1.一種越橘植物種質(zhì)的超低溫保存方法,其特征在于,它包括:
1)煉苗:選取4周苗齡的組培苗,取0.4-0.6 cm帶有頂芽的莖段接種到WPM培養(yǎng)基上4℃暗處理2—4周;
2)越橘莖尖剝?nèi)。涸跓o(wú)菌條件下,在體視顯微鏡下剝?nèi)捗绾蟮捻斞?,莖尖長(zhǎng)為1.5—2.0mm;
3)預(yù)培養(yǎng):將剝?nèi)〉那o尖接種于添加有0.3M蔗糖的WPM固體培養(yǎng)上,于組培室黑暗培養(yǎng)18—30h;
4)裝載:將預(yù)培養(yǎng)后的離體莖尖轉(zhuǎn)接于裝載液中,于室溫下裝載處理20-40min;
5)玻璃化處理:將裝載處理后的莖尖轉(zhuǎn)接于PVS2溶液中,于0℃處理30-50min;
6)小液滴制作:將PVS2處理后的莖尖轉(zhuǎn)移到鋁箔條上 ,并向每個(gè)莖尖滴加6μLPVS2溶液,使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中,每個(gè)錫箔條上放9-11個(gè)莖尖;
7)超低溫冷凍保存:將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進(jìn)行冷凍,然后將冷凍后的錫箔條置于冷凍離心管中,蓋緊蓋子后,投入液氮中保存。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的越橘植物種質(zhì)的超低溫保存方法,其特征在于:步驟1) 所述的的煉苗時(shí)間為3周,步驟3)所述的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為24h時(shí)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的越橘植物種質(zhì)的超低溫保存方法,其特征在于:步驟4)中所述的裝載液的組成為:WPM+2M甘油+1.0M蔗糖,裝載時(shí)間為30min。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的越橘植物種質(zhì)的超低溫保存方法,其特征在于:步驟5)所述的PVS2溶液的組成為:WPM+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲亞砜+0.4M蔗糖;處理時(shí)間為40min時(shí)。
5.超低溫保存越橘植物種質(zhì)恢復(fù)培養(yǎng)的方法,其特征在于,它還包括:
1)卸載:將權(quán)利要求1所述的一種越橘植物種質(zhì)的超低溫保存方法的步驟7)超低溫冷凍保存的離體莖尖取出,放置于卸載液中進(jìn)行解凍和卸載;所述的卸載液的組分為:WPM+1.2M蔗糖;卸載條件為:室溫下卸載20min;
2)恢復(fù)培養(yǎng):將卸載處理后的離體莖尖用無(wú)菌濾紙吸干表面殘留液,轉(zhuǎn)接于恢復(fù)培養(yǎng)基中進(jìn)行恢復(fù)培養(yǎng);前述的方法,恢復(fù)培養(yǎng)基為WPM+0-0.5mg/L ZT +3%蔗糖+0.7%瓊脂,pH=5.8;恢復(fù)培養(yǎng)條件為:組培室黑暗培養(yǎng) 1d ,最后轉(zhuǎn)至正常光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。