本發(fā)明屬于畜牧業(yè)養(yǎng)殖技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種牛冷凍精液稀釋液制備方法。

背景技術(shù)：

牛冷凍精液與人工授精技術(shù)在我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用，因此牛冷凍精液的生產(chǎn)與質(zhì)量控制一直受到行業(yè)內(nèi)的關(guān)注。

實(shí)踐證明，冷凍精液生產(chǎn)是各地種公牛站的核心業(yè)務(wù)，該生產(chǎn)流程體系應(yīng)該建立在標(biāo)準(zhǔn)化作業(yè)程序的基礎(chǔ)上，包括生產(chǎn)牛冷凍精液的器械清洗與消毒、稀釋液配制、采精、精液處理、精液冷凍、凍精解凍、凍精鏡檢和檢驗(yàn)規(guī)則、凍精包裝、凍精貯存及凍精運(yùn)輸?shù)炔僮鳝h(huán)節(jié)。

目前大部分種公牛站以進(jìn)口稀釋粉取代自配精液稀釋液，進(jìn)口稀釋粉在某種程度上取得了較好效果，但從長(zhǎng)遠(yuǎn)考慮這增加了牛冷凍精液的生產(chǎn)成本，降低了經(jīng)濟(jì)效益，同時(shí)也反映出牛冷凍精液稀釋液配方的缺陷。

眾觀各地種公牛站冷凍精液稀釋液，不論是自配的或是進(jìn)口的，其中均包括稀釋劑、營(yíng)養(yǎng)劑、保護(hù)劑和其他添加劑等。目前，牛冷凍精液稀釋液多數(shù)為葡萄糖-甘油-卵黃液，但稀釋劑、營(yíng)養(yǎng)劑、保護(hù)劑又有可選的不同化學(xué)物質(zhì)和劑量組合，大部分種公牛站反映進(jìn)口稀釋液比自配稀釋液稀釋效果好。

牛細(xì)管凍精質(zhì)量高低與假陰道安裝調(diào)試、種公牛準(zhǔn)備與調(diào)教、采精人員技術(shù)水平、采精操作的規(guī)范性、精液品質(zhì)評(píng)價(jià)與稀釋倍數(shù)計(jì)算、稀釋液配方與配制、精液稀釋過程的規(guī)范性、稀釋精液冷凍過程等多項(xiàng)因素有關(guān)。各環(huán)節(jié)操作人員大部分進(jìn)過職業(yè)技能培訓(xùn)，規(guī)范性較強(qiáng)，最大的區(qū)別是精液稀釋液不同，導(dǎo)致稀釋后精子活力偏低。

首先，目前牛細(xì)管凍精稀釋液營(yíng)養(yǎng)劑選擇葡萄糖、蔗糖存在不足，從有利于精子代謝吸收的角度考慮，應(yīng)選擇果糖，因?yàn)楣墙Y(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，在同等條件下更有利于精子代謝吸收，滿足精子營(yíng)養(yǎng)需求；其次，作為維持精子內(nèi)外環(huán)境滲透壓平衡的檸檬酸鈉，其用量把握不精準(zhǔn)，不能維持溶液的等滲性，引起精子變形；第三，青鏈霉素作為抗菌物質(zhì)，原本是為了提高精子抗污染能力，但用量失控尤其偏多時(shí)反而會(huì)殺死精子或降低精子活力；第四，雞蛋新鮮度和消毒把控不嚴(yán)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低；第五，抗凍物質(zhì)甘油用量不合理，未能達(dá)到相應(yīng)的抗凍效果，超量時(shí)反而降低了精子對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收量；第六，牛冷凍精液生產(chǎn)的操作細(xì)節(jié)缺乏規(guī)范性。

總之，稀釋液配方中各物質(zhì)用量搭配缺乏合理性，同時(shí)，有必要進(jìn)一步探索更科學(xué)的牛細(xì)管凍精生產(chǎn)工藝。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，提高優(yōu)秀種公牛新鮮精液稀釋效果和精子活率，達(dá)到冷凍精液長(zhǎng)期有效保存。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是，一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1：精液稀釋液配置；

按比例，準(zhǔn)確稱取果糖5～8g、檸檬酸鈉19.8～26.6 g，無損耗地移入1000 mL的燒杯內(nèi)，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75～80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180～220mL的新鮮卵黃，以及再加入青霉素、鏈霉素各40～50萬IU單位，按此比例配置的溶液稱為第一液；

取第一液430 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓湃?℃～5℃的冰箱或生化培養(yǎng)箱內(nèi)待用，按此比例配置的溶液稱之為第二液；

步驟2：精液稀釋；

用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0～5℃低溫柜內(nèi)降溫，與此同時(shí)把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當(dāng)降溫至10℃時(shí)加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低溫柜中進(jìn)行細(xì)管分裝，分裝后的細(xì)管即可進(jìn)行冷凍；

步驟3：精液冷凍；

將平衡、封裝后的細(xì)管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架碼放，碼放在平衡架上，超聲波封口端遠(yuǎn)離操作者，細(xì)管放入冷凍儀時(shí)也應(yīng)如此放置；每個(gè)平衡架上放一根細(xì)管的標(biāo)記物，為了便于識(shí)別，一頭種公牛用同一顏色的標(biāo)記物；如果同一個(gè)平衡架上有不同種公牛的細(xì)管精液，須分開碼放，且要隔開一些距離，以免混淆；

在細(xì)管凍精生產(chǎn)過程中，使用由計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)冷凍儀，首先在電腦中設(shè)置好最佳冷凍溫度曲線，冷凍儀與低溫柜應(yīng)盡量靠近，開啟液氮罐閥門把冷凍儀降溫至4℃，關(guān)閉風(fēng)扇電源，待風(fēng)扇完全停止后把已排滿待凍細(xì)管的平衡架迅速輕放人冷凍儀，蓋好蓋子，按預(yù)先設(shè)定的程序自動(dòng)完成冷凍過程；

步驟4：凍精解凍與抽檢；

預(yù)先把水浴箱水溫加熱至38～40℃，用鑷子夾取一支冷凍后的細(xì)管凍精迅速浸入38～40℃水中并輕輕晃動(dòng)，待溶解后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用細(xì)管專用剪剪去超聲波封口端，滴一小滴精液于經(jīng)過預(yù)熱的載玻片上即可進(jìn)行鏡檢，評(píng)價(jià)精子活率；

步驟5：凍精包裝；

在-140℃以下的環(huán)境中，用細(xì)管計(jì)數(shù)分裝機(jī)進(jìn)行包裝，包裝后的細(xì)管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置，塑料包裝管的內(nèi)徑應(yīng)均勻一致，不得用上口大、底部小的塑料管，包裝好的細(xì)管凍精人庫(kù)貯存。

進(jìn)一步的，所述步驟2中，細(xì)管分裝使用細(xì)管灌封一體機(jī)進(jìn)行。

進(jìn)一步的，還包括步驟6，凍精貯存；凍精貯存在液氮罐的液氮中，每周定時(shí)加一次液氮，當(dāng)發(fā)現(xiàn)液氮罐外殼出現(xiàn)白霜時(shí)，應(yīng)立即將精液轉(zhuǎn)移人其他液氮罐內(nèi)保存；包裝好的凍精液氮罐間轉(zhuǎn)換時(shí)，在液氮罐外停留時(shí)間不能超過3s；取存凍精后要蓋好液氮罐塞，在取放蓋塞時(shí)，要垂直輕拿輕放，不得用力過猛，防止液氮罐塞折斷或損壞；移動(dòng)液氮罐時(shí)，應(yīng)提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動(dòng)，不得在地上拖行。

進(jìn)一步的，還包括步驟7：凍精運(yùn)輸；凍精運(yùn)輸過程不得橫倒、碰撞和強(qiáng)烈振動(dòng)，保證凍精始終浸在液氮中。

進(jìn)一步的，所述步驟中，所加第一液的量=[（稀釋液總量+合格精液量）／2] -合格精液量；

稀釋液總量=原精液量×（稀釋倍數(shù)-1）；

稀釋倍數(shù)=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷凍后精子活力)/每頭份輸精量所含有效精子數(shù)/ 0.25；

所加第二液的量=（所加稀釋液總量一所加第一液的量）。

本發(fā)明的有益效果是：首先，篩選出了優(yōu)良的牛冷凍精液稀釋液種類，目前，牛冷凍精液稀釋液有卵黃—磷酸鹽稀釋液、果糖—卵黃—檸檬酸鹽—甘油稀釋液、卵黃—Tris稀釋液和全脂均質(zhì)乳和脫脂乳等幾種，經(jīng)過大量試驗(yàn)研究，結(jié)果表明：在原精液品質(zhì)合格和操作規(guī)范的前提下，果糖—卵黃—檸檬酸鈉—甘油稀釋液的稀釋效果最好；第二，優(yōu)化了稀釋液中所用化學(xué)物質(zhì)的配比，縱觀牛冷凍精液稀釋液配方，所用的基本化學(xué)物質(zhì)大同小異，但各物質(zhì)配比各不相同，本發(fā)明研究出了果糖、檸檬酸鈉、卵黃、青鏈霉素、甘油等的最佳配方，提高了合格精液的稀釋效果；第三，進(jìn)一步規(guī)范了牛精液稀釋液配制、精液稀釋過程、稀釋精液的灌封、平衡降溫、冷凍、包裝、貯存和運(yùn)輸?shù)燃夹g(shù)環(huán)節(jié)，為制定牛細(xì)管凍精生產(chǎn)規(guī)程提供了理論依據(jù)與技術(shù)支撐。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

一種牛冷凍精液稀釋液制備方法，在制備稀釋液之前具有以下要求：

制備蒸餾水：嚴(yán)格按照全自動(dòng)雙重純水蒸餾器的操作說明書制備雙蒸水，蒸餾水最好用干凈的玻璃器皿貯存。

天平放置在平穩(wěn)的工作臺(tái)上，保持清潔干燥，不使用時(shí)刀口應(yīng)處于空載狀態(tài)；稱取藥品時(shí)，盤內(nèi)墊以稱量紙，校零后方可稱重。砝碼要求保持清潔、干燥，防止受潮或污染。

配制稀釋液所用的化學(xué)藥品規(guī)格為分析純，且在保質(zhì)期內(nèi)，藥品取用后，應(yīng)立即將瓶口蓋嚴(yán)，并妥善保存；藥品一旦從瓶中取出，再不能放回藥品瓶而統(tǒng)一收集，妥善處理。

用于配制稀釋液的雞蛋應(yīng)來源于無疫病的雞場(chǎng)，且新鮮、完整、干凈，用75%酒精棉球?qū)Φ皻け砻孢M(jìn)行徹底消毒，等酒精揮發(fā)盡后用蛋清分離器取出完整的卵黃（也可在雞蛋腰正中線處敲開一裂紋，將雞蛋一分為二，利用兩個(gè)蛋殼交替傾倒，除去蛋清，留下卵黃），然后用滅菌的注射器穿過蛋黃膜抽取卵黃。

具體按照以下步驟進(jìn)行：

步驟1：精液稀釋液配置

按比例，準(zhǔn)確稱取果糖（分析純）5～8g、檸檬酸鈉19.8～26.6 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內(nèi)，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75～80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180～220mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各40～50萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；?、褚?30 mL加入65～75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓湃?℃～4℃的冰箱或生化培養(yǎng)箱內(nèi)待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時(shí)間不得超過24 h。

步驟2：精液稀釋

用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0～5℃低溫柜內(nèi)降溫，與此同時(shí)把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當(dāng)降溫至10℃時(shí)加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低溫柜中進(jìn)行細(xì)管分裝，分裝后的細(xì)管即可進(jìn)行冷凍；

所加第一液的量=[（稀釋液總量+合格精液量）／2] -合格精液量；

稀釋液總量=原精液量×（稀釋倍數(shù)-1）；

稀釋倍數(shù)=(原精液精子密度×原精液精子活力×冷凍后精子活力)/每頭份輸精量所含有效精子數(shù)/ 0.25；

所加第二液的量=（所加稀釋液總量一所加第一液的量）。

步驟3：精液冷凍

將平衡、封裝后的細(xì)管精液按棉塞封口端靠近操作者的方向上架碼放碼放在平衡架上，超聲波封口端遠(yuǎn)離操作者，細(xì)管放入冷凍儀時(shí)也應(yīng)如此放置。每個(gè)平衡架上放一根類似于細(xì)管的標(biāo)記物，為了便于識(shí)別，最好一頭種公牛用同一顏色的標(biāo)記物。如果同一個(gè)平衡架上有不同種公牛的細(xì)管精液，必須要分開碼放，且要隔開一些距離，以免混淆。

在細(xì)管凍精生產(chǎn)過程中，使用由計(jì)算機(jī)控制的全自動(dòng)冷凍儀，首先在電腦中設(shè)置好最佳冷凍溫度曲線，冷凍儀與低溫柜應(yīng)盡量靠近，開啟液氮罐閥門把冷凍儀降溫至4℃，關(guān)閉風(fēng)扇電源，待風(fēng)扇完全停止后把已排滿待凍細(xì)管的平衡架迅速輕放人冷凍儀，蓋好蓋子，按預(yù)先設(shè)定的程序自動(dòng)完成冷凍過程。

步驟4：凍精解凍與抽檢

預(yù)先把水浴箱水溫加熱至38～40℃，用鑷子夾取一支冷凍后的細(xì)管凍精迅速浸入38～40℃水中并輕輕晃動(dòng)，待溶解后立即取出，用吸水紙或紗布擦干水珠，再用細(xì)管專用剪剪去超聲波封口端，滴一小滴精液于經(jīng)過預(yù)熱的載玻片上即可進(jìn)行鏡檢，評(píng)價(jià)精子活率。

步驟5：凍精包裝

在-140℃以下的環(huán)境中，用細(xì)管計(jì)數(shù)分裝機(jī)進(jìn)行包裝，包裝后的細(xì)管其棉塞端在塑料管的底部，不得倒置。塑料包裝管的內(nèi)徑應(yīng)均勻一致，不得用上口大、底部小的塑料管。包裝好的細(xì)管凍精人庫(kù)貯存。

步驟6：凍精貯存

凍精貯存在液氮罐的液氮中，由專人保管，每周定時(shí)加一次液氮，應(yīng)經(jīng)常檢查液氮罐的狀況，當(dāng)發(fā)現(xiàn)液氮罐外殼出現(xiàn)白霜時(shí)，應(yīng)立即將精液轉(zhuǎn)移人其他液氮罐內(nèi)保存。包裝好的凍精液氮罐間轉(zhuǎn)換時(shí)，在液氮罐外停留時(shí)間不能超過3s。取存凍精后要蓋好液氮罐塞，在取放蓋塞時(shí)，要垂直輕拿輕放，不得用力過猛，防止液氮罐塞折斷或損壞。移動(dòng)液氮罐時(shí)，應(yīng)提握液氮罐手柄抬起罐體后再移動(dòng)，不得在地上拖行。

步驟7：凍精運(yùn)輸

凍精運(yùn)輸過程中要有專人看守，注意貯存容器不得橫倒、碰撞和強(qiáng)烈振動(dòng)，保證凍精始終浸在液氮中。

本文中，檸檬酸鈉作為緩沖物質(zhì)，防止精液處理過程中pH的變化，同時(shí)對(duì)代謝性酸中毒和酶活性反應(yīng)具有良好的緩沖作用。研究表明：稀釋液中添加19.8～26.6 g檸檬酸鈉復(fù)蘇后精子活力最高，環(huán)性精子活力最低。否則冷凍精液復(fù)蘇精子活力極低，降低母牛情期受胎率。

糖在稀釋液中具有營(yíng)養(yǎng)、增加稀釋液的滲透壓和在低溫環(huán)境中保護(hù)精子等多重作用，不同糖類及其用量對(duì)同種動(dòng)物精子冷凍保存效果不同，同種糖及其用量對(duì)不同動(dòng)物精子冷凍保存效果也不同，常用的糖類有葡萄糖、蔗糖、果糖等。研究認(rèn)為，果糖依其生物特性，作為供給牛精子能量的成分，更易利用，效果最好，選擇該用量能取代精子膜周圍的水分子與膜中磷酸基團(tuán)形成氫鍵，對(duì)精子膜結(jié)構(gòu)有穩(wěn)固和修復(fù)作用。

常用抗凍劑有EDTA、二甲基亞砜、低濃度甲醛（0.025%）和甘油。其中甘油作為精子超低溫冷凍過程中最好的抗凍保護(hù)劑，具有溶于水的特性，不易發(fā)生結(jié)晶，同時(shí)具有吸水性強(qiáng)和可降低水溶液冰點(diǎn)的特點(diǎn)。在配制精液稀釋液時(shí)，甘油用量控制在13%～14%為最好，低于13%抗凍效果很低，達(dá)到或超過18%會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生毒害作用。

卵黃具有保護(hù)精子免受冷休克的影響，能防止精子內(nèi)部液相轉(zhuǎn)變的作用，同時(shí)卵黃可通過促進(jìn)精子與卵細(xì)胞透明帶的結(jié)合而使頂體反應(yīng)率提高，在精液稀釋液中添加本文含量的卵黃，使母牛情期受胎率達(dá)75%以上。

在細(xì)管凍精生產(chǎn)中，用青霉素和鏈霉素來控制精液中病源性和非病源性疾病，它具有抗菌范圍廣、成本低等特點(diǎn)。按照此精液稀釋液配方中抗生素用量，通過重點(diǎn)控制性病和孤菌病來提高母牛情期受胎率。低于40萬IU單位時(shí)稀釋精液易受病原微生物污染，超過50萬IU單位時(shí)，抗生素本身對(duì)精子產(chǎn)生過高殺傷力，兩者均降低精子活力和母牛情期受胎率40%～70%。

總之，在牛精液稀釋液配方中，通過科學(xué)合理選擇稀釋劑、營(yíng)養(yǎng)劑、保護(hù)劑和其他添加劑及其用量的最佳組合，同時(shí)規(guī)范精液稀釋和細(xì)管凍精生產(chǎn)工藝的每一個(gè)細(xì)節(jié)。在規(guī)范操作的基礎(chǔ)上，能提高細(xì)管凍精解凍后活力10%～15%，維持母牛情期受胎率75%以上，同時(shí)對(duì)加速黃牛改良步伐和提高種公牛站生產(chǎn)凍精的經(jīng)濟(jì)效益及區(qū)域社會(huì)效益必將產(chǎn)生積極作用。

實(shí)施例1

按比例，準(zhǔn)確稱取果糖5 g、檸檬酸鈉26.6 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內(nèi)，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置75℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入180 mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各40萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；?、褚?30 mL加入65 mL甘油，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓湃?℃冰箱或生化培養(yǎng)箱內(nèi)待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時(shí)間不得超過24 h。

用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送0℃低溫柜內(nèi)降溫，與此同時(shí)把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當(dāng)降溫至10℃時(shí)加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低溫柜中進(jìn)行細(xì)管分裝，分裝后的細(xì)管即可進(jìn)行冷凍。

實(shí)施例2

按比例，準(zhǔn)確稱取果糖8g、檸檬酸鈉26.6 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內(nèi)，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置80℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入220 mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各50萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；取Ⅰ液430 mL加入75 mL甘油，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓湃?℃的冰箱或生化培養(yǎng)箱內(nèi)待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時(shí)間不得超過24 h。

用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送5℃低溫柜內(nèi)降溫，與此同時(shí)把第二液也放入；平衡2h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當(dāng)降溫至10℃時(shí)加入第二液，加入第二液后再平衡30min以上，才能在低溫柜中進(jìn)行細(xì)管分裝，分裝后的細(xì)管即可進(jìn)行冷凍。

實(shí)施例3

按比例，準(zhǔn)確稱取果糖6 g、檸檬酸鈉23 g無損耗地移入1000 mL的燒杯內(nèi)，加入蒸餾水800 mL，用消毒過的玻璃棒或磁力攪拌器攪拌，使果糖和檸檬酸鈉充分溶解，然后將溶液用濾紙過濾于三角燒瓶或鹽水瓶中，扎好或塞緊瓶口，置78℃水浴鍋中消毒30 min，冷卻至常溫后再加入200 mL的新鮮卵黃和青霉素、鏈霉素各45萬IU單位，此溶液稱為Ⅰ液；?、褚?30 mL加入70 mL甘油，并用磁力攪拌器充分?jǐn)嚢杈鶆蚝蠓湃?℃的冰箱或生化培養(yǎng)箱內(nèi)待用，該溶液稱之為Ⅱ液。值得注意的是，配制好的稀釋液放置時(shí)間不得超過24 h。

用35℃的第一液緩慢地加入原合格精液中，輕輕搖勻，用燒杯盛適量的35℃水，把稀釋管放入后送3℃低溫柜內(nèi)降溫，與此同時(shí)把第二液也放入；平衡2 h后水杯中加冰塊促使其快速降溫，當(dāng)降溫至10℃時(shí)加入第二液，加入第二液后再平衡30 min以上，才能在低溫柜中進(jìn)行細(xì)管分裝，分裝后的細(xì)管即可進(jìn)行冷凍。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非用于限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。