本發(fā)明涉及植物種質資源保存領域，具體地說，種越橘植物種質的超低溫保存方法和超低溫保存越橘植物種質恢復培養(yǎng)的方法。

背景技術：

越橘屬于杜鵑花科( Ericaceae )越橘屬( Vaccinium spp .)植物，為多年生落葉或常綠灌木或小灌木樹種。全世界越橘屬植物約有400個種，我國約有91個種、28個變種，分布于我國東北和西南地區(qū)。果實富含花色苷等抗氧化物質，具有改善視力、抗氧化、抗癌及延緩腦神經(jīng)衰老等保健功能，被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一，同時也被譽為“漿果之王”。

種質資源保存是越橘育種和保持遺傳多樣性的重要保證，培育高產(chǎn)、優(yōu)質和高抗新品種離不開豐富的種質資源，因此開展越橘種質資源的保存具有重要的意義。

目前有關越橘種質資源的保存方法的研究較少，主要集中在原地栽培、遷地栽培以及種子庫保存，但原地和遷地栽培管理和取材需要大量的人力、物力，且保存的種質資源占地面積大，易受到病蟲害和自然條件的影響。隨著生物技術的發(fā)展，基于利用植物組織培養(yǎng)技術對越橘種質資源進行保存的研究僅局限于在實驗室中對研究材料的保存。一方面保存過程繁瑣、費時費力，成本較高；另一方面，隨著保存時間的延長和繼代次數(shù)的增加，保存的材料易受到污染的干擾。

超低溫保存技術是20世紀70年代在低溫保存的基礎上發(fā)展起來的一門新興技術。超低溫保存通常以液氮( -196℃)為冷源，生物材料保存在如此低溫條件下，活細胞內(nèi)的代謝活動幾乎完全停止，因而可使生物材料在該溫度下不會發(fā)生遺傳性狀的改變，且保存過程中細胞的活力及形態(tài)發(fā)生的全能性不受影響。因其具有操作簡單，可保存時間長，占用空間小且不受病蟲害的干擾等優(yōu)點，是目前公認的長期而穩(wěn)定的保存植物種質資源的理想方法?，F(xiàn)已開發(fā)出多種超低溫保存的方法，然而針對不同物種甚至對于同一物種的不同品種，其適宜的超低溫保存方法及程序技術都有可能不同。目前有關利用超低溫保存技術對越橘種質資源進行保存的研究尚未見報道。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對越橘現(xiàn)有保存技術中的不足，提供了越橘莖尖小滴玻璃化超低溫保存的方法和超低溫保存越橘植物種質恢復培養(yǎng)的方法。

越橘植物種質的超低溫保存方法，它包括

1）煉苗：選取4周苗齡的組培苗，取0.4-0.6 cm帶有頂芽的莖段接種到WPM培養(yǎng)基上4℃暗處理2—4周；

2）越橘莖尖剝?nèi)。涸跓o菌條件下，在體視顯微鏡下剝?nèi)捗绾蟮捻斞?，莖尖長為1.5—2.0mm；

3）預培養(yǎng)：將剝?nèi)〉那o尖接種于添加有0.3M蔗糖的WPM固體培養(yǎng)上，于組培室黑暗培養(yǎng)18—30h；

4）裝載：將預培養(yǎng)后的離體莖尖轉接于裝載液中，于室溫下裝載處理20-40min；

5）玻璃化處理：將裝載處理后的莖尖轉接于PVS2溶液中，于0℃處理30-50min；

6）小液滴制作：將PVS2處理后的莖尖轉移到鋁箔條上 ,并向每個莖尖滴加6μL PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中，每個錫箔條上放9-11個莖尖；

7）超低溫冷凍保存：將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進行冷凍，然后將冷凍后的錫箔條置于冷凍離心管中，蓋緊蓋子后，投入液氮中保存；

步驟1) 所述的的煉苗時間為3周，步驟3)所述的預培養(yǎng)時間為24h時；

步驟4）中所述的裝載液的組成為：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖，裝載時間為30min；

步驟5）中所述的PVS2溶液的組成為：WPM+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亞砜+0.4M蔗糖。處理時間為40min時；

超低溫保存越橘植物種質恢復培養(yǎng)的方法

1） 卸載：將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，放置于卸載液中進行解凍和卸載；

2）恢復培養(yǎng)：將卸載處理后的離體莖尖用無菌濾紙吸干表面殘留液，轉接于恢復培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)。

超低溫保存越橘植物種質恢復培養(yǎng)的方法，它包括的：

步驟1）所述的卸載液的組分為：WPM+1.2M蔗糖； 所述的卸載條件為：室溫下卸載20min。

步驟2）所述的恢復培養(yǎng)基為WPM+0-0.5mg/L ZT +3％蔗糖+0.7％瓊脂，pH＝5.8； 恢復培養(yǎng)條件為：組培室黑暗培養(yǎng) 1d ,最后轉至正常光照條件下進行培養(yǎng)。

本發(fā)明提供了越橘莖尖小滴玻璃化超低溫保存的方法，是一種長期安全、穩(wěn)定可靠、簡單有效的保存越橘優(yōu)良種質資源的方法，本發(fā)明以頂芽莖尖為超低溫保存材料，一方面取材方便，另一方面由于莖尖含有莖尖分生組織，細胞再生能力較強，遺傳穩(wěn)定性高；超低溫保存后越橘莖尖成活率高達100％，莖尖再生率為91.7％。

附圖說明

圖1 煉苗時間對越橘莖尖超低溫保存的影響。

圖2 加載時間對越橘莖尖超低溫保存的影響。

圖3 預培養(yǎng)時間對越橘莖尖超低溫保存的影響。

圖4 玻璃化處理時間對越橘莖尖超低溫保存的影響。

圖5 ZT濃度對越橘莖尖超低溫保存的影響。

具體實施方式

實施例1 越橘莖尖小滴玻璃化法超低溫保存技術及植株再生培養(yǎng)方法

實驗方法具體操作如下：

1、練苗：選取4周苗齡的組培苗，取0.5 cm帶有頂芽的莖段接種到WPM培養(yǎng)基上4℃暗處理3周;

2、越橘莖尖剝?nèi)。涸跓o菌條件下，在體視顯微鏡下剝?nèi)捗绾蟮捻斞?，莖尖長為1.5—2.0mm;

3、預培養(yǎng)： 將剝?nèi)〉那o尖接種于添加有0.3M蔗糖的WPM固體培養(yǎng)上，于組培室黑暗培養(yǎng)24h;

4、 裝載：將預培養(yǎng)后的離體莖尖轉接于組成為：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖的裝載液中，于室溫下裝載處理30min;

5、玻璃化處理：將裝載處理后的莖尖轉接于組成為：WPM+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亞砜+0.4M蔗糖的PVS2溶液中，于0℃處理40min;

6、小液滴制作：將PVS2處理后的莖尖轉移到鋁箔條上 ,并向每個莖尖滴加6μL PVS2溶液，使莖尖完全包裹于PVS2小液滴中，每個錫箔條上放10個莖尖;

7、超低溫冷凍保存：將上述制作好的含有小液滴的錫箔條直接浸入液氮中進行冷凍，然后將冷凍后的錫箔條置于2ml冷凍離心管中，蓋緊蓋子后，投入液氮中保存;

8、卸載：將超低溫冷凍保存的離體莖尖取出，放置于組分為：WPM+1.2M蔗糖的卸載液中進行解凍和卸載，室溫下卸載20min;

9、恢復培養(yǎng)：將卸載處理后的離體莖尖用無菌濾紙吸干表面殘留液，轉接于恢復培養(yǎng)基中進行恢復培養(yǎng)；所述的恢復培養(yǎng)基為WPM+0.3mg/L ZT +3％蔗糖+0.7％瓊脂，pH＝5 .8；其中恢復培養(yǎng)條件為：組培室黑暗培養(yǎng) 1d ,最后轉至正常光照條件下進行培養(yǎng)?；謴团囵B(yǎng)7d后，成活的莖尖表現(xiàn)為綠色，而死亡的莖尖表現(xiàn)為褐色；培養(yǎng)30d后，成活的莖尖形成完整植株。

實施例2 煉苗時間和加載時間對越橘莖尖超低溫保存的影響

操作步驟同實施例1，只改變煉苗時間，將煉苗時間設定為0、1、2、3、4、5周，加載時間為0、10、20、30、40min?；謴团囵B(yǎng)7d后統(tǒng)計越橘莖尖的成活率和30d統(tǒng)計再生情況。結果表明煉苗時間和加載時間對越橘莖尖保存后的成活率和再生率均有重要的影響。莖尖的成活率和再生率隨著煉苗時間的變化呈現(xiàn)先升后降的趨勢，如圖1所示，隨著加載時間的變化基本呈先升后降的趨勢，如圖2所示。煉苗時間為3周時，莖尖的成活和再生效果較好，加載時間為30min時，莖尖的成活和再生效果較好。

實施例3 預培養(yǎng)時間和玻璃化處理時間對越橘莖尖超低溫保存的影響

操作步驟同實施例1，只改變預培養(yǎng)時間，將剝下的越橘莖尖接種含有0.3 M蔗糖的WPM固體培養(yǎng)基中，于組培室黑暗預培養(yǎng)0-48h，玻璃化處理時間設定為0、20、40、60、80min?；謴团囵B(yǎng)7d后統(tǒng)計越橘莖尖的成活率和30d統(tǒng)計再生情況。結果表明預培養(yǎng)時間和玻璃化處理時間對越橘莖尖保存后的成活率和再生率均有重要的影響。莖尖的成活率和再生率隨著預培養(yǎng)時間的變化基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢，如圖3所示，隨玻璃化處理時間的變化呈先上升后下降再上升的趨勢，如圖4所示。預培養(yǎng)時間為24h時，莖尖的成活和再生效果較好，玻璃化處理時間為40min時，莖尖的成活和再生較好。

實施例4 再生培養(yǎng)基中不同濃度的ZT（玉米素）對越橘莖尖超低溫保存的影響

操作步驟同實施例1，只改變ZT濃度，選取ZT濃度為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L?；謴团囵B(yǎng)7d后統(tǒng)計越橘莖尖的成活率和30d統(tǒng)計再生情況。結果表明ZT濃度對越橘莖尖保存后的成活率和再生率均有重要的影響。莖尖的成活率呈先降后升再降的趨勢，再生率隨著ZT濃度變化基本呈現(xiàn)先升后降的趨勢，如圖5所示，ZT濃度為0.3mg/L時，莖尖的成活和再生效果較好。