鏈或支鏈結(jié)構(gòu)。葡聚糖的分子量?jī)?yōu)選1,000-1,000,000道爾頓。
抗齲齒的葡聚糖用本技術(shù)領(lǐng)域普通的技術(shù)熟練人員已知的送往口腔藥劑的通用方法給藥。例如含有葡聚糖的組合物可以以漱口液、牙膏或牙粉、食品、飲料、口香糖、糖果、糖錠、片劑或溶液形式給藥。
合適的葡聚糖量要足以保持口腔濃度1-1,000mg/ml，優(yōu)選10-500mg/ml。
含有α-1，4鍵的葡聚糖可以用于合成醫(yī)藥用的超高純纖維素。所述的α-1，4-鍵合的葡聚糖優(yōu)選的分子量2,000-10,000道爾頓。
GF4-5果聚糖可以作為填充劑用于食品和食品增甜劑。
含有包括分支鍵的多種鍵，和含有5-10個(gè)葡萄糖單元的葡聚糖可以用作聚糊精的代用品。所述葡聚糖不含有封端的山梨糖醇單元。
已經(jīng)一般地說(shuō)明了本發(fā)明，通過(guò)參考在這里僅為了說(shuō)明提供的一些具體的實(shí)施例可以進(jìn)一步了解本發(fā)明，除非另有說(shuō)明這些實(shí)施例不用來(lái)限制本發(fā)明。
克隆和表達(dá)方法缺少預(yù)定信號(hào)序列，變異鏈球菌果糖基轉(zhuǎn)移酶的編號(hào)序列可以從變異鏈球菌株ATCC25175中用PCR分離。設(shè)計(jì)和合成兩個(gè)引物。第一，5′-TCTGCGGGATCCCAGGCAGATGAAGCCAATTCAAC-3′，含有BamHI限制位點(diǎn)，接著是與直接在變異鏈球菌果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列中預(yù)定的信號(hào)序列末端后面的序列相同的序列。第二，5′-TCTGCGAAGCTTTTATTTAAAACCAATGCTTACACA-3′，含有Hind III限制位點(diǎn)，接著是與變異鏈球菌果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列的C-末端相應(yīng)的相反的互補(bǔ)的序列。兩個(gè)引物與從變異鏈球菌株ATCC25175中分離的基因組DNA結(jié)合，用于PCR中。得到的DNA片段用Bam HI和Hind III消化，連接在Bam HI-Hind III消化的質(zhì)粒pGEX-KT-ext上。該連接得到上述的變異鏈球菌果糖基轉(zhuǎn)移酶編碼序列，直接放在框架中谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)編碼序列的下游。pGEX-KT-ext-變異鏈球菌一果糖基轉(zhuǎn)移酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至大腸桿菌BL21細(xì)胞中。從得到的轉(zhuǎn)化子的蛋白質(zhì)表達(dá)得到GST-ext變異鏈球菌一果糖基轉(zhuǎn)移酶融合蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)聚積。
顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)可以對(duì)本發(fā)明做出許多改進(jìn)和變化。當(dāng)然，這些改進(jìn)和變化在所附的權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)，除了在這里具體說(shuō)明外本發(fā)明可以實(shí)施。
權(quán)利要求
1.由蔗糖制備葡萄糖的方法，包括i)蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶接觸產(chǎn)生葡萄糖；和ii)從其中分離葡萄糖。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述果糖基轉(zhuǎn)移酶由選自下列的生物得到出芽短柄霉(Aureobasidium pullulans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、薩氏曲霉(Aspergillus sydowi)、Aureobasidium sp.、黑色曲霉(Aspergillus niger)、婁格法爾特氏青霉(Penicillium roquefortii)、變異鏈球菌(Streptococcus mutans)、詹司克氏青霉(Penicillium jancezewskii)和高等植物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述果糖基轉(zhuǎn)移酶用非天然的果糖基轉(zhuǎn)移酶基因的表達(dá)得到。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖連續(xù)地或半間歇地分離。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述反應(yīng)產(chǎn)物還包括果聚糖和所述方法還包括分離所述果聚糖。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述果聚糖連續(xù)地分離。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述葡萄糖用膜過(guò)濾或色譜分離。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述果聚糖用膜過(guò)濾或色譜分離。
9.制備工業(yè)量的葡萄糖和果聚糖的方法，包括i)蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶接觸產(chǎn)生含有葡萄糖和果聚糖的反應(yīng)產(chǎn)物；和ii)分離葡萄糖和所述果聚糖。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述果聚糖是DP5-6。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述葡萄糖連續(xù)地分離。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述葡萄糖用膜過(guò)濾或色譜連續(xù)地分離。
13.由蔗糖制備果糖的方法，包括i)蔗糖與葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸產(chǎn)生果糖；和ii)從其中分離果糖。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述葡糖基轉(zhuǎn)移酶由選自變異鏈球菌和高等植物的生物得到。
15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述果糖連續(xù)地分離。
16.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述反應(yīng)產(chǎn)物還包括葡聚糖和所述方法還包括分離所述葡聚糖。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述葡聚糖連續(xù)地分離。
18.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述果糖用膜過(guò)濾或色譜分離。
19.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述葡聚糖用膜過(guò)濾或色譜分離。
20.制備工業(yè)量的果糖和葡聚糖的方法，包括i)蔗糖與葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸產(chǎn)生包括果糖和葡聚糖的反應(yīng)產(chǎn)物；和ii)分離果糖和所述葡聚糖。
21.由蔗糖制備葡萄糖和果糖的方法，包括i)蔗糖與果糖基轉(zhuǎn)移酶接觸產(chǎn)生葡萄糖；ii)蔗糖與葡糖基轉(zhuǎn)移酶接觸產(chǎn)生果糖；iii)分離葡萄糖和果糖。
22.制備工業(yè)量葡萄糖的反應(yīng)器，包括(a)反應(yīng)器容器；(b)蔗糖入口；(c)葡萄糖出口；和(d)果糖基轉(zhuǎn)移酶。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的反應(yīng)器，還包括果聚糖出口。
24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的反應(yīng)器，其中所述蔗糖入口是連續(xù)的入口。
25.根據(jù)權(quán)利要求22所述的反應(yīng)器，其中所述果聚糖出口是連續(xù)的出口。
26.根據(jù)權(quán)利要求22所述的反應(yīng)器，其中所述葡萄糖出口是連續(xù)的出口。
27.制備工業(yè)量果糖的反應(yīng)器，包括(a)反應(yīng)器容器；(b)蔗糖入口；(c)果糖出口；和(d)葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
28.由蔗糖制備葡萄糖和果糖的反應(yīng)器，包括(a)反應(yīng)器容器，包括i)蔗糖入口；ii)葡萄糖出口，和iii)果糖基轉(zhuǎn)移酶，和(b)反應(yīng)器容器，包括i)蔗糖入口；ii)果糖出口；和iii)葡糖基轉(zhuǎn)移酶。
29.根據(jù)權(quán)利要求22所述的反應(yīng)器，還包括位于所述反應(yīng)器容器和所述葡萄糖出口之間的分離器。
30.根據(jù)權(quán)利要求23所述的反應(yīng)器，還包括位于所述反應(yīng)器容器和所述果聚糖出口之間的分離器。
全文摘要
本發(fā)明涉及由蔗糖制備工業(yè)量的葡萄糖和/或果糖的方法,由蔗糖制備工業(yè)量的葡萄糖和果聚糖的方法,實(shí)施所述方法的反應(yīng)器,由蔗糖制備工業(yè)量的果糖和葡聚糖的方法和實(shí)施所述方法反應(yīng)器。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1255947SQ99800106
公開(kāi)日2000年6月7日 申請(qǐng)日期1999年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月6日
發(fā)明者史帝文·J·凱特尼, 斯達(dá)芬·A·羅森, 愛(ài)德華·J·麥格瑞, 瓊安·L·納威爾 申請(qǐng)人:尼斯技術(shù)公司