本發(fā)明屬于組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法。

背景技術：

沙生檉柳（Tama Tamarix jintaenia）屬楊柳科柳屬，為我國荒漠區(qū)特有物種，天然分布范圍小，僅分布于我國新疆塔里木盆地塔克拉瑪干沙漠及盆地東部的庫姆塔格沙漠，一直延伸到甘肅敦煌的西沿，生于遠離有水河床和湖盆周圍的流沙內部，同時沙生檉柳分布生境嚴酷，面臨著瀕危威脅，被列為國家珍惜瀕危植物名錄。沙生檉柳在我國干旱荒漠區(qū)的生態(tài)適應性極強，生態(tài)地位及其生態(tài)意義重大。但是，目前我國天然分布的沙生檉柳由于地下水位逐漸下降和流動沙丘間沙表土壤鹽分不斷增高，天然更新受到極大限制，實生苗正日趨減少，實施沙生檉柳引種栽培，為荒漠區(qū)防沙治沙植物選育及檉柳灌叢的恢復重建提供新材料，對研究亞洲中部荒漠植物區(qū)系特點和本屬的系統(tǒng)發(fā)育有科學意義。

植物組織培養(yǎng)是從植物體分離出符合需要的組織、器官或細胞、原生質體等的無性繁殖方法，即通過無菌操作，在人工控制條件下進行培養(yǎng)以獲得完整再生植株或生產(chǎn)具有經(jīng)濟價值的其他產(chǎn)品的繁殖技術。

在大多數(shù)苗木的繁殖過程中，傳統(tǒng)的有性繁殖也可以達到其生根快繁的目的，但在繁殖過程中易改變母本植物原有的優(yōu)良性狀，使其后代發(fā)生變異。

作為目前應用廣泛的無性繁殖方法，組織培養(yǎng)不受地理環(huán)境和季節(jié)條件的限制，能避免植物在生長過程中出現(xiàn)性狀分離；此外，該方法具有繁殖速率快、成本低、成活率高、成苗速度快等特點，解決了有性繁殖中出現(xiàn)的一系列問題，從而獲得大量無菌生根苗。因此，該方法可使沙生檉柳在較短時間內達到快速、高效繁殖的目的，創(chuàng)造出較高的經(jīng)濟效益。

沙生檉柳主要以無性繁殖為主，插穗成活、保存是扦插繁育的前提和基礎，了解掌握沙生檉柳無性繁殖特性，提高無性繁殖苗成活率和保存率，對沙生檉柳無性繁殖苗的生根機理研究顯得極有重要。組織培養(yǎng)方法是無性繁殖領域進行物種快速繁殖的重要方法，進年來在苗木、花卉、藥材快速繁殖方面已廣泛應用并已取得顯著效果，而利用組織培養(yǎng)快速生根的方法在沙生檉柳無性繁殖研究中木涉及。

技術實現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術中存在的問題，本發(fā)明提供了一種沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法，利用組織培養(yǎng)促進其生根的方法達到沙生檉柳快速繁殖的目的。

本發(fā)明提供一種沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法，包括以下步驟：

（1）外植體的選擇：選擇沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體；

（2）外植體前處理；

（3）外植體的滅菌及剪??；

（4）生根培養(yǎng)：生根培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-30 g/L；pH值為5.8-6.0；生根培養(yǎng)培養(yǎng)條件為：溫度24±2℃、光照強度1500-2000lx、光照時間10-14 h/d；所述MS基礎培養(yǎng)基中不含蔗糖，瓊脂濃度為5g/L。

作為優(yōu)選，步驟（2）中所述外植體前處理是選擇晴朗天氣的下午剪取沙生檉柳當年生枝條作為生根培養(yǎng)的外植體，在室內先將采集的外植體剪至10-15cm，之后用自來水沖洗表面的泥沙；然后用洗衣粉清洗枝條，將洗衣粉泡沫沖洗干凈后用玻璃棒蘸取一滴吐溫80進行深層清洗，之后將外植體置于流水下沖洗2-6小時。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述外植體的滅菌是將沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡10-15s，用無菌水沖洗3-4遍，再用0.1%的升汞浸泡3-6 min，根據(jù)老嫩程度不同，老枝條浸泡時間較長，為5-6 min；嫩枝條浸泡時間短，為3-4min，之后用無菌水沖洗5-7遍。

作為優(yōu)選，步驟（3）中所述外植體的剪取是將已滅菌的外植體基部切口剪除，用已滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，剪成長1-2cm長并帶芽的小段，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體。

作為優(yōu)選，步驟（4）中所述生根培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-20 g/L。

作為優(yōu)選，步驟（4）中所述生根培養(yǎng)培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15g/L。

本發(fā)明還提供一種沙生檉柳組織培養(yǎng)培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基的配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-30g/L。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基的配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15-20g/L。

作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)基的配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2g/L＋蔗糖15g/L。

本發(fā)明通過利用無性繁殖領域的組織培養(yǎng)方法，解決沙生檉柳生根難的問題，并提出最適合外植體生根的培養(yǎng)基配方。具體步驟主要包括外植體的選擇、外植體接種前處理、外植體的滅菌及剪取、生根培養(yǎng)基的配置及配方說明、接種后生根及根生長情況觀察。

本發(fā)明通過三個不同階段的培養(yǎng)，篩選并公開了適合沙生檉柳組培生根的具體培養(yǎng)基及其不同激素組合的培養(yǎng)基配方，即不同階段使用的基本培養(yǎng)基和種類，培養(yǎng)基附加的植物生長調節(jié)劑、蔗糖的濃度，培養(yǎng)基酸堿度（PH），外植體培養(yǎng)的外部環(huán)境條件，如光照、溫濕度等。

本發(fā)明利用組織培養(yǎng)的方法，通過三個階段的篩選確定了適合沙生檉柳組培生根的基本培養(yǎng)基配方與激素組合，突破了在沙生檉柳無性繁殖過程中單獨采用扦插繁殖的方法，大大提高了該樹種的繁殖速度和效果，對該屬植物其它品種及其扦插繁殖難以生根物種起到很好的參考與借鑒作用。

本發(fā)明采用的無性繁殖方法能保持原有品種的優(yōu)良性狀，所提出的最適合生根的培養(yǎng)基，可使沙生檉柳外植體較早生根、且出根時間整齊、出根量大、生根后幼苗粗壯、葉子嫩綠、長勢好；另外，本發(fā)明采用組織培養(yǎng)方法進行難生根樹種的無性繁殖，具有繁殖速度快、繁殖系數(shù)大、管理方便、生產(chǎn)成本低、成苗率高、培養(yǎng)周期短、可周年生產(chǎn)和有利于實現(xiàn)工廠化生產(chǎn)、不受季節(jié)的限制的特點和優(yōu)點，可為大規(guī)模工廠化生產(chǎn)提供有利條件。

另外，由于沙生檉柳根系發(fā)達，又具有良好的抗風蝕、沙埋能力及耐鹽堿性，因此，將該發(fā)明應用于生產(chǎn)實踐可為荒漠化綜合防治及荒漠區(qū)土地改良提供充足、優(yōu)質的種苗來源。

附圖說明

附圖用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發(fā)明的實施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構成對本發(fā)明的限制。在附圖中：

圖1-圖8分別為應用不同的組織培養(yǎng)基培養(yǎng)沙生檉柳的實驗結果。

具體實施方式

以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售。

一、本發(fā)明的一種沙生檉柳組織培養(yǎng)方法生根方法的實驗過程如下：

1、外植體的選擇：

適宜外植體的選擇是組織培養(yǎng)的基礎，本發(fā)明選擇沙生檉柳當年生枝條作為生根培養(yǎng)的外植體，研究其組培生根情況。

2、外植體前處理：

?選擇晴朗天氣的下午剪取沙生檉柳當年生枝條作為生根培養(yǎng)的外植體；

?室內先將采集的外植體剪至10-15cm，之后用自來水沖洗表面的泥沙；

?先用洗衣粉清洗枝條，將洗衣粉泡沫沖洗干凈后用玻璃棒蘸取一滴吐溫80進行深層清洗，之后將外植體置于流水下沖洗2-6小時。

3、外植體的滅菌及剪?。?/p>

?外植體的滅菌：將沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡15s，用無菌水沖洗3-4遍，再用0.1%的升汞浸泡3-6 min（根據(jù)老嫩程度不同，老枝條浸泡時間較長，一般為5-6 min；嫩枝條浸泡時間短，一般為3-4min），之后用無菌水沖洗5-7遍；

?滅菌后外植體的剪取：將已滅菌的外植體基部切口剪除，用已滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，剪成長1-2cm長并帶芽的小段，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體。

4、生根培養(yǎng)：

本發(fā)明中沙生檉柳的生根培養(yǎng)以MS為基礎培養(yǎng)基（其中大量元素、微量元素、鐵鹽、有機母液含量均沒有變化，不含蔗糖，瓊脂濃度為5g/L），并配以不同濃度的吲哚丁酸（IBA）、蔗糖、活性炭（AC），具體實驗過程分為三個階段，各階段培養(yǎng)基及其配方如下：

第一階段：篩選適用于沙生檉柳生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基及最佳生長激素濃度：

1： MS基礎培養(yǎng)基；

2：MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.1 g/L＋蔗糖30 g/L；

3：MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L；

4：MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.3 g/L＋蔗糖30 g/L；

5：MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.4 g/L＋蔗糖30 g/L；

6：MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.5 g/L＋蔗糖30 g/L；

7：1/2MS基礎培養(yǎng)基；

8：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.1 g/L＋蔗糖30 g/L；

9：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L；

10：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.3 g/L＋蔗糖30 g/L；

11：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.4 g/L＋蔗糖30 g/L；

12：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA0.5 g/L＋蔗糖30 g/L；

第二階段：在第一階段篩選出的最佳激素濃度的基礎上調整蔗糖的濃度進一步篩選最佳激素組合的培養(yǎng)基配方：

S1：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖0 g/L；

S2：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖5 g/L；

S3：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖10 g/L；

S4：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖15 g/L；

S5：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖20 g/L；

S6：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖25 g/L；

S7：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L；

S8：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖35 g/L。

第三階段：在第二階段篩選出的最佳培養(yǎng)基中加入不同濃度的活性炭（AC）。

5、接種后生根情況：

接種后分別調查已接種外植體的生根情況，主要包括第一次發(fā)根時間、根長、根的數(shù)量、根系及植株生長情況。

6、培養(yǎng)條件設置：溫度24±2℃、光照強度1500-2000lx、光照時間10-14 h/d 。

以上每個培養(yǎng)階段使用的基本培養(yǎng)基均為MS基礎培養(yǎng)基，附加不同種類、不同濃度的植物生長調節(jié)劑、蔗糖、活性炭，培養(yǎng)基pH均為5.8-6.0。

二、本發(fā)明的一種沙生檉柳組織培養(yǎng)方法生根方法的實驗結果為：

本發(fā)明首先選擇沙生檉柳枝條作為組培生根外植體，將其滅菌后剪成長約1.5-2cm的小段，接種于第一階段的生根培養(yǎng)基中進行組織培養(yǎng)生根培養(yǎng)基的篩選，培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，并附加不同濃度的IBA、蔗糖，結果如表1所示。

表1 第一階段培養(yǎng)

由表1可以看出，第一階段篩選出沙生檉柳生根時間最早且植株長勢最好的培養(yǎng)基為9號培養(yǎng)基：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2＋蔗糖30 g，從而可以確定適合沙生檉柳外植體外植體生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基為1/2MS基礎培養(yǎng)基，激素濃度為IBA 0.2mg/l，并以此為基礎進行第二階段的培養(yǎng)。第二階段的實驗結果如表2所示。

表2 第二階段培養(yǎng)

研究表明，蔗糖除起著能源的作用之外，還具有調節(jié)培養(yǎng)組織木質部分分化的作用，并隨著與生長激素組合的蔗糖濃度的改變，愈傷組織中木質部和韌皮部的相對含量發(fā)生了很大的變化；生長激素IBA具有刺激形成層細胞分裂、刺激枝的細胞伸長和根細胞生長、促進木質部、韌皮部細胞分化，促進插條發(fā)根、調節(jié)愈傷組織的形態(tài)建成的作用，主要用于大多數(shù)木本植物的扦插升生根繁殖，而組織培養(yǎng)中較低濃度的IBA對外植體生根作用較好。因此第二階段培養(yǎng)中仍以MS為基本培養(yǎng)基，以第一階段培養(yǎng)過程中生根良好的9號培養(yǎng)基為第二階段生根培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基，即以IBA 0.2mg/l為基礎，調整培養(yǎng)基中蔗糖的含量。結果發(fā)現(xiàn)當蔗糖濃度為15mg/l時，沙生檉柳生根效果最好，主要表現(xiàn)為第一次生根時間較早，主根發(fā)達，根毛較多，根上部植株長勢良好，顏色嫩綠，其生根率為88.3%。

在第三階段，在培養(yǎng)基中加入不同濃度活性炭后，培養(yǎng)基呈現(xiàn)黑色，生根效果均不明顯，故最終選擇不在培養(yǎng)基中加入活性炭。即S4培養(yǎng)基配方為最優(yōu)的培養(yǎng)基配方。

采用上述沙生檉柳生根培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法后，沙生檉柳的生根時間縮短至15-21天，一月后，苗木生長加快。

實施例1

本發(fā)明的沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法具體步驟如下：

1、外植體的選擇：

適宜外植體的選擇是組織培養(yǎng)的基礎，本發(fā)明選擇沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體，研究其組培生根情況。

2、外植體前處理：

選擇晴朗天氣的下午剪取沙生檉柳當年生枝條作為生根培養(yǎng)的外植體；

?室內先用將采集的外植體剪至12cm，之后用自來水沖洗表面的泥沙；

?先用洗衣粉清洗枝條，將洗衣粉泡沫沖洗干凈后用玻璃棒蘸取一滴吐溫80進行深層清洗，之后將外植體置于流水下沖洗4小時。

3、外植體的滅菌及剪?。?/p>

?外植體的滅菌：將沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡12s，用無菌水沖洗3遍，再用0.1%的升汞浸泡4min，之后用無菌水沖洗6遍；

?滅菌后外植體的剪取：將已滅菌的外植體基部切口剪除，用已滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，剪成長1.cm長并帶芽的小段，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體。

4、生根培養(yǎng)：

生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖15 g/L，pH值為5.9；培養(yǎng)條件為：溫度24℃、光照強度1800lx、光照時間12h/d ；其中MS基礎培養(yǎng)基中不含蔗糖，瓊脂濃度為5g/L。

實施例2

本發(fā)明的沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法具體步驟如下：

1、外植體的選擇：

適宜外植體的選擇是組織培養(yǎng)的基礎，本發(fā)明選擇沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體，研究其組培生根情況。

2、外植體前處理：

?選擇晴朗天氣的下午剪取沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體；

?室內先用將采集的外植體剪至10cm，之后用自來水沖洗表面的泥沙；

?先用洗衣粉清洗枝條，將洗衣粉泡沫沖洗干凈后用玻璃棒蘸取一滴吐溫80進行深層清洗，之后將外植體置于流水下沖洗6小時。

3、外植體的滅菌及剪?。?/p>

?外植體的滅菌：將沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡10s，用無菌水沖洗3遍，再用0.1%的升汞浸泡6 min，之后用無菌水沖洗7遍；

?滅菌后外植體的剪?。簩⒁褱缇耐庵搀w基部切口剪除，用已滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，剪成長2cm長并帶芽的小段，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體。

4、生根培養(yǎng)：

生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖20 g/L，pH值為5.8；培養(yǎng)條件為：溫度22℃、光照強度1500lx、光照時間14h/d ；其中MS基礎培養(yǎng)基中不含蔗糖，瓊脂濃度為5g/L。

實施例3

本發(fā)明的沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法具體步驟如下：

1、外植體的選擇：

適宜外植體的選擇是組織培養(yǎng)的基礎，本發(fā)明選擇沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體，研究其組培生根情況。

2、外植體前處理：

?選擇晴朗天氣的下午剪取沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體；

?室內先用將采集的外植體剪至15cm，之后用自來水沖洗表面的泥沙；

?先用洗衣粉清洗枝條，將洗衣粉泡沫沖洗干凈后用玻璃棒蘸取一滴吐溫80進行深層清洗，之后將外植體置于流水下沖洗2小時。

3、外植體的滅菌及剪?。?/p>

?外植體的滅菌：將沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡15s，用無菌水沖洗4遍，再用0.1%的升汞浸泡3min，之后用無菌水沖洗5遍；

?滅菌后外植體的剪?。簩⒁褱缇耐庵搀w基部切口剪除，用已滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，剪成長1cm長并帶芽的小段，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體。

4、生根培養(yǎng)：

生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖25 g/L，pH值為6.0；培養(yǎng)條件為：溫度26℃、光照強度2000lx、光照時間10h/d ；其中MS基礎培養(yǎng)基中不含蔗糖，瓊脂濃度為5g/L。

實施例4

本發(fā)明的沙生檉柳組織培養(yǎng)生根方法具體步驟如下：

1、外植體的選擇：

適宜外植體的選擇是組織培養(yǎng)的基礎，本發(fā)明選擇沙生檉柳當年生嫩枝作為生根培養(yǎng)的外植體，研究其組培生根情況。

?選擇晴朗天氣的下午剪取沙生檉柳當年生枝條作為生根培養(yǎng)的外植體；

?室內先用將采集的外植體剪至12cm，之后用自來水沖洗表面的泥沙；

?先用洗衣粉清洗枝條，將洗衣粉泡沫沖洗干凈后用玻璃棒蘸取一滴吐溫80進行深層清洗，之后將外植體置于流水下沖洗4小時。

3、外植體的滅菌及剪取：

?外植體的滅菌：將沖洗干凈的外植體置于超凈工作臺上，先用75%的乙醇浸泡12s，用無菌水沖洗3遍，再用0.1%的升汞浸泡4min，之后用無菌水沖洗6遍；

?滅菌后外植體的剪?。簩⒁褱缇耐庵搀w基部切口剪除，用已滅菌的濾紙吸干外植體表面的水分，剪成長1.cm長并帶芽的小段，接種于生根培養(yǎng)基中，每瓶接種一個外植體。

4、生根培養(yǎng)：

生根培養(yǎng)基配方為：1/2MS基礎培養(yǎng)基＋IBA 0.2 g/L＋蔗糖30 g/L，pH值為5.9；培養(yǎng)條件為：溫度23℃、光照強度1900lx、光照時間11h/d ；其中MS基礎培養(yǎng)基中不含蔗糖，瓊脂濃度為5g/L。

最后應說明的是：以上所述僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，對于本領域的技術人員來說，其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換。凡在本發(fā)明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。