本發(fā)明涉及植物培養(yǎng)方法，具體為提高長(zhǎng)春花植物體中長(zhǎng)春堿含量的栽培方法。

背景技術(shù)：

長(zhǎng)春堿(vinblastine)又稱長(zhǎng)春花堿是由夾竹桃科植物長(zhǎng)春花(catharanthusroseus)中提出的一種生物堿，為細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥。作用于g1、s及m期，并對(duì)m期有延緩作用。能干擾增殖細(xì)胞紡錘體的形成，使有絲分裂停止于中期。并有免疫抑制作用。對(duì)何杰金氏病(hodgkinslymphoma)、絨毛膜上皮癌療效較好，對(duì)急性白血病、乳腺癌、卵巢癌、睪丸癌、頭頸部癌、口咽部癌、單核細(xì)胞白血病均有一定療效。對(duì)淋巴肉瘤、網(wǎng)狀細(xì)胞肉瘤、腎母細(xì)胞瘤、惡性黑色素瘤也有效。

目前主要是從天然植物中提取長(zhǎng)春堿，雖然利用化學(xué)合成和半合成的方法可以得到長(zhǎng)春堿及其衍生物，也有人研究通過組織培養(yǎng)的途徑獲得，但都不理想，不適合生產(chǎn)。組織培養(yǎng)的方法不能合成長(zhǎng)春堿的前體之一文多靈，可能是因?yàn)榻M織培養(yǎng)體系不能產(chǎn)生合成文多靈所需的某種酶，這樣組織培養(yǎng)就不能大規(guī)模地生產(chǎn)長(zhǎng)春堿。所以從植物體中直接提取長(zhǎng)春堿就顯得尤為重要，如何提高植物體中長(zhǎng)春堿的含量也成為研究的熱點(diǎn)之一。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了達(dá)到提高長(zhǎng)春花植物體中長(zhǎng)春堿含量的目的，本發(fā)明采用一種新的長(zhǎng)春花栽培方法，具體技術(shù)方案為：

提高長(zhǎng)春花植物體中長(zhǎng)春堿含量的栽培方法，將一定濃度的h2o2、乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸的水溶液外施于長(zhǎng)春花幼苗或成熟植株，噴灑一次或數(shù)次。處理后采收長(zhǎng)春花的枝葉，提取其中的長(zhǎng)春堿并檢測(cè)其含量。

所述的h2o2、乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸水溶液，h2o2濃度在10～1000mmol/l的范圍內(nèi)，乙烯利濃度在0.5～50g/l的范圍內(nèi)，乙酰水楊酸濃度在0.5～100mg/l的范圍內(nèi)，色氨酸的濃度在10～2000mg/l的范圍內(nèi)。

所述的外施于長(zhǎng)春花幼苗或成熟植物體，幼苗即從萌發(fā)后還未開花的植株，成熟植株即從開花后的植株。外施包括對(duì)地上植株的外施和對(duì)土壤的外施。

噴灑一次作用一定時(shí)間后進(jìn)行采收，或是間隔一定時(shí)間地噴灑數(shù)次后進(jìn)行采收。

在植物體中，長(zhǎng)春堿的生物合成途徑還不能確定，但根據(jù)已有的研究結(jié)果表明，它是由單萜吲哚生物堿文多靈和長(zhǎng)春質(zhì)堿耦合而成的，并且進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示這種耦合作用是在過氧化物酶(pod)的作用下進(jìn)行的。

pod是消除植物體內(nèi)氧自由基的一種活性酶，它與超氧物歧化酶(sod)和過氧化氫酶(cat)協(xié)調(diào)一致組成保護(hù)酶系統(tǒng)，將植物體內(nèi)的氧自由基維持在一個(gè)較低的水平。植物體內(nèi)的氧自由基包括o2˙ˉ、oh˙,sod可消除這些氧自由基，而細(xì)胞中的作為一種活性氧的h2o2可降低這種效率，超氧物歧化酶(sod)和過氧化氫酶(cat)又可以分解h2o2。h2o2參與植物體內(nèi)許多重要的生化過程。在正常情況下，氧自由基和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，氧自由基水平很低，不會(huì)傷害細(xì)胞。但當(dāng)植物受到外界脅迫時(shí)，這種動(dòng)態(tài)平衡就被打破。

植物體內(nèi)的活性氧含量過高，能夠造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的傷害：它可以引起線粒體結(jié)構(gòu)的損傷，導(dǎo)致某些生化功能受破壞；它也可以使脂膜分子結(jié)構(gòu)受干擾或破壞引起脂膜過氧化，干擾或破壞是與膜功能相關(guān)的各種生理功能；氧自由基亦可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)、酶和dna等生物大分子的損傷。而作為次生代謝產(chǎn)物的生物堿，在植物體內(nèi)的生理作用是行使某種保護(hù)測(cè)略，所以長(zhǎng)春堿的積累可能是某種逆境條件下細(xì)胞的正常代謝受到某種干擾而誘導(dǎo)的。

色氨酸是合成生物堿的前體之一，其在色氨酸脫羧酶的作用下首先轉(zhuǎn)化為色胺，在異胡豆苷合成酶的作用下進(jìn)一步合成吲哚類生物堿的共同前體異胡豆苷，運(yùn)用前體飼喂色氨酸的方法可使合成長(zhǎng)春堿的前體含量大大提高，使生物堿的代謝發(fā)生平衡流動(dòng)進(jìn)而提高長(zhǎng)春堿的含量。

本發(fā)明提供的提高長(zhǎng)春花植物體中長(zhǎng)春堿含量的栽培方法，根據(jù)以上原理向植物體噴施h2o2或者可以誘導(dǎo)長(zhǎng)春花植株體內(nèi)產(chǎn)生更多的h2o2的植物激素，來使植物體中更多的pod酶活性的激發(fā)，從而促進(jìn)文多靈與長(zhǎng)春質(zhì)堿的締合而形成長(zhǎng)春堿，或者運(yùn)用前體飼喂的方法增加長(zhǎng)春堿的合成速率，達(dá)到提高植物體中長(zhǎng)春堿的含量的目的。這種栽培方法簡(jiǎn)單易行，而且效果顯著，可大幅度提高長(zhǎng)春堿的含量，較傳統(tǒng)上的從未經(jīng)處理的長(zhǎng)春花植株內(nèi)直接提取長(zhǎng)春堿大大節(jié)省了原材料，并且傳統(tǒng)的提取已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了植物藥市場(chǎng)的年需求量。因此，該方法的為長(zhǎng)春堿的產(chǎn)業(yè)化提供了新方法開辟了新途徑。

本發(fā)明提供的提高長(zhǎng)春花植物體中長(zhǎng)春堿含量的栽培方法的技術(shù)效果有：

(1)噴施一定濃度的h2o2、乙烯利、乙酰水楊酸、色氨酸等溶液，其操作簡(jiǎn)單易行，適用于大規(guī)模生產(chǎn)，便于實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)春堿的產(chǎn)業(yè)化；

(2)提高長(zhǎng)春堿在長(zhǎng)春花植物體中的單位產(chǎn)量，可大大節(jié)省原材料，并且工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，還可同時(shí)獲得其它種類的生物堿，提高產(chǎn)業(yè)化的附加值。

具體實(shí)施方式

結(jié)合實(shí)施例說明本發(fā)明的具體技術(shù)方案。

實(shí)施例1：

將濃度為10mmol/l的h2o2溶液均勻地噴施于苗齡為3個(gè)月的長(zhǎng)春花幼苗的地上部分，培養(yǎng)2天后，采收長(zhǎng)春花幼苗的枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，長(zhǎng)春堿含量為25.4μg/gdw，較一般未經(jīng)處理的長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春堿的含量為約20μg/gdw，有所增加，但含量增加不顯著。

實(shí)施例2：

將濃度為100mmol/l的h2o2溶液均勻地噴施于苗齡為3個(gè)月的長(zhǎng)春花幼苗的地上部分，培養(yǎng)2天后，采收長(zhǎng)春花幼苗的枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，長(zhǎng)春堿含量為50.4μg/gdw，較一般未經(jīng)處理的長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春堿的含量約20μg/gdw，提高了1倍多。

實(shí)施例3：

將濃度為1000mmol/l的h2o2溶液均勻地噴施于苗齡為3個(gè)月的長(zhǎng)春花幼苗的地上部分，培養(yǎng)2天后，采收長(zhǎng)春花幼苗的枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，長(zhǎng)春堿含量為30.7μg/gdw，較一般未經(jīng)處理的長(zhǎng)春花中長(zhǎng)春堿的含量約20μg/gdw，有所提高，但與100mmol/l相比含量增加較少，綜合經(jīng)濟(jì)原因100mmol/l的h2o2溶液為最適濃度。

實(shí)施例4：

用濃度為0.5g/l的乙烯利溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，7天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含量為較未噴施乙烯利的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量增加了43.9％。

實(shí)施例5：

用濃度為25g/l的乙烯利溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，7天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含量為較未噴施乙烯利的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量增加了70.5％。

實(shí)施例6：

用濃度為50g/l的乙烯利溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，7天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含量為較未噴施乙烯利的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量增加了106.0％。

實(shí)施例7：

用濃度為0.5mg/l的乙酰水楊酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，4天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果含量為較未噴施乙酰水楊酸溶液的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量有所增加但增加含量不顯著。

實(shí)施例8：

用濃度為100mg/l的乙酰水楊酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，4天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示含量與未施加乙酰水楊酸溶液相比生物堿含量增加1.3倍。

實(shí)施例9：

用濃度為200mg/l的乙酰水楊酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，4天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示由于添加的濃度過高，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生了不利影響，細(xì)胞開始出現(xiàn)褐化現(xiàn)象。

實(shí)施例10：

用濃度為10mg/l的色氨酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，5天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示由于色氨酸溶液濃度較低，長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量雖有所增加但增加含量不顯著。

實(shí)施例11：

用濃度為1000mg/l的色氨酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，5天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示噴灑過濃度為1000mg/l的色氨酸溶液的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量較未噴施的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量增加1倍。

實(shí)施例12：

用濃度為2000mg/l的色氨酸溶液均勻地噴施于苗齡為18個(gè)月的成熟長(zhǎng)春花植株的地上部分，5天后采收長(zhǎng)春花枝葉，烘干后提取長(zhǎng)春堿并用高效液相法進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示噴灑過濃度為2000mg/l的色氨酸溶液的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量是未噴施的長(zhǎng)春花葉片中長(zhǎng)春堿含量的3.14倍。