本發(fā)明涉及植物組織培養(yǎng)技術領域，具體而言，本發(fā)明涉及一種長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的方法、一種適于長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的培養(yǎng)基體系以及一種確定長瓣兜蘭果莢最佳采集期的方法。

背景技術：

兜蘭屬(Paphiopedilum)是蘭科植物中最具特色最原始的類群之一。兜蘭屬植物由于獨特的花型、絢麗的花色、持久的花期而具有極高的觀賞價值，是國際花卉市場上十分流行的高檔花卉，在世界上擁有大量的愛好者。近年來，在國內外蘭展和花展上出現(xiàn)了越來越多的兜蘭，隨著人們生活水平的提高，越來越多的人開始喜歡和消費這一名貴蘭花。兜蘭產業(yè)已經悄然起步，很多兜蘭雜交種和原生種都已經能夠經過無菌播種，適宜栽培基質的栽培，作為高檔的年宵花滿足消費者的高端需求。然而，令人遺憾的是，市場上絕大多數(shù)原產于我國的兜蘭都是從山上直接采挖的“下山蘭”。由于其分布區(qū)域狹窄、原產地氣候異常、生境喪失、資源遭受掠奪性采挖，兜蘭種群數(shù)量正在迅速減少而瀕臨滅絕。

長瓣兜蘭(Paphiopedilum dianthum)是附生蘭，常附生在石縫或巖壁上，葉片2-5枚，粗厚，花莛高30-80cm，花通常2-4朵，花瓣黃綠色并有深淺不同的條紋，帶狀扭曲下垂，唇瓣褐黃色或淺褐色，花期一般在7-9月。長瓣兜蘭為我國特有種，葉色濃綠厚實，花型優(yōu)雅，是《國家重點保護野生植物名錄》一級保護植物，也是中國僅有的幾種多花型兜蘭之一。由于長瓣兜蘭種子沒有胚乳而只有發(fā)育不完全的胚，種子在自然條件下極難萌發(fā)，且繁殖率低。因此，采用組織培養(yǎng)技術有利于解決其繁殖困難的問題并且可以在短期內提供大量種苗。然而，現(xiàn)有技術中鮮有關于長瓣兜蘭組織培養(yǎng)技術的報道，僅王蓮輝等(王蓮輝等,“長瓣兜蘭的組織培養(yǎng)與快速繁殖”,《植物生理學報》,2009,45(9):887-888)對長瓣兜蘭進行了無菌播種及組培快繁實驗，證明1/2MS+100mL·L-1椰汁或者MS+100mL·L-1椰汁的培養(yǎng)基比較適合種子萌發(fā)，能達到60％以上；1/2MS+6-BA 0.2+NAA 1.0+100mL·L-1椰汁是最佳增殖繼代培養(yǎng)基，80-90天能繼代一次；1/2MS+吲哚丁酸(IBA)0.2+2g·L-1活性炭是比較好的生根培養(yǎng)基。

因此，為了保護長瓣兜蘭的野生資源同時滿足消費者的需求，有必要提供一種長瓣兜蘭的快速繁殖體系，以縮短其培養(yǎng)周期、提高種苗成活率和幼苗質量、降低成本，從而滿足市場對這一觀賞花卉不斷增長的需求。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決上述問題和克服現(xiàn)有技術中的缺陷，本發(fā)明提供了一種長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的方法、一種適于長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的培養(yǎng)基體系以及提供了長瓣兜蘭果莢的最佳采集期。

本發(fā)明的第一方面提供了一種長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的方法，包括以下步驟：

(1)自交授粉：選擇花大色艷的長瓣兜蘭進行異花授粉；

(2)果莢采摘：在長瓣兜蘭自交后240-330天左右采集果莢；

(3)無菌播種：以采集的果莢為外植體進行消毒，切開果莢將種子接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)大約40-50天，待30％種子長出原球莖，轉為光照周期為12h培養(yǎng)；

(4)增殖繼代培養(yǎng)：將步驟(3)中產生的幼苗接種到增殖培養(yǎng)基中，每4周繼代一次，增值率達3倍；

(5)生根壯苗培養(yǎng)：將步驟(4)中增殖培養(yǎng)大約8周的、生長健壯的2cm左右的幼苗轉接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)；

(6)生根苗移栽：在步驟(5)中的幼苗培養(yǎng)大約4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養(yǎng)。

在一個優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的所述萌發(fā)培養(yǎng)基為1/5MS+0.1-0.5mg/L NAA+50-150ml/L椰汁+20.0-35.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+0.5-1.5g/L活性炭，更優(yōu)選地，所述萌發(fā)培養(yǎng)基是下面表4中的第⑥號培養(yǎng)基(1/5MS+NAA培養(yǎng)基)。

在可選的實施方式中，在本發(fā)明方法中使用的萌發(fā)培養(yǎng)基可以含有例如大約20、大約25、大約30、大約35g/L蔗糖及任何兩個數(shù)值范圍之間的點，例如，可以含有大約23、大約24、大約26g/L等的蔗糖。

在一個優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的所述萌發(fā)培養(yǎng)基為1/5MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+1.0g/L活性炭，更優(yōu)選地，所述萌發(fā)培養(yǎng)基是下面表4中的第⑥號培養(yǎng)基(1/5MS+NAA培養(yǎng)基)。

在可選的實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的所述萌發(fā)培養(yǎng)基是下面表4中的第①至⑧號培養(yǎng)基中的任意一種培養(yǎng)基。例如，所述萌發(fā)培養(yǎng)基可以是第①號培養(yǎng)基(花寶1號培養(yǎng)基)、第②號培養(yǎng)基(KC培養(yǎng)基)、第③號培養(yǎng)基(MS+NAA培養(yǎng)基)、第④號培養(yǎng)基(VW培養(yǎng)基)、第⑤號培養(yǎng)基(1/2MS+NAA培養(yǎng)基)、第⑥號培養(yǎng)基(1/5MS+NAA培養(yǎng)基)、第⑦號培養(yǎng)基(RM培養(yǎng)基)或第⑧號培養(yǎng)基(RE培養(yǎng)基)。

在一個實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的所述增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.05-1.0mg/L NAA+0.1-2.0mg/L 6-BA+20.0-35.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+50-150ml/L椰汁+0.5-1.5g/L活性炭。

在可選的實施方式中，本發(fā)明所述的增殖培養(yǎng)基可以含有例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0mg/L 6-BA以及上述任意數(shù)值范圍之間的點。

在可選的實施方式中，本發(fā)明所述的增殖培養(yǎng)基可以含有例如0.0.5、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0mg/L NAA以及上述任意數(shù)值范圍之間的點。

在一個優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的所述增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+1.0g/L活性炭。

在一個優(yōu)選的實施方式中，在本發(fā)明的方法中使用的所述生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠+1.5g/L活性炭。

在一個優(yōu)選的實施方式中，在長瓣兜蘭自交后第220天左右、第240天左右、第270天左右、第330天左右、第340天左右或上述任意時間點之間的任意時間點采集果莢。例如，可以在長瓣兜蘭自交后第220天左右、第230天左右、第240天左右、第250天左右、第260天左右、第270天左右、第280天左右、第290天左右、第300天左右、第310天左右、第320天左右、第330天左右、第340天左右或上述任意時間點之間的任意時間點采集果莢。優(yōu)選地，在長瓣兜蘭自交后第270-330天左右、第300-330天左右或第330-340天左右采摘果莢，更優(yōu)選地在長瓣兜蘭自交后第270-330天左右采摘果莢，甚至更有選地在長瓣兜蘭自交后第330天左右采摘果莢。

在一個實施方式中，在本發(fā)明的方法中，培養(yǎng)室培養(yǎng)的溫度為24±2℃，光照強度為1000-15001x，光照周期為12h；黑暗培養(yǎng)溫度為24±2℃。

本發(fā)明的第二方面提供了一種用于長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的萌發(fā)培養(yǎng)基，所述萌發(fā)培養(yǎng)基為1/5MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+1.0g/L活性炭，更優(yōu)選地，所述萌發(fā)培養(yǎng)基是下面表4中的第⑥號培養(yǎng)基(1/5MS+NAA培養(yǎng)基)。

在可選的實施方式中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基可以是下面表4中的第①至⑧號培養(yǎng)基中的任意一種培養(yǎng)基。例如，所述萌發(fā)培養(yǎng)基可以是第①號培養(yǎng)基(花寶1號培養(yǎng)基)、第②號培養(yǎng)基(KC培養(yǎng)基)、第③號培養(yǎng)基(MS+NAA培養(yǎng)基)、第④號培養(yǎng)基(VW培養(yǎng)基)、第⑤號培養(yǎng)基(1/2MS+NAA培養(yǎng)基)、第⑥號培養(yǎng)基(1/5MS+NAA培養(yǎng)基)、第⑦號培養(yǎng)基(RM培養(yǎng)基)或第⑧號培養(yǎng)基(RE培養(yǎng)基)。

本發(fā)明的第三方面提供了一種用于長瓣兜蘭組織培養(yǎng)快速繁殖的培養(yǎng)基體系，其包含萌發(fā)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根壯苗培養(yǎng)基，其中所述萌發(fā)培養(yǎng)基為1/5MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+1.0g/L活性炭。

在一個優(yōu)選的實施方式中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基是下面表4中的第⑥號培養(yǎng)基(1/5MS+NAA培養(yǎng)基)。

在可選的實施方式中，所述萌發(fā)培養(yǎng)基可以是上述任何一種萌發(fā)培養(yǎng)基。

在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)基體系中的所述增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+1.0g/L活性炭。

在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)基體系中的所述生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠+1.5g/L活性炭。

在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的培養(yǎng)基體系是下面表1所示的培養(yǎng)基體系，表1列出了本發(fā)明培養(yǎng)基體系中的各種培養(yǎng)基的成分及其用量。

表1.長瓣兜蘭的離體培養(yǎng)基體系

注：表1中的生根壯苗培養(yǎng)基，既可作為一般生根壯苗培養(yǎng)基，也是本發(fā)明所指的可用來做長期繼代的培養(yǎng)基。

定義

為了便于對本發(fā)明的理解，對上述各個方面中所用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)基中所用到的植物激素進行定義。

本發(fā)明所使用的MS基本培養(yǎng)基是根據(jù)Murashige T.等(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant,1962,15:473-497)配制的，其成分及各成分含量如下表2所示。1/2MS為MS基本培養(yǎng)基中大量元素減半，其他元素用量不變；1/5MS為MS基本培養(yǎng)基中大量元素減至五分之一，其他元素用量不變。

本文中培養(yǎng)基中的成分“NAA”是指萘乙酸。

本文中所述的“6-BA”是指6-芐氨基嘌呤。

表2.MS培養(yǎng)基各成分及含量

本發(fā)明的有益技術效果

本發(fā)明產生的積極效果是：

(a)本發(fā)明所采用的外植體可在某固定時間段大量集中獲得并進行組織培養(yǎng)，打破了外植體不易獲得且污染率高的限制；

(b)本發(fā)明確定了長瓣兜蘭最佳果莢采收時間，發(fā)芽率最高，且種苗生長強壯；

(c)本發(fā)明確定了長瓣兜蘭最佳萌發(fā)培養(yǎng)基，大大提高了種子的萌發(fā)率以及后期的成活率；以及

(d)本發(fā)明還提供了包括萌發(fā)培養(yǎng)基、增殖培養(yǎng)基和生根壯苗培養(yǎng)基的培養(yǎng)基體系，培養(yǎng)基配方簡單，離體快繁的操作流程簡潔易操作，生產低成本，可進行商業(yè)化大規(guī)模生產。

前述內容僅僅是示意性的并且決不旨在是限制性的。除了上述示意性方面、實施方式和特征，通過參考下述詳細說明，進一步的方面、實施方式和特征將更容易被理解。

附圖簡述

通過參考下述附圖，本發(fā)明的進一步的方面、特征將更容易被理解。本領域技術人員應該理解，這些附圖僅示意性地闡述了根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，而不應將其視為是對本發(fā)明范圍的限制。

圖1示出了長瓣兜蘭授粉過程的示意圖。

圖2示出了不同時期采集的兜蘭種子的萌發(fā)情況。

圖3示出了在12h光照周期培養(yǎng)后8周左右，長瓣兜蘭在9種不同萌發(fā)培養(yǎng)基上的萌發(fā)情況的照片，其中各培養(yǎng)基如下面表4所示。

圖4示出了在12h光照周期培養(yǎng)后8周左右，長瓣兜蘭在9種不同萌發(fā)培養(yǎng)基上的平均萌發(fā)率的柱狀圖，其中各培養(yǎng)基如下面表4所示。

圖5示出了根據(jù)本發(fā)明一個方面的長瓣兜蘭組培快繁技術體系的流程圖。

圖6示出了根據(jù)本發(fā)明一個方面的長瓣兜蘭的組織培養(yǎng)過程圖。

圖7示出了長瓣兜蘭的出瓶煉苗情況。

具體實施方式

在下文中，僅簡單地描述了某些示例性實施例。正如本領域技術人員可認識到的那樣，在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可通過各種不同方式修改所描述的實施例。因此，附圖和描述被認為本質上是示例性的而非限制性的。

實施例1.長瓣兜蘭自交授粉和果莢最佳采摘期的確定

實驗材料：長瓣兜蘭獲取自中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所溫室；本發(fā)明所有實施例中使用的各種試劑或培養(yǎng)基成分均經商購獲得。

選擇花大色艷的長瓣兜蘭進行人工異花授粉，如圖1所示，授粉后生長得到果莢。

授粉后，分別在第240天、第270天、第300天、第330天、第360天、第390天以及第420天收集果莢。

將上述果莢分別用自來水洗凈后，置于10％次氯酸鈉溶液中消毒20分鐘，用70％酒精表面消毒30秒，再以0.1％升汞消毒10分鐘，最后用無菌水沖洗5次。將洗凈的果莢切開，將種子接種于培養(yǎng)基上行進行暗培養(yǎng)40天，待30％種子長出原球莖，轉為光照周期為12h培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)室培養(yǎng)的溫度為24±2℃，光照強度為1000-15001x，光照周期為12h；黑暗培養(yǎng)溫度為24±2℃。

結果發(fā)現(xiàn)，在第240天采集的種子的萌發(fā)率可高達75％以上，而在第330天采集的種子的萌發(fā)率達到峰值，在第360天以及以后采集的種子的萌發(fā)率大大降低，如下表3所示。采用的培養(yǎng)基為1/5MS+0.3mg/LNAA+100ml/L椰汁+1.0g/L活性炭。

表3.不同采收期(240-420天)種子的萌發(fā)情況表

實施例2.長瓣兜蘭種子最佳萌發(fā)培養(yǎng)基的確定

設計8種不同的萌發(fā)培養(yǎng)基，以現(xiàn)有技術中已有的MS培養(yǎng)基補充以蔗糖和卡拉膠(第⑨號萌發(fā)培養(yǎng)基)作為對照，如表4所示。

表4. 9種培養(yǎng)基各成分及含量

按照如實施例1所述的方法，將授粉后第330天采集的果莢中的種子分別接種于上述表4中的9種培養(yǎng)基中進行萌發(fā)培養(yǎng)，觀察種子的萌發(fā)情況。

結果發(fā)現(xiàn)，長瓣兜蘭的種子在本發(fā)明設計的8種萌發(fā)培養(yǎng)基中均能良好地萌發(fā)，萌發(fā)率顯著高于對照培養(yǎng)基，其中在第⑥號培養(yǎng)基中的萌發(fā)率最高，達78.76％(如圖3-4所示)。

實施例3.長瓣兜蘭種子最佳增殖培養(yǎng)基的確定

設計5種不同的增殖培養(yǎng)基，如表5所示。

表5.不同增殖培養(yǎng)基上長瓣兜蘭原球莖增殖與分化情況

將實施例2中培養(yǎng)的幼苗接種到上述增殖培養(yǎng)基中，每4周繼代一次，觀察幼苗的增殖情況。

增殖培養(yǎng)大約8周左右，發(fā)現(xiàn)幼苗在第2種增殖培養(yǎng)基中的增殖效果好，愈傷上長原球莖，且幼苗健壯。

實施例4.長瓣兜蘭種子的組織培養(yǎng)快速繁殖

如附圖5-7所示，本發(fā)明的長瓣兜蘭種子的組織培養(yǎng)快速繁殖方法包括如下步驟：

1、自交授粉：選擇花大色艷的長瓣兜蘭進行異花授粉；

2、果莢采摘：在長瓣兜蘭自交后270天左右采集果莢；

3、無菌播種：按照實施例1中所述的方法以采集的果莢為外植體進行消毒，切開果莢將種子接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)40天，待30％種子長出原球莖，轉為光照周期為12h培養(yǎng)，種子萌發(fā)率可達80.32％，其中萌發(fā)培養(yǎng)基為表4中的第⑥號培養(yǎng)基；

4、增殖繼代培養(yǎng)：將步驟3中產生的幼苗接種到增殖培養(yǎng)基中，每4周繼代一次，增值率達3倍，其中增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA+100ml/L椰汁+0.5mg/L 6-BA；

5、生根壯苗培養(yǎng)：將步驟4中增殖培養(yǎng)8周的、生長健壯的2cm左右的幼苗轉接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠+1.5g/L活性炭；

6、生根苗移栽：在步驟5中的幼苗培養(yǎng)4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養(yǎng)，成活率可達95％。

實施例5.長瓣兜蘭種子的組織培養(yǎng)快速繁殖

如附圖5-7所示，本發(fā)明的長瓣兜蘭種子的組織培養(yǎng)快速繁殖方法包括如下步驟：

1、自交授粉：選擇花大色艷的長瓣兜蘭進行異花授粉；

2、果莢采摘：在長瓣兜蘭自交后300天左右采集果莢；

3、無菌播種：按照實施例1中所述的方法以采集的果莢為外植體進行消毒，切開果莢將種子接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)40天，待30％種子長出原球莖，轉為光照周期為12h培養(yǎng)，種子萌發(fā)率可達75.96％，其中萌發(fā)培養(yǎng)基為表4中的第⑥號培養(yǎng)基；

4、增殖繼代培養(yǎng)：將步驟3中產生的幼苗接種到增殖培養(yǎng)基中，每4周繼代一次，增值率達3倍，其中增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA+100ml/L椰汁+0.5mg/L 6-BA；

5、生根壯苗培養(yǎng)：將步驟4中增殖培養(yǎng)8周的、生長健壯的2cm左右的幼苗轉接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠+1.5g/L活性炭；

6、生根苗移栽：在步驟5中的幼苗培養(yǎng)4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養(yǎng)，成活率可達95％。

實施例6.長瓣兜蘭種子的組織培養(yǎng)快速繁殖

如附圖5-7所示，本發(fā)明的長瓣兜蘭種子的組織培養(yǎng)快速繁殖方法包括如下步驟：

1、自交授粉：選擇花大色艷的長瓣兜蘭進行異花授粉；

2、果莢采摘：在長瓣兜蘭自交后330天左右采集果莢；

3、無菌播種：按照實施例1中所述的方法以采集的果莢為外植體進行消毒，切開果莢將種子接種在萌發(fā)培養(yǎng)基中進行暗培養(yǎng)40天，待30％種子長出原球莖，轉為光照周期為12h培養(yǎng)，種子萌發(fā)率可達82.56％，其中萌發(fā)培養(yǎng)基為表4中的第⑥號培養(yǎng)基；

4、增殖繼代培養(yǎng)：將步驟3中產生的幼苗接種到增殖培養(yǎng)基中，每4周繼代一次，增值率達3倍，其中增殖培養(yǎng)基為1/2MS+0.1mg/L NAA+0.5mg/L 6-BA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.5g/L卡拉膠+1.0g/L活性炭；

5、生根壯苗培養(yǎng)：將步驟4中增殖培養(yǎng)8周的、生長健壯的2cm左右的幼苗轉接到生根壯苗培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，其中生根壯苗培養(yǎng)基為1/2MS+0.3mg/L NAA+100ml/L椰汁+20.0g/L蔗糖+4.6g/L卡拉膠+1.5g/L活性炭；

6、生根苗移栽：在步驟5中的幼苗培養(yǎng)4周后，將根系生長良好的植株轉移到自然光下煉苗，然后將其移栽至基質中進行培養(yǎng)，成活率可達95％。

以上所述，僅為本發(fā)明的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明揭露的技術范圍內，可輕易想到其各種變化或替換，這些都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內。因此，本發(fā)明的保護范圍應以所述權利要求的保護范圍為準。