本發(fā)明涉及睪丸組織冷凍保存，更詳細地說，本發(fā)明涉及寵物睪丸組織凍存與復蘇試劑以及寵物睪丸組織凍存與復蘇方法。
背景技術：
：寵物(主要指作為伴侶動物的狗和貓)能夠陪伴人類，緩解日常生活中的壓力，愉悅心情，促進人類健康，成為家庭中的一員。隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展、老齡化程度的加重，對寵物的需求越來越大。寵物數(shù)量增加的同時，寵物食品、寵物用品、寵物培訓等產(chǎn)業(yè)得到了蓬勃的發(fā)展。寵物健康領域并沒有受到足夠的關注，也尚未形成規(guī)范。相比人類健康市場，寵物健康市場有很大的空間尚待挖掘。關愛寵物，關注寵物健康。國內外一般推薦寵物在6到8月齡時進行絕育或去勢手術。主要優(yōu)點包括避免很多與生殖激素相關疾病的發(fā)生，節(jié)省寵物主人在寵物生殖方面的時間花費，控制群體數(shù)量。寵物的去勢是指雄性寵物的睪丸及其附屬組織摘除術。對于寵物個體而言，去勢手術可以降低雄性寵物發(fā)生前列腺增生和感染的機率，減少會陰疝的發(fā)生率。然而，切除睪丸之后，目前都將睪丸組織丟棄，寵物不僅喪失了生殖能力，體內的激素水平也遭到了破壞。長期的激素水平失調會造成寵物精神狀態(tài)萎靡、行為異常，隨著年齡的增長往往導致肥胖等代謝疾病。寵物的運動系統(tǒng)發(fā)育也會受到影響，關節(jié)韌帶發(fā)育不良，骨質疏松等發(fā)病風險增高，還會增加骨肉瘤的發(fā)生率。目前的處理方式無法給寵物二次選擇的機會，絕育就意味著喪失生殖力與破壞激素水平。相比人類健康領域，睪丸組織凍存技術、精原細胞體外誘導分化技術和睪丸間質細胞體外培養(yǎng)技術在不斷發(fā)展。理想的方式是通過凍存技術保存生殖力，在必要的時候可選擇性的體外分化出精子來恢復生殖力，擴增間質細胞可用于自體回輸恢復激素水平。寵物健康領域此類凍存技術尚沒有得到開發(fā)和應用。技術實現(xiàn)要素：發(fā)明要解決的技術問題本發(fā)明的目的是提供一種快速高效的寵物睪丸組織凍存與復蘇試劑以及凍存與復蘇方法。用于解決上述技術問題的方案本發(fā)明包含寵物睪丸組織凍存試劑和寵物睪丸組織復蘇試劑，成分明確穩(wěn)定，保質期長，制備后可直接應用于寵物睪丸組織的凍存和復蘇，使用方便，組織復蘇活性高。本發(fā)明依托組織玻璃化凍存(快速凍存，直接從常溫進入液氮)理論技術，凍存試劑中聯(lián)合使用兩種低溫保護劑二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PROH)，提高玻璃化效率的同時減低保護劑對細胞的毒性。首次將枸杞多糖(LBP)用于組織玻璃化凍存，在寵物睪丸組織凍存中效果遠優(yōu)于傳統(tǒng)的蔗糖(SUC)；針對睪丸組織特性，凍存和復蘇試劑中均添加膽固醇(CHO)，較大程度的保護了睪丸組織中精原細胞和精子的活性。本發(fā)明的第一方面，提供了寵物睪丸組織凍存試劑組。所述寵物睪丸組織凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖2～7W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培養(yǎng)基80～90V/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖8～10W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖15～20W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％。較優(yōu)的，所述凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖2～7W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培養(yǎng)基80～90V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖8～10W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖15～20W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，二甲基亞砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培養(yǎng)基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％。較優(yōu)的，所述凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖6W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培養(yǎng)基85V/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖9W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖18W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％。更優(yōu)的，所述凍存試劑組包括：(1)凍存試劑1：枸杞多糖6W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培養(yǎng)基85V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(2)凍存試劑2：枸杞多糖9W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(3)凍存試劑3：枸杞多糖18W/V％，膽固醇2.5W/V％，二甲基亞砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培養(yǎng)基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％。本發(fā)明的第二方面，提供了寵物睪丸組織復蘇試劑組，所述復蘇試劑組包括：(1)復蘇試劑1：枸杞多糖35～55W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％；(2)復蘇試劑2：枸杞多糖25～45W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％；(3)復蘇試劑3：枸杞多糖15～35W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％；(4)復蘇試劑4：枸杞多糖5～25W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％。較優(yōu)的，所述復蘇試劑組包括：(1)復蘇試劑1：枸杞多糖35～55W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(2)復蘇試劑2：枸杞多糖25～45W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；(3)復蘇試劑3：枸杞多糖15～35W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％；(4)復蘇試劑4：枸杞多糖5～25W/V％，膽固醇0.5～5W/V％，維生素E0.05～0.35V/V％，MEM培養(yǎng)基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％。較優(yōu)的，所述復蘇試劑組包括：(1)復蘇試劑1：枸杞多糖40W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％；(2)復蘇試劑2：枸杞多糖30W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％；(3)復蘇試劑3：枸杞多糖20W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％；(4)復蘇試劑4：枸杞多糖10W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％。更優(yōu)的，所述復蘇試劑組包括：(1)復蘇試劑1：枸杞多糖40W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(2)復蘇試劑2：枸杞多糖30W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；(3)復蘇試劑3：枸杞多糖20W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，葡萄糖5W/V％；(4)復蘇試劑4：枸杞多糖10W/V％，膽固醇2.5W/V％，維生素E0.2V/V％，MEM培養(yǎng)基99.8％，葡萄糖5W/V％。本發(fā)明的第三個方面是提供一種寵物睪丸組織凍存復蘇試劑套裝，包括上述第一方面的凍存試劑組和第二方面的復蘇試劑組。本發(fā)明的第四個方面是提供一種寵物睪丸組織凍存方法，包括：將離體寵物睪丸組織依次浸入上述第一方面的凍存試劑1、凍存試劑2、凍存試劑3中保持5分鐘以上之后，液氮存儲。本發(fā)明的第五個方面是提供一種寵物睪丸組織復蘇方法，包括：將經(jīng)凍存的離體寵物睪丸組織依次浸入上述第二方面的復蘇試劑1、復蘇試劑2中，在37±2℃各保持2分鐘以上，之后，移入上述第二方面的復蘇試劑3、復蘇試劑4中，室溫下各保持10分鐘以上。發(fā)明效果本發(fā)明的凍存復蘇試劑組可以使寵物睪丸組織短期(約一周)凍存、復蘇的活率達到80％以上，長期(約三年)凍存、復蘇的活率達到55％以上，能夠很好的冷凍保存生殖力，給寵物二次選擇的機會。發(fā)明人首次將枸杞多糖引入凍存領域，首次將維生素E引入復蘇試劑，取得了非常顯著的效果。此外，針對精原細胞和精子中含有豐富的膽固醇的生理情況，在凍存液和復蘇液中加入膽固醇防止細胞內的膽固醇丟失而影響細胞活性。三種物質協(xié)同作用，取得了針對寵物睪丸組織凍存、復蘇的非常顯著的協(xié)同效果。本發(fā)明試劑成分明確，制備方便，利于大規(guī)模生產(chǎn)。一直以來，組織玻璃化凍存領域重點在于針對不同的細胞和組織，尋找毒性較小的玻璃化溶液配比方案及提高降、復溫速率的方法。本發(fā)明中通過聯(lián)用兩種細胞保護劑二甲基亞砜和丙二醇，在保證效果的同時控制細胞保護劑對細胞造成的毒性。本發(fā)明凍存試劑組包含3種試劑，復蘇試劑組包含4種試劑，梯度化升高和降低枸杞多糖的濃度較一步法效果優(yōu)。具體實施方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內容相似或均等的方法及材料皆可應用于本發(fā)明中。文中所述的較佳實施方法與材料僅作示范之用。實施例1-5：寵物睪丸組織凍存試劑的制備(1)以100ml凍存試劑1制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮((簡稱PVP)購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?2)以100ml凍存試劑2制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?3)以100ml凍存試劑3制備為例：分別按照表1所示的量，量取二甲基亞砜(購自SIGMA)、丙二醇(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的寵物睪丸組織凍存試劑組包括三種試劑，其中的枸杞多糖濃度依次增大。表1：凍存試劑的制備實施例6-10：寵物睪丸組織復蘇試劑的制備(1)以100ml復蘇試劑1制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(油狀液體，純度標≥98％)(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?2)以100ml復蘇試劑2制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻。稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、聚乙烯吡咯烷酮(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?3)以100ml復蘇試劑3制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆茫?4)以100ml復蘇試劑4制備為例：分別按照表2所示的量，量取維生素E(購自SIGMA)、MEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)放入250ml藍口瓶(購自蜀牛)，輕搖混勻；稱取枸杞多糖(購自斯諾特生物)、膽固醇(購自SIGMA)、葡萄糖(購自SIGMA)加入上述瓶中，搖晃混勻。待固體全部溶解后用0.22μm濾器(購自MILLIPORE)過濾除菌，過濾至經(jīng)過高壓滅菌的100ml藍口瓶(購自蜀牛)，4℃保存?zhèn)溆?。本發(fā)明的寵物睪丸組織復蘇試劑組包括四種試劑，其中的枸杞多糖濃度依次降低。表2：復蘇試劑的制備對照例對照A組：除了凍存和復蘇試劑中均去除膽固醇外，其他條件與實施例5和實施例10相同。對照B組：在實驗對照A組基礎上將枸杞多糖換成等量的蔗糖，其他條件不變。對照C組：除了將凍存和復蘇試劑中的枸杞多糖換成等量的蔗糖外，其他條件與實施例5和實施例10相同。傳統(tǒng)對照組，采用文獻試劑和方法凍存，簡述如下：凍存試劑包括95％DMEM培養(yǎng)基，5％DMSO；復蘇試劑為DMEM培養(yǎng)基，具體操作步驟見文獻(于潔,萬匯涓,尹美珺,等.冷凍保存未成熟睪丸組織移植后生精細胞的生長發(fā)育[J].中國男科學雜志,2008,22(12):15-18.)。表3：對照A組對照B組對照C組凍存試劑1DMSO(ml)101010丙二醇(ml)555MEM培養(yǎng)基(ml)858585枸杞多糖/蔗糖(g)6(枸杞多糖)6(蔗糖)6(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555凍存試劑2DMSO(ml)121212丙二醇(ml)131313MEM培養(yǎng)基(ml)757575枸杞多糖/蔗糖(g)9(枸杞多糖)9(蔗糖)9(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555凍存試劑3DMSO(ml)121212丙二醇(ml)131313MEM培養(yǎng)基(ml)757575枸杞多糖/蔗糖(g)18(枸杞多糖)18(蔗糖)18(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555復蘇試劑1維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)40(枸杞多糖)40(蔗糖)40(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555復蘇試劑2維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)30(枸杞多糖)30(蔗糖)30(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)0.30.30.3葡萄糖(g)555復蘇試劑3維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)20(枸杞多糖)20(蔗糖)20(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)---葡萄糖(g)555復蘇試劑4維生素E(ml)0.20.20.2MEM培養(yǎng)基(ml)99.899.899.8枸杞多糖/蔗糖(g)10(枸杞多糖)10(蔗糖)10(蔗糖)膽固醇(g)--2.5PVP(g)---葡萄糖(g)555效果試驗：1.寵物睪丸組織凍存、復蘇試劑的短期效果驗證(1)睪丸組織的獲?。涸趯櫸镏?、寵物醫(yī)生知情同意的情況下，分別收集6～8月齡寵物狗進行絕育手術時切除下來的睪丸組織。20分鐘內，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的組織片，浸泡在含有10％血清(購自GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)中，置于冰上。(2)睪丸組織的切片：用手術刀片將睪丸組織片進一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，長度控制在5～10mm，寬度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分鐘內完成。預留部分組織切片不進行后續(xù)的凍存復蘇操作，用作為后續(xù)對照試驗的未凍存組織切片(以下簡稱“新鮮對照組”)。(3)睪丸組織的凍存與復蘇：隨機取出(2)中的睪丸組織切片3片，使用無菌紗布吸干凈多余水分。將組織切片浸入實施例1的凍存試劑1中，常溫10分鐘。組織切片取出后，繼續(xù)使用無菌紗布吸干凈多余水分，移入凍存試劑2中，常溫20分鐘。同樣的操作移入凍存試劑3中，常溫30分鐘。取出組織切片，放置于金屬銅網(wǎng)條上，使用無菌紗布吸干凈多余水分。立即投入事先準備好的無菌液氮中，5分鐘后即可將組織切片連同銅網(wǎng)條轉入事先預冷的凍存管中，液氮存儲。1周后，準備復蘇凍存組織，37℃水浴箱預熱實施例6的復蘇試劑1、復蘇試劑2。液氮中取出組織切片連同銅網(wǎng)條迅速置入復蘇試劑1中，輕搖，37℃2分鐘，可見組織切片從銅網(wǎng)條上脫落，將組織切片移入復蘇試劑2中，37℃5分鐘。然后依次將組織切片移入復蘇試劑3、復蘇試劑4中，室溫各10分鐘(簡稱為實施例1+6)。同樣的條件下進行實施例2+7、實施例3+8、實施例4+9、實施例5+10、對照A組、對照B組、對照C組、傳統(tǒng)對照組的實驗。(4)組織培養(yǎng)上清睪酮檢測及組織活性OD值：將(3)中各實施例、對照組以及(2)中的新鮮對照組的組織切片分別置入細胞培養(yǎng)6孔板1個孔中培養(yǎng)，2ml10％DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。收取500ul上清，使用睪酮ELISA檢測試劑盒(購自CAYMAN)檢測睪丸組織睪酮分泌量。組織切片剪成1mmX2mmX2mm大小，置入96孔板1個孔中，加入100ul10％DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10ul增強型CCK-8溶液(購自碧云天)，37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。使用多功能酶標儀，選取450nm波長，讀取OD值。各實驗分別重復三次，取平均值作為實驗結果，實驗結果如表4所示，表4反映凍存1周后復蘇組織睪酮分泌功能情況以及短期凍存復蘇后組織活性OD值。無論上清睪酮分泌情況還是組織活性OD值，實施例凍存復蘇后的結果都接近新鮮對照組，并且各實施例結果均優(yōu)于對照A組、對照B組、對照C組以及傳統(tǒng)對照組，說明本發(fā)明的枸杞多糖、膽固醇、維生素E協(xié)同作用，對凍存復蘇活率的提高具有顯著效果。表4：凍存、復蘇試劑的短期效果注：實施例1+6表示實施例1的凍存試劑+實施例6的復蘇試劑組合使用，下同。此外，本發(fā)明采用同樣的方法收集6～8月齡寵物貓進行絕育手術時切除下來的睪丸組織，進行了上述(1)-(4)的凍存和復蘇試驗，冷凍試劑為實施例5，復蘇試劑為實施例10，結果顯示睪酮分泌量位12.1nmol/L，組織活性OD值為1.61。2.寵物睪丸組織凍存、復蘇試劑的長期效果驗證(1)睪丸組織的獲?。涸趯櫸镏?、寵物醫(yī)生知情同意的情況下，分別收集6～8月齡寵物狗進行絕育手術時切除下來的睪丸組織。20分鐘內，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的組織片，浸泡在含有10％血清(購自GIBCO)的DMEM培養(yǎng)基(購自GIBCO)中，置于冰上。(2)睪丸組織的切片：用手術刀片將睪丸組織片進一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，長度控制在5～10mm，寬度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分鐘內完成。(3)睪丸組織的凍存與復蘇：取出(2)中的睪丸組織切片18片，隨機分成6組，每組3片，使用無菌紗布吸干凈多余水分。取5組組織切片分別浸入5組實施例的凍存試劑1中，常溫10分鐘。組織切片取出后，繼續(xù)使用無菌紗布吸干凈多余水分，移入凍存試劑2中，常溫20分鐘。同樣的操作移入凍存試劑3中，常溫30分鐘。取出組織切片，放置于金屬銅網(wǎng)條上，使用無菌紗布吸干凈多余水分。立即投入事先準備好的無菌液氮中，5分鐘后即可將組織切片連同銅網(wǎng)條轉入事先預冷的凍存管中，液氮存儲。設置不同的時間點復蘇組織，時間點設置為0.5年、1年、2年、3年。準備復蘇凍存組織時，37℃水浴箱預熱復蘇試劑1、復蘇試劑2。液氮中取出組織片連同銅網(wǎng)條迅速置入復蘇試劑1中，輕搖，37℃2分鐘，可見組織切片從銅網(wǎng)條上脫落，將組織片切移入復蘇試劑2中，37℃5分鐘。然后依次將組織切片移入復蘇試劑3、復蘇試劑4中，室溫各10分鐘。取1組組織切片進行傳統(tǒng)對照組的試驗，采用文獻試劑和方法凍存，簡述如下：凍存試劑包括95％DMEM培養(yǎng)基，5％DMSO；復蘇試劑為DMEM培養(yǎng)基，具體操作步驟見文獻(于潔,萬匯涓,尹美珺,等.冷凍保存未成熟睪丸組織移植后生精細胞的生長發(fā)育[J].中國男科學雜志,2008,22(12):15-18.)。(4)組織培養(yǎng)上清睪酮檢測及組織活性OD值：將各實施例和傳統(tǒng)對照組的組織切片分別置入細胞培養(yǎng)6孔板1個孔中培養(yǎng)，2ml10％DMEM培養(yǎng)基，37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。收取500ul上清，使用睪酮ELISA檢測試劑盒(購自CAYMAN)檢測睪丸組織睪酮分泌量。組織切片剪成1mm×2mm×2mm大小，置入96孔板1個孔中加入100ul10％DMEM培養(yǎng)基，每孔加入10ul增強型CCK-8溶液(購自碧云天)，37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1小時。使用多功能酶標儀，選取450nm波長，讀取OD值。每個時間點隨機設置3個組織樣品。實驗結果如表5所示，表5反映凍存0.5、1、2、3年后復蘇組織睪酮分泌功能情況以及長期凍存復蘇后組織活性OD值。由表5可知本發(fā)明實驗組效果在長期保存條件下遠優(yōu)于傳統(tǒng)對照組，組織存儲于液氮后保存效果較為穩(wěn)定。表5：凍存、復蘇試劑的長期效果以上已對本發(fā)明創(chuàng)造的較佳實施例進行了具體說明，但本發(fā)明創(chuàng)造并不限于所述實施例，熟悉本領域的技術人員在不違背本發(fā)明創(chuàng)造精神的前提下還可作出種種的等同的變型或替換，這些等同的變型或替換均包含在本申請權利要求所限定的范圍內。當前第1頁1 2 3