專利名稱：識別惡性腫瘤中n－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖的單克隆抗體和含有該抗體的 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地涉及針對N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列的單克隆抗體(Mab)的制備和選擇，此單克隆抗體可用于診斷和治療某些腫瘤疾病。
現(xiàn)有技術(shù)寡糖結(jié)構(gòu)可見于糖蛋白和糖脂的組成部分，它們在正常和病變組織中都存在。
約100％惡性腫瘤中都有異常糖基化的描述。異常糖基化常見的變化是新抗原的表達(dá)，寡糖序列組成的變化，寡糖中唾液酸分子的增加或減少以及細(xì)胞表面分子密度的增加等(Hakomori S.H.等，Curr.Opin.inImmunol.1991，(3)646-653)。除了見于唾液酸轉(zhuǎn)移酶機(jī)制的變化以外，還有活化的唾液酸N-乙?；蕾囆粤u化酶的變化。
神經(jīng)節(jié)苷脂是其結(jié)構(gòu)中含有唾液酸的glycoesfingolipid，其特征在于存在于脊椎動物的大多數(shù)細(xì)胞中。這些分子見于正常組織中，在腫瘤中可有更高表達(dá)，具有不同的組成和形態(tài)(Hakomori，S.H.，1985，癌研究452405-2414；Miraldi，F(xiàn).，1989，Seminars in Nuclear Medicine，XIX，282-294)。
針對糖類抗原的體液免疫反應(yīng)一般是IgM同種型。與脂類結(jié)合的寡糖序列一般具有比糖蛋白更小的免疫原性。所以，使用糖脂作為免疫原需要其與轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)合或整合到脂質(zhì)體或細(xì)菌如結(jié)核桿菌或R595明尼蘇達(dá)沙門氏菌中。
針對神經(jīng)節(jié)苷脂的反應(yīng)是非胸腺依賴性的。這已由Livingston等反復(fù)報道(Livingston，P.O.等，1982，美國國家科學(xué)院院報842911-2915；Livingston，P.O.等，1989，癌研究497045-7050)。不同物種的血清研究中，針對神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體的主要特征是其低親和性、相當(dāng)多的交叉反應(yīng)和短壽命(Livingston，P.O.，1991，Immunology and Allergy Clinicsof North America，11401-423；Portoukalian，J.等，1991，Int.J.Cancer，49893-899)。
寡糖中N-乙醇?；问降谋磉_(dá)普遍存在于所有脊椎動物物種的正常和病變組織中，除了雞和人類只在胚胎和腫瘤組織中表達(dá)。這兩個物種的正常組織只有N-乙?；凅w(Nishimakit等，1979，免疫學(xué)雜志，1222314；Higashi H.等，1985，癌研究，453796)。
一些人類腫瘤中寡糖組成的研究表明N-乙醇?；问酱嬖谟诤谏亓瞿[瘤細(xì)胞的糖脂和糖蛋白中(Hirabayashi，Y等，1987，癌研究雜志，78，614-620；Saida T.等，1991 Arch.Dermatol.Res.282.(3)179-182；Kawashima I.等，1993，生物化學(xué)雜志(Tokio)(2)186-193；Kawachi S.等，1992，皮膚學(xué)雜志(11)827-830)，也出現(xiàn)在結(jié)腸腫瘤中，尤其在糖脂中(Miyoshi，I.等，1986，分子免疫學(xué)，23(6)631；Higashi H.等，1985，癌研究，453796-3802)。另外，已進(jìn)行研究以證明神經(jīng)節(jié)苷脂的N-乙醇酰化形式存在于肝腫瘤樣品、畸胎瘤、淋巴瘤等組織中(Kawai T.等，1991 Cancer Res.(51)1242-1246)。盡管前例中糖脂的N-乙醇酰化變體的濃度小于總唾液酸的0.05％，Marquina及其合作者在乳腺腫瘤中發(fā)現(xiàn)約10％與脂類的唾液酸(Marquina，G.等，1996，癌研究565165)。
至今已經(jīng)提供針對神經(jīng)節(jié)苷脂N-乙醇?；凅w的單克隆抗體同種型抗體的制備，這些單克隆抗體一般識別一種以上神經(jīng)節(jié)苷脂分子，例如人類單克隆抗體2-39M和32-27M(Furukawa K.，等，1998，J.BiologicalChemistry，26318507)和鼠抗體GMR8和GMR3(Ozawa H.等，1992，Biochem.Biophys.，2(294)427)。其他作者已報道了抗N-乙醇酰化神經(jīng)節(jié)苷脂抗體的特定種類，總是IgM同種型的產(chǎn)生，其中是針對NGcGM2的單克隆抗體Y-2-HD1(Samai Y.等，1988，Bioch.Biophys.Act.，958，368)和針對相同分子的MK2-34(Miyake，M.等，1990，癌研究48，6154)。
然而，Watarai(Watarai，S.等，1995，生物化學(xué)雜志.117，1062)制備了針對i-活化的(i-active)N-乙醇?；窠?jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體SHS-1，Nakumara得到了針對(NGc-NGc)GD1c的單克隆抗體YK-3(Nakumara等，1995，J.of Biolog.Chemist.，8(270)3876)。最近Vázquez等(Vázquez，A.M.等，1995，雜交瘤，14，6，551)報道了單克隆抗體P3的制備，此抗體識別大多數(shù)含有唾液酸的N-乙醇?；问降纳窠?jīng)節(jié)苷脂分子以及硫酸糖脂。
Nagai等已制備出針對神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體HMA1(Nagai Y.等，美國專利4,965,198)。它們從患有自身免疫疾病的小鼠得到針對神經(jīng)節(jié)苷脂NGcGM2的特異單克隆抗體。但是他們報道了另外識別其它稱為PyK、YH02、YH03、YH04、YH05、YH06和YH07的N-乙醇酰化神經(jīng)節(jié)苷脂的這些抗體中的幾個。
而且，Yamasaki，M.等在他們的美國專利4,942,131中報道了也在患有自身免疫疾病的小鼠中制備了針對4-O-乙?；?NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體YH08、YH09、YH10和YH11。
使用這些分子作為內(nèi)酯或從含有神經(jīng)節(jié)苷脂的細(xì)胞系已獲得針對神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體(美國專利5,308,614；5,240,833；5,389,.530和5,500,215)。
同樣方法，已經(jīng)獲得了針對GD3、GD2和GM2神經(jīng)節(jié)苷脂的人和鼠不同單克隆抗體，所有的都是N-乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂而且大多數(shù)單克隆抗體是IgM和IgG3亞類(Pukel，C.S.等，1982，實驗醫(yī)學(xué)雜志，1151133-1147；Hirabayashi，Y.等，1985，J.Biol.Chem.，26013328-13333；專利申請WO 86/00909；Miyake，M.等，1988，癌研究，486154-6160；Kawashima，I.等，1992，分子免疫學(xué)，29，625-632；Kotani，M.等，1992，Biochimicaet Biophysica Acta，111797-103)。
使用針對神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體的被動免疫治療已經(jīng)用于一些腫瘤如黑色素瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤的臨床實驗。黑色素瘤的治療是病變內(nèi)或全身的，盡管結(jié)果看起來令人鼓舞，但很少患者表現(xiàn)部分或全部緩解(Houghton，A.N.等，1985，美國國家科學(xué)院院報，821242；Dippold，W.G.等，1988，J Cancer Clin.Oncol.，24865；Vadhan-Raj，S.等，1988，J.Clin.Oncol.，61636；Saleh M.N.等，1992，癌研究，524332-4347)。
這些抗體在補(bǔ)體或細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性研究中顯示出效果(Ravindramath M.H.等，1991，Inter.Rev.Immunol.，7，303)。
至今所有針對神經(jīng)節(jié)苷脂得到的單克隆抗體都是IgM同種型，并且它們誘導(dǎo)的毒性是由補(bǔ)體介導(dǎo)的。
IgM一般具有較低的抗原親和性，而且很難用IgM作為放射性標(biāo)記的單克隆抗體來診斷和治療。雖然IgM很好地固定補(bǔ)體且保證良好的細(xì)胞毒性，但大規(guī)模純化比IgG同種型更復(fù)雜。
另外，有關(guān)針對乙醇?；堑鞍椎膯慰寺】贵w的報道很少，而且其中的大部分用于診斷目的。
Devine等描述了通過免疫組織化學(xué)研究的、識別在90％乳腺腫瘤中表達(dá)的N-乙醇酰粘蛋白(糖蛋白)的單克隆抗體3E1.2(Devine，P.L.等，1991，癌研究51(21)5826-36)。
已公開了一種命名為JAM3的單克隆抗體，它識別由于內(nèi)阿米屬侵襲產(chǎn)生的存在于孢囊表面的250KD蛋白的N-乙酰化和N-乙醇?；问?Avron，B.等，1987，Mol Biochem Parasitol.(3)257-266)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明新穎性在于已獲得對存在于神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白中的N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列高度特異的單克隆抗體。另外，IgG同種型免疫球蛋白的特點使其更特異，因此具有與所識別分子更高的親和性，有利于其生物活性。出乎意斷的是，這種抗體在帶有所述寡糖序列的細(xì)胞中表現(xiàn)直接誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的能力。發(fā)明詳述NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的獲得為獲得NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂，采用Hakomori技術(shù)的改進(jìn)(Hakomori，S.等，1974，酶學(xué)方法，32Part B，350)，使用諸如馬紅細(xì)胞的自然資源。NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂提取物的產(chǎn)量介于每升馬紅細(xì)胞180-300mg之間，根據(jù)Gazzotti方法通過高效液相色譜證明純度90％以上(Gazzotti，G.等，1985，J.of Chromatography，348371-378)。免疫原的獲得為獲得免疫原，根據(jù)Dumontet等的方法(Dumontet，C.等，1994.Cancer Immunol Immunother.38311-318)，使NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂與人類極低密度脂蛋白(VLDL)疏水性結(jié)合。免疫方案為獲得抗神經(jīng)節(jié)苷脂IgG的單克隆抗體，使用以下免疫方法。用疫苗制品免疫小鼠或其它哺乳動物，每劑量含0.03-0.05mg與VLDL結(jié)合的NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂和佐劑，佐劑選自以下之一白蛋白、完全或不完全弗氏佐劑或Montanide ISA51。
免疫前和免疫后，從動物抽取血樣以得到血清用于監(jiān)測針對神經(jīng)節(jié)苷脂作為抗原而在動物中產(chǎn)生的抗體。為此目的，可使用任何用于檢測抗原-抗體(Ag-Ab)反應(yīng)的已知免疫分析方法。
用2-8之間的各種劑量在7-14天不等的時間間隔免疫動物。通過皮下或肌肉途徑用0.1-0.2ml之間的用量進(jìn)行注射。其它可能的免疫途徑是靜脈內(nèi)和腹膜內(nèi)。接受此劑量范圍的動物表現(xiàn)針對作為免疫原的神經(jīng)節(jié)苷脂的特異反應(yīng)。70-100％的免疫動物具有對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的特異IgG反應(yīng)。單克隆抗體的獲得為制備針對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的特異單克隆抗體，在獲得產(chǎn)生抗體的細(xì)胞前三天，血清中有針對這種神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體效價的小鼠接受疫苗制品再次免疫。盡管其它細(xì)胞也可以使用，但優(yōu)選脾細(xì)胞。
這些細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，提供具有“體內(nèi)”和“體外”無限增殖能力的雜交細(xì)胞或雜交瘤。為此目的，可以使用任何已知的細(xì)胞融合方法。為測定雜交瘤產(chǎn)生的抗體，優(yōu)先使用免疫酶學(xué)分析法。也可以使用其它免疫分析方法。本分析法的步驟是通過雜交瘤上清液識別神經(jīng)節(jié)苷脂，用酶標(biāo)的二抗使抗原-抗體反應(yīng)可以觀察到，酶標(biāo)的二抗在充足條件下與由雜交瘤產(chǎn)生的抗體結(jié)合，同時得以檢測。
雜交瘤一經(jīng)選擇至少經(jīng)二次傳代(例如通過有限稀釋)。所得的單克隆抗體可在充足的培養(yǎng)基如本領(lǐng)域技術(shù)所述的任何培養(yǎng)基中體外產(chǎn)生，然后從所述的組織培養(yǎng)懸浮液純化。這樣，1-8％的分泌克隆是對N-乙醇酰GM3神經(jīng)節(jié)苷脂特異的。
另一抗體制備方法包括，將雜交瘤注射到動物內(nèi)(例如同源動物)。雜交瘤激發(fā)非實體腫瘤的形成，在宿主動物血流和腹膜滲出液中提供高濃度的所需抗體。單克隆抗體的純化通過將0.2×106個產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞接種在前先用不完全弗氏佐劑作為促腹水生成劑處理的Balb/C小鼠腹膜中而得到腹水，然后從腹水純化單克隆抗體。
將腹水在1.5M甘氨酸緩沖液、3M NaCl，PH8.9中稀釋成0.5X。然后以60mL/小時(h)的速度上樣到蛋白A-Sepharose基質(zhì)上。單克隆抗體用0.14M檸檬酸緩沖液pH6洗脫。
純化的單克隆抗體濃度用Lowry方法(Lowry，G.H.，1951，J.Biol.Chem.，193256)和鼠IgG1在280nm處的吸收系數(shù)測定。特異性用ELISA驗證。
每毫升腹水得到2-5mg抗體，純度百分率95％以上。這已通過低壓液相色譜驗證。特異性研究為測定所得單克隆抗體的特異性，使用N-乙酰化神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1，GM2，GM3，GM1，GD1a，GD1b，GD3和GT1b)和N-乙醇酰化神經(jīng)節(jié)苷脂(GM3，GM2，GM1a，GM1b，GDc和GD3)，在酶聯(lián)免疫分析板和薄層層析上進(jìn)行所得單克隆抗體的免疫酶學(xué)研究。
為在高分辨薄層層析上研究糖脂，使用溶劑系統(tǒng)(氯仿∶甲醇∶0.25％氯化鉀和2.5M氨)(5∶4∶1)(v∶v)。用地衣酚化學(xué)顯色來顯示條帶。
平板是塑料的，并用多聚異丁基甲基丙烯酸酯溶液覆蓋，室溫下干燥過夜。用溶解在磷酸鹽緩沖液(PBS)PH7.4中的1％牛血清封閉約30分鐘。然后，單克隆抗體在封閉液中溫育。
接著用PBS洗平板并在一小時內(nèi)加入與過氧化物酶結(jié)合的抗鼠免疫球蛋白。再次洗平板并加入酶底物溶液直至可見到條帶。最后，比較化學(xué)和免疫結(jié)果。結(jié)果，IgG只識別NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂。細(xì)胞毒性測定為測定所產(chǎn)生的抗體是直接或者通過其它細(xì)胞毒性形式導(dǎo)致細(xì)胞死亡，使每毫升107個含NGcGM3的P3X63鼠骨髓瘤細(xì)胞分別在4℃和37℃與0.01-1mg/mL的單克隆抗體一起溫育30分鐘。然后，用溴酚藍(lán)方法進(jìn)行細(xì)胞存活研究。因抗體作用而死亡的細(xì)胞數(shù)可使用安妥碘或其它存活標(biāo)志來計數(shù)。
為研究補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，使用每毫升107個細(xì)胞；以0.01-0.5mg/ml濃度加入單克隆抗體。以1/20到1/2稀釋度加入含高濃度補(bǔ)體蛋白的兔血清并于37℃溫育一小時。補(bǔ)體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性通過上述的存活計數(shù)測定或使用Cr51釋放方法，其中放射標(biāo)記的P3X63黑色素瘤細(xì)胞死亡時將同位素釋放到培養(yǎng)懸浮液中。
使用不同方法測定直接細(xì)胞毒性，表明相對于所研究的細(xì)胞總數(shù)死亡細(xì)胞值在50％-85％之間。單克隆抗體生物分布測定用放射性同位素如99mTc、Re186和Re188標(biāo)記所制備的單克隆抗體可用于診斷和治療。Schwarz和Steinstrasser(Schwarz A.和Steinstrasser A.1987，J.Nucl Med.28721)已描述了用放射性同位素標(biāo)記單克隆抗體的方法，Mather和Ellison對其進(jìn)行了改進(jìn)(MatherS.J.和Ellison D.，1990，J.Nucl.Med.31692-697)。在Whatman 3MM紙上通過層析進(jìn)行標(biāo)記量控制，獲得的標(biāo)記百分率為98％和100％。
為測定單克隆抗體的可能用途，用P3X63腫瘤接種10只小鼠，另10只小鼠用作正常對照(無腫瘤接種)。經(jīng)過腫瘤生長所需的時間后，將99mTc標(biāo)記的14F7單克隆抗體通過靜脈途徑注射給20只小鼠。
以5只動物為一組(5只健康和5只患腫瘤)，在注射后4和24小時進(jìn)行抗寡糖序列單克隆抗體生物分布的監(jiān)測。宰殺動物并分別對主要器官和腫瘤稱重，并在研究結(jié)束時分別對gamma射線釋放進(jìn)行定量。
單克隆抗體主要分布于健康動物的血液、肝臟和腎臟中，而患腫瘤的小鼠中，單克隆抗體定位于上述器官中，24小時時優(yōu)先在腫瘤中。單克隆抗體對正常和胚胎組織的識別根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)所述，放射標(biāo)記的單克隆抗體可用于檢測表達(dá)寡糖序列的腫瘤。
全身放射活性可用Gamma照相機(jī)進(jìn)行研究。單克隆抗體注射后5分鐘、1、3、5、24和48小時進(jìn)行圖象攝影。單克隆抗體只定位于腫瘤和外分泌器官中。
單克隆抗體也可直接或間接與其它治療制劑如藥物、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)物、凝集素和毒素結(jié)合。在生物反應(yīng)調(diào)節(jié)劑(免疫調(diào)節(jié)劑)中，那些以某種方式可以增強(qiáng)本發(fā)明的單克隆抗體對腫瘤的催毀的免疫調(diào)節(jié)劑包括淋巴因子如腫瘤壞死因子、巨噬細(xì)胞活化因子、集落刺激因子、干擾素等。
進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究以用于診斷目的。組織標(biāo)本在10％緩沖的福爾馬林液中固定、脫水、透明并包埋在石蠟中。對蘇木素-伊紅染色的組織切片進(jìn)行組織病理學(xué)研究。
用前述的抗生素蛋白鏈霉素過氧化物酶復(fù)合物方法(Hsu，S.M.和Raine，L.，1981，.J.Histochem Cytochem.291349-1353)對用于組織病理學(xué)研究的石蠟包埋塊的連續(xù)切片進(jìn)行免疫染色。
經(jīng)過脫蠟和脫水的切片用3％過氧化氫甲醇溶液處理30分鐘以消除內(nèi)源過氧化物酶活性。組織切片與純化的單克隆抗體一起溫育。接著在室溫下與生物素標(biāo)記的抗鼠抗體和抗生素蛋白鏈霉素過氧化物酶復(fù)合物(Dakopatts)一起溫育。
溫育期間，用Tris-Hcl鹽緩沖液沖洗切片，過氧化物酶反應(yīng)用30％過氧化氫和3-3二氨基聯(lián)苯胺顯色。
用自來水沖洗切片，Mayer蘇木素染色后用加拿大樹脂和蓋玻片封片。酶反應(yīng)產(chǎn)生棕紅色。
對人類乳腺、肺、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤組織以及胚胎和正常成人組織進(jìn)行研究。
新鮮的病變活體組織在手術(shù)后一小時內(nèi)得到。將活體組織冷凍，然后切片，切片冷凍保存直至進(jìn)行研究。
使用胚胎組織進(jìn)行研究是因為已經(jīng)反復(fù)報道了人類胚胎和腫瘤組織中神經(jīng)節(jié)苷脂與癌胚抗原的聯(lián)系以及這兩些分子的相似性(Cahan，L.等，1982美國國家科學(xué)院院報，797629-7633)。
胚胎組織從12-18周的胚胎獲得。
正常成人組織從意外死亡和/或腦性死亡個體，在死后一小時內(nèi)取得。
在所研究的腫瘤中，具有不同發(fā)病機(jī)制的肺和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤及人正常組織的切片結(jié)果陰性。而黑色素瘤和乳腺腫瘤組織及消化系統(tǒng)(肝、胃、小腸、大腸)和泌尿系統(tǒng)的胚胎組織標(biāo)本都是陽性。抗腫瘤效應(yīng)為證明針對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的單克隆抗體的抗腫瘤效應(yīng)，用所得的單克隆抗體治療用帶有目的神經(jīng)節(jié)苷脂的腫瘤(P3X63骨髓瘤)接種的動物。接種劑量在每公斤體重0.01mg到200mg之間不等，一天或不同天內(nèi)每天注射一次或多次?？贵w可以通過非腸道注射(靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下、腔內(nèi)或皮內(nèi)注射)給藥。
通過Log Ram測試驗證，在典型實驗中，與對照組小鼠相比，經(jīng)抗體治療的小鼠有30％-80％的生存率。(Cox and Oakes(1984)Ahalysis ofsurvival Data edits.Chapman Hall)。單克隆抗體治療組和對照組之間發(fā)現(xiàn)顯著差異(＜0.05％)。
實施例實施例1用免疫制劑NGcGM3/VLDL/弗氏佐劑復(fù)合物免疫的小鼠對NGcGM3的特異IgG反應(yīng)通過免疫酶學(xué)技術(shù)測定。
6-8周的雌性Balb/c小鼠第一次肌肉注射用0.2mg免疫制劑人NGcGM3/VLDL和完全弗氏佐劑(由SIGMA生產(chǎn))的等量混合物，以后的肌肉注射用的是0.2mg人NGcGM3/VLDL和不完全弗氏佐劑(由SIGMA生產(chǎn))的等量混合物。每個動物接受六次注射。前四次每周一次，后兩次每兩周一次。采血在第一次注射之前進(jìn)行，以后每兩周進(jìn)行一次。
使用間接ELISA方法在POLYSORP板(Nunc商標(biāo))上測定動物血清的抗體水平，神經(jīng)節(jié)苷脂按以下方法滅活神經(jīng)節(jié)苷脂NAcGM3和NGcGM3分別溶于甲醇(4μg/ml)，每個孔內(nèi)加入50μl。酶標(biāo)板在37℃放置一個半小時以使甲醇蒸發(fā)。然后，加入100ml/孔含有2％牛血清白蛋白(BSA)的0.05M TRIS-HCL，PH7.8緩沖液并于室溫下溫育一小時。接著，用同樣的緩沖液稀釋50μl血清并在室溫下溫育過夜。
酶標(biāo)板孔用200μl磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗4次，加入50ul具有足夠效價的生物素標(biāo)記的抗鼠免疫球蛋白抗體，37℃溫育一小時。
用PBS沖洗后，加入50μl足夠稀釋的堿性磷酸酶抗生素蛋白鏈霉素。最后進(jìn)行一次沖洗后，將100μl硝基苯磷酸鹽底物溶解在二乙醇胺緩沖液pH9.8(1mg/ml)中。用ELISA檢測儀測定405nm吸光度。


圖1表示實驗56天時1/80稀釋的每一動物血清450nm處O.D.結(jié)果。針對NGcGM3和GM3的反應(yīng)通過ELISA使用生物素標(biāo)記的鼠抗IgG偶聯(lián)物和來自JACKSON的堿性磷酸酶抗生物素蛋白鏈霉素來測定。
接受疫苗制劑免疫的動物中70％以上有大于0.5的405nm處的O.D.，所有免疫動物都表現(xiàn)針對NGcGM3的IgG反應(yīng)，而未觀察到針對NAcGM3的反應(yīng)，盡管這兩個分子差別很小。
圖2表示接受最后一次免疫接種三個月后，針對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的持續(xù)特異抗體反應(yīng)(IgG型)，而未表現(xiàn)針對NAcGM3的反應(yīng)。實施例2針對NGcGM3的單克隆抗體的獲得抗體用實施例1所述的步驟通過免疫Balb/C小鼠制備。
融合前三天，用NGcGM3/VLDL再次免疫動物，使用的是完全弗氏佐劑。隨后，取得小鼠脾臟并將脾組織通過不銹鋼篩或利用脾灌注來獲得脾細(xì)胞懸浮液。按Kǒhler和Milstein所述的方法(自然，1975，No.256，495-497)并稍加改進(jìn)進(jìn)行細(xì)胞融合。
不分泌P3/X63 Ag86.5.3的細(xì)胞鼠骨髓瘤細(xì)胞與鼠脾細(xì)胞以1∶10比例融合，融合液的體積為0.5mL，其中在RPMI 1640培養(yǎng)基中含42％聚乙二醇(3000-3600 SIGMA)。
細(xì)胞融合后，在HAT選擇培養(yǎng)液里(次黃嘌呤/氨基蝶呤/胸腺嘧啶)，37℃，5％二氧化碳的濕熱環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。
細(xì)胞融合后10-15天，用實施例1所述的ELISA技術(shù)開始檢測雜交瘤細(xì)胞系上清液中抗體的出現(xiàn)。
選出與目的神經(jīng)節(jié)苷脂發(fā)生反應(yīng)的抗體，并在輔佐細(xì)胞存在時通過限制稀釋方法傳代兩次。
所選雜交瘤所產(chǎn)生的抗體的特異性使用間接ELISA技術(shù)用一組糖脂來測定。
針對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的特異克隆數(shù)為5.5％。所得克隆之一命名為14F7。實施例314F7單克隆抗體亞類的測定為了測定本發(fā)明單克隆抗體的免疫球蛋白亞類，使用實施例1所述的間接ELISA方法，其中酶標(biāo)板用NGcGM3覆蓋，但是將雜交瘤上清液或純化的單克隆抗體替換為血清。
生物素偶聯(lián)的大鼠中產(chǎn)生的抗IgG1，IgG2a，IgG2b和IgG3單克隆抗體在溫育緩沖液中稀釋后加入酶標(biāo)板，37℃溫育一小時后，沖洗酶標(biāo)板，加入在溫育緩沖液中稀釋的、由堿性磷酸酶偶聯(lián)的抗生素蛋白鏈霉素。作為對照，使用了以前已鑒定的各個亞類的鼠單克隆抗體。
最后，加入底物溶液。如前所述進(jìn)行吸光度的測定。圖3表示14F7單克隆抗體屬于IgG1亞類。實施例4使用免疫染色法，在高分辨率薄層層析上進(jìn)行14F7單克隆抗體的特異性研究高分辨率薄層層析用于分離糖脂。使用的溶劑系統(tǒng)是氯仿∶甲醇∶0.25％氯化鉀和2.5M氨(5∶4∶1)v∶v。用地衣酚化學(xué)顯色來顯示條帶(Svennerholm L.1964，J.Lipid.Res.，5，145)。對于免疫染色，使用方法Kawashima Y.和col.1993(生物化學(xué)雜志，114，186)。
以前進(jìn)行 薄層層析的平板是塑料的，通過在正己烷中的0.1％多聚異丁基甲基丙烯酸酯(PIBM)溶液中浸泡75秒進(jìn)行覆蓋。層析板在室溫下干燥30分鐘。將1％PIBM溶液置于層析板的邊緣并于室溫過夜。
使用溶于PBS pH7.2-7.4的1％牛血清白蛋白封閉非特異性反應(yīng)。緊接其后，在封閉溶液中與0.01-0.02mg/ml濃度的14F7單克隆抗體一起溫育。
用PBS沖洗板并與在封閉緩沖液中稀釋的辣根過氧化物酶偶聯(lián)的兔抗鼠免疫球蛋白抗體一起溫育。
室溫下攪拌溫育一個小時后，再沖洗，加入在含有0.12％過氧化氫(H2O2)(Riedel de Haen)的檸檬酸-磷酸緩沖液80mM pH5中的0.4mg/ml鄰苯二胺(C6H8N2)(Sigma)底物溶液。
反應(yīng)表明只對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂有特異性，對于其它N-乙醇?；蚇-乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂則未觀察到特異性，被認(rèn)為是N-乙醇?；窠?jīng)節(jié)苷脂的是GM1a，GM1b，GM2。實施例514F7單克隆抗體對腫瘤和胚胎組織的識別組織切片用10％緩沖的福爾馬林固定，脫水、透明、包埋在石蠟中。切片經(jīng)HE染色進(jìn)行組織病理學(xué)研究。
用前述的生物素-抗生素蛋白鏈霉素-過氧化物酶復(fù)合物方法，對用于組織病理學(xué)研究的石蠟包埋塊連續(xù)切片進(jìn)行免疫染色(Hsu，S.M.和Raine，L.，1981，.J.Histochem Cytochem.291349-1353)。
脫蠟和脫水的切片用3％過氧化氫甲醇溶液處理30分鐘以消除內(nèi)源過氧化物酶活性。室溫下使組織切片與純化的14F7單克隆抗體一起溫育一小時。接著在室溫與生物素標(biāo)記的抗鼠抗體和抗生素蛋白鏈霉素-過氧化物酶復(fù)合物(Dakopatts)一起溫育。
溫育期間，用Tris-Hcl鹽緩沖液沖洗切片。過氧化物酶反應(yīng)在5mlTris緩沖液中用0.005ml 30％過氧化氫和3mg 3-3二氨基聯(lián)苯胺顯色。
用自來水沖洗切片，Mayer蘇木素染色，加拿大樹膠和蓋玻片封片。酶反應(yīng)產(chǎn)生棕紅色。
正常成人的組織塊從意外死亡和/或腦性死亡個體，在死后一小時內(nèi)取得。新鮮的病變活體組織在手術(shù)后一小時內(nèi)得到。胚胎組織是從12-18周的胚胎在人工流產(chǎn)后一小時內(nèi)獲得。所有的活體組織塊用鹽溶液沖洗，立即置于液氮中冷凍，后在-80℃中凍存。
冷凍組織塊在25℃下，用恒冷切片機(jī)切出5微米連續(xù)切片。切片在空氣中干燥后立即使用或裹在鋁箔中于-20℃凍存。切片在4％戊二醛中固定20分鐘。
圖6表示正常成人組織中14F7單克隆抗體的免疫組織化學(xué)研究。單克隆抗體反應(yīng)見于細(xì)胞膜而在細(xì)胞質(zhì)區(qū)域未觀察到。
圖7表示病變組織的相同研究。所有研究的乳腺(33/33)和黑色素瘤(20/20)組織結(jié)果都是陽性。而不同發(fā)病機(jī)制的70例肺腫瘤和33例中樞神經(jīng)系統(tǒng)的不同腫瘤結(jié)果是陰性。
圖8表示14F7單克隆抗體識別消化系統(tǒng)和腎臟胚胎組織。實施例6用流式細(xì)胞儀研究細(xì)胞系中14F7單克隆抗體對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的識別所研究的細(xì)胞系是J.Muthing等描述的表達(dá)GM3和NGcGM3的鼠P3X63骨髓瘤(Muthing J.等，1994，生物化學(xué)雜志11664-73)和表達(dá)GM3的骨髓瘤B16。用含有8％胎牛血清的RPMI培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞。用含有0.02％疊氮化鈉和1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液pH7.4將細(xì)胞調(diào)節(jié)至10個細(xì)胞/毫升濃度。在每個試管內(nèi)加入0.1mL細(xì)胞懸浮液，接著加入0.05ml 14F7單克隆抗體到磷酸鹽緩沖液中至最終濃度0.1mg/ml，于4℃溫育30分鐘。然后用稀釋這些細(xì)胞的溶液來沖洗細(xì)胞。
接著以低速離心沉淀這些培養(yǎng)細(xì)胞。然后加入抗鼠(IgG+IgM)生物素標(biāo)記物(Jackson)，于4℃溫育30分鐘后沖洗。最后加入0.002mg熒光抗生素蛋白鏈霉素(FITC)(Jackson)并按如前述的相同條件溫育。用磷酸緩沖液進(jìn)行最后沖洗。
最后一次離心后去除上清液，將細(xì)胞重新懸浮于0.6ml最后沖洗溶液中。
80％的P3X63黑色素瘤細(xì)胞為14F7單克隆抗體染色陽性(圖9)。實施例714F7單克隆抗體直接細(xì)胞毒性的研究。
P3X63鼠骨髓瘤細(xì)胞系按實施例6所述與14F7單克隆抗體一起溫育。沖洗后，將0.01ml溶于磷酸鹽緩沖液的安妥碘加入細(xì)胞中，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的存活率。
結(jié)果表明78％的細(xì)胞死亡(圖10)。實施例8健康和患有P3X63骨髓瘤的Balb/C小鼠中99mTc標(biāo)記的14F7單克隆抗體的生物分布研究。
20只20-22g重量的雌性Balb/C小鼠接受99mTc標(biāo)記的14F7單克隆抗體靜脈注射(10例健康小鼠和10例患P3X63骨髓瘤小鼠通過腹膜內(nèi)途徑接種)。標(biāo)記濃度關(guān)系為0.03mg 14F7單克隆抗體/60uCi 99mTc注射后4-24小時，對每組五只動物進(jìn)行不同器官內(nèi)放射活性測定。動物處死后按Sartorius計量法稱重各個器官。開始實驗后約25小時可用WALLAC gamma計數(shù)器(model WIZARD 1470)一次性測定所有試管的放射性。
標(biāo)記方法已由Schwarz和Steistrasser(1987)描述，經(jīng)過1990年Muther和Ellison的修改。
標(biāo)記的14F7單克隆抗體經(jīng)健康小鼠的腎臟和肝臟排出(圖11)。
患有P3X63骨髓瘤的小鼠在4小時和24小時表現(xiàn)單克隆抗體結(jié)合(每克組織含12％的總注入放射性)(每克組織含35％的總注入放射性)。單克隆抗體主要經(jīng)腎臟排泄(圖12)。實施例914F7單克隆抗體在患有P3X63腹水性骨髓瘤的BALB/C小鼠中的抗腫瘤效應(yīng)。
20-22克重量的雌性Balb/c小鼠，每兩天靜脈注射6劑量溶于磷酸鹽緩沖液的14F7單克隆抗體(一組用0.1mg，第二組用0.2mg)。實驗前三天，用不完全弗氏佐劑刺激腹膜以利于腫瘤的檢測。實驗開始時用1000個鼠P3X63骨髓瘤細(xì)胞通過腹膜內(nèi)途徑接種，同時開始用14F7單克隆抗體的被動治療，盡管它是通過靜脈內(nèi)途徑接種的。用于比較的良好預(yù)期對照是第三組(最佳治療)，在所有實驗期間每周靜脈注射一次環(huán)磷酰胺，劑量為每公斤體重20毫克。用pH7.4磷酸鹽緩沖液靜脈注射作為空白對照。
圖13表示前述4組的生存結(jié)果。用14F7單克隆抗體(0.1和0.2mg)和20mg/kg的環(huán)磷酰胺治療的動物未見腫瘤。
生存結(jié)果表明14F7單克隆抗體治療組較好。盡管對照組沒有存活的動物，實驗第30天時第一組(0.1mg單克隆抗體)和環(huán)磷酰胺治療組仍然有6例存活，第二組(0.2mg單克隆抗體)有7例存活。治療的第60天，第一組的2例和環(huán)磷酰胺治療組的2例存活，而第二組仍然有5例存活。實施例10無胸腺小鼠中實體P3X63骨髓瘤的腫瘤生長抑制10只來自遠(yuǎn)系雜交NMRI、重量為20-22克的雌性無胸腺小鼠，于實驗開始時用106個P3X63骨髓瘤細(xì)胞系的細(xì)胞經(jīng)皮下免疫接種。將動物分為兩組，每組5例。
一組用純化的14F7單克隆抗體于腹膜內(nèi)注射開始實驗，2天一次，一次0.15mg(6次劑量)。而另一組用磷酸鹽緩沖液，以同樣的途徑、劑量和時間間隔進(jìn)行實驗作為對照。
圖14表示用14F7單克隆抗體的小鼠中腫瘤生長的抑制，相對于對照組，觀察到兩組間顯著差異。
附圖簡述圖1表示用NGcGM3/VLDL/完全弗氏佐劑免疫制劑免疫小鼠，在實驗56天時得到的針對NGcGM3而非針對GM3的血清抗體水平。
圖2通過ELISA測定，在小鼠接受4次0.2mg NGcGM3/VLDL/完全弗氏佐劑后3個月，小鼠血清中針對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的抗體反應(yīng)同種型。
圖3通過ELISA測定14F7單克隆抗體的亞類。
圖4使用薄層層析通過免疫染色識別在14F7單克隆抗體的特異性研究中使用的N-乙醇酰和N-乙?；窠?jīng)節(jié)苷脂。
圖5用14F7單克隆抗體在薄層層析上通過免疫染色識別NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂。
圖6在免疫組織化學(xué)研究中14F7單克隆抗體不識別正常成人組織。
圖7在免疫組織化學(xué)研究中14F7單克隆抗體識別一些人類惡性和良性腫瘤。
圖8在免疫組織化學(xué)研究中14F7單克隆抗體識別正常人胚胎組織。
圖9通過流式細(xì)胞儀，14F7單克隆抗體識別表達(dá)NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂的P3X63骨髓瘤細(xì)胞系。
圖10通過流式細(xì)胞儀的安妥碘技術(shù)，用P3X63骨髓瘤細(xì)胞系研究14F7單克隆抗體的非補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性效應(yīng)。
圖1199mTc標(biāo)記的14F7單克隆抗體的生物分布。相對于所研究的正常Balb/c小鼠，其每克器官重量中g(shù)amma放射性的百分率。
圖1299mTc標(biāo)記的14F7單克隆抗體的生物分布。相對于所研究的患有P3X63骨髓瘤的Balb/c小鼠，其每克器官重量中g(shù)amma放射性的百分率。
圖13各組Balb/c小鼠中14F7單克隆抗體被動治療的抗腫瘤效應(yīng)，這些小鼠經(jīng)P3X63鼠腹水骨髓瘤接種，用所述的抗體0.1和0.2mg治療，與使用20mg/kg環(huán)磷酰胺治療和PBS處理的對照組進(jìn)行比較。
圖14遠(yuǎn)系雜交無胸腺小鼠NMRI中鼠P3X63實體骨髓瘤的體內(nèi)腫瘤生長抑制。
權(quán)利要求
1.針對NGcGM3神經(jīng)節(jié)苷脂產(chǎn)生、特異識別神經(jīng)節(jié)苷脂和糖蛋白中N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列的單克隆抗體，是IgG1亞類并具有對帶有上述序列的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中所述對帶有N-乙醇酰-半乳糖-葡萄糖唾液酸寡糖序列的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解活性可以是直接或補(bǔ)體介導(dǎo)的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的單克隆抗體，命名為14F7，從相同名字的雜交瘤獲得，并于1998年10月19日以臨時注冊號98101901保藏于英國的歐洲動物細(xì)胞保藏中心ECACC。
4.產(chǎn)生權(quán)利要求3的單克隆抗體的雜交瘤，于1998年10月19日以臨時注冊號98101901保藏于英國的歐洲動物細(xì)胞保存中心ECACC。
5.一種藥物組合物，含有一定數(shù)量的權(quán)利要求1-3的單克隆抗體，另外含有稀釋劑或適當(dāng)賦形劑。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其中所述抗體可以與治療性試劑如藥物、放射性同位素、免疫調(diào)節(jié)劑、植物凝集素和毒素結(jié)合。
7.根據(jù)權(quán)利要求5和6所述的藥物組合物，用于治療惡性腫瘤。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的藥物組合物，用于治療乳腺、腎臟、消化系統(tǒng)腫瘤和人類黑色素瘤。
9.含有權(quán)利要求1到3的單克隆抗體的試劑，與標(biāo)記物如酶、生色基團(tuán)、Chimio-發(fā)光物和放射性核苷酸結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑，用于檢測腫瘤細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑，用于檢測人類黑色素瘤、乳腺、腎臟和消化系統(tǒng)如肝臟、結(jié)腸、胃和直腸的腫瘤細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及免疫學(xué)和人類醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,具體地涉及制備和選擇針對惡性腫瘤中N－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖序列的單克隆抗體/單克隆抗體。本發(fā)明的一個目的是提供一種IgGl亞類的單克隆抗體,其特征在于高度特異性地識別乳腺惡性腫瘤組織,黑色素瘤,肝臟、胃、結(jié)腸、直腸和腎臟腫瘤中存在的N－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖序列。它還具有對帶有N－乙醇酰－半乳糖－葡萄糖唾液酸寡糖序列的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞溶解作用,因此可用于診斷和治療某些腫瘤疾病。本發(fā)明的另一個目的是提供產(chǎn)生所提及的單克隆抗體的雜交瘤和含有單克隆抗體的藥物組合物,用于治療腫瘤疾病。
文檔編號C12P21/08GK1256696SQ99800261
公開日2000年6月14日 申請日期1999年2月5日 優(yōu)先權(quán)日1998年2月5日
發(fā)明者A·卡爾比雷茨, Z·馬所拉赫爾拉, L·E·菲納德茨默里那, A·M·瓦茨科斯洛比茨, A·穆雷特斯伊拉, R·比雷茨洛德里格茨 申請人:分子免疫中心