本發(fā)明屬于植物組織培養(yǎng)技術領域，具體涉及一種茄子花藥培養(yǎng)直接獲得植株的方法和培養(yǎng)基。

背景技術：

花藥培養(yǎng)是獲得單倍體植株的重要途徑，通過該技術可以快速獲得純合二倍體，具有縮短育種周期、提高選擇效率、克服遠緣雜種的不育性等優(yōu)勢，還可以作為分子標記和遺傳圖譜繪制研究的良好材料。

由花藥培養(yǎng)或游離小孢子培養(yǎng)獲得茄子單倍體植株主要有三種途徑：1、先脫分化形成愈傷組織，再誘導愈傷組織分化形成胚狀體，最后由胚狀體發(fā)育成完整植株；2、由誘導形成的愈傷組織直接分化出不定芽，不定芽再發(fā)育為完整的植株；3、直接獲得胚狀體，發(fā)育成完整植株。

茄子花藥培養(yǎng)研究開展較早，自從Raina和Iyer等于1973年首次報道通過花藥培養(yǎng)經(jīng)愈傷組織途徑獲得茄子單倍體植株以來，茄子花藥培養(yǎng)和小孢子培養(yǎng)都有成功報道。雖然不少茄子品種或雜交種已獲得了DH植株，但遠沒有像茄科另一作物煙草那樣具有高效的單倍體再生系統(tǒng)，從而阻礙了該技術在茄子生產(chǎn)中大規(guī)模應用。

目前茄子花藥培養(yǎng)大多經(jīng)過脫分化形成愈傷組織和愈傷組織分化胚狀體或不定芽這兩個階段，需要置于兩種不同的培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，轉接工作量大，但愈傷組織的分化頻率卻較低；游離小孢子培養(yǎng)可以直接獲得胚狀體，但方法較為繁瑣，且胚狀體的誘導頻率低，不能完全滿足生產(chǎn)上對單倍體植株的需求。因此，如何建立高效、簡捷的胚狀體誘導體系，獲得大量單倍體植株，是現(xiàn)在茄子育種亟待解決的問題。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于公開了一種茄子花藥培養(yǎng)直接獲得植株的方法.

本發(fā)明另一個目的在于公開了用于茄子花藥培養(yǎng)直接獲得植株的方法的培養(yǎng)基。

本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種茄子花藥培養(yǎng)直接獲得植株的方法，包括下述步驟：

(1)、胚狀體的獲得：將單核靠邊期的無菌花藥接種于花藥培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中，33～37℃黑暗培養(yǎng)2～8天，轉至25-28℃光照培養(yǎng)30-40天，可見胚狀體由裂開的花藥壁內萌發(fā)出來；

所述花藥培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成為：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L絲氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％瓊脂；固體培養(yǎng)基的pH值為5.8；

(2)、再生單倍體植株的獲得：當胚狀體生長到子葉型胚狀體階段，將其轉接至健苗生根固體培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，長成完整植株；

所述健苗生根固體培養(yǎng)基的組成為：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％瓊脂；健苗生根固體培養(yǎng)基的pH值為5.8。

上述技術方案所述的一種茄子花藥培養(yǎng)直接獲得植株的方法，其中，在所述方法之前還包括下述步驟：

(1)、新鮮花蕾的選取：選取小孢子處于單核靠邊期的花蕾，通過DAPI染色確定花粉發(fā)育時期為單核靠邊期；

(2)、花蕾的表面消毒、無菌花藥的獲得：花蕾用75％酒精浸泡0.5-1分鐘，5％的次氯酸鈉溶液浸泡3-5分鐘，無菌水沖洗3-5次，無菌濾紙吸干水分。

上述技術方案所述培養(yǎng)方法中培養(yǎng)無菌花藥的培養(yǎng)基，其中，所述無菌花藥培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成為：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L絲氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％瓊脂；固體培養(yǎng)基的pH值為5.8。

上述技術方案所述培養(yǎng)方法中健苗生根的培養(yǎng)基，其中，所述健苗生根固體培養(yǎng)基的組成為：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％瓊脂；健苗生根固體培養(yǎng)基的pH值為5.8。

本發(fā)明具有以下有益效果：

(1)、本發(fā)明所采用的培養(yǎng)方法步驟少、簡單易行，由花藥離體培養(yǎng)直接誘導胚狀體獲得單倍體植株。由于本發(fā)明采用的方法不經(jīng)過愈傷組織過程，所以不存在愈傷組織分化問題，避免了花藥培養(yǎng)誘導形成的愈傷組織轉接至分化培養(yǎng)基，再誘導形成再生植株的過程；也避免了由花藥壁等二倍體體細胞參與愈傷組織形成而出現(xiàn)的倍性混雜現(xiàn)象。

(2)、本發(fā)明采用的方法具有單倍體植株再生周期短、誘導頻率高、省時省力等優(yōu)點。同時克服了基因型障礙，不同基因型紫色和綠色圓茄、長茄的花藥培養(yǎng)都獲得了較高的胚狀體誘導率。

(3)、現(xiàn)有技術中采用小孢子培養(yǎng)可以直接獲得胚狀體，雖然不受花藥壁等二倍體細胞的干擾，但培養(yǎng)技術難度較大、不易操作，而且胚狀體誘導率較低，一般都在10％以下，而采用本發(fā)明的方法，胚狀體誘導頻率一般在20％-40％。

具體實施方式：

為使本發(fā)明的技術方案便于理解，以下結合具體試驗例對本發(fā)明一種茄子花藥培養(yǎng)直接獲得植株的方法和培養(yǎng)基作進一步的說明。

實施例1：紫萼片紫色圓茄的花藥培養(yǎng)：

2015年5-6月間，從種植大棚取回花蕾，花粉經(jīng)DAPI(4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚)染色確認發(fā)育時期為單核靠邊期。花蕾經(jīng)75％酒精1分鐘，5％次氯酸鈉5分鐘表面消毒，無菌水沖洗3次，無菌濾紙吸干水分。用小鑷子小心地將花藥取出，置于花藥培養(yǎng)固體培養(yǎng)基中，37℃黑暗培養(yǎng)3天后轉至25℃光照下繼續(xù)培養(yǎng)；30天左右，肉眼可見白色胚狀體從裂開的花藥壁內萌發(fā)出來；

當胚狀體分化出兩片小子葉時將其轉至健苗生根固體培養(yǎng)基中上繼續(xù)生長，進行壯苗及生根。1130個花藥共產(chǎn)出胚狀體446個，胚狀體誘導率為39.5％；

其中，無菌花藥培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的組成為：950mg/L KNO₃、825mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.5mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.5mg/L葉酸、0.05mg/L生物素、800mg/L谷氨酰胺、100mg/L絲氨酸、30mg/L谷胱甘肽(GSH)、0.1～1mg/L KT、0.1～1mg/L IAA、0.01～0.05mg/L NAA、0.1％～0.3％活性炭、3％～6％蔗糖和0.6％～0.8％瓊脂；固體培養(yǎng)基的pH值為5.8；

其中，健苗生根固體培養(yǎng)基的組成為：1900mg/L KNO₃、1650mg/L NH₄NO₃、332.02mg/L CaCl₂、180.54mg/L MgSO₄、170mg/L KH₂PO₄、36.7mg/L FeNaEDTA、0.83mg/L KI、6.2mg/L H₃BO₃、16.9mg/L MnSO₄·H₂O、8.6mg/L ZnSO₄·7H₂O、0.25mg/L Na₂MoO₄·2H₂O、0.025mg/L CuSO₄·5H₂O、0.025mg/L CoCl₂·6H₂O、100mg/L肌醇、0.5mg/L煙酸、2mg/L甘氨酸、0.1mg/L鹽酸硫氨(維生素B1)、0.5mg/L鹽酸吡哆素(維生素B6)、0.01～0.1mg/L KT、0.1～0.5mg/L IBA、3％蔗糖和0.8％瓊脂；健苗生根固體培養(yǎng)基的pH值為5.8。

實施例2：

按照實施例1的實施過程，2013-2016年間對13種不同基因型的茄子分別進行了實驗，其中對4個茄子雜交種(A、C、G、J)進行了重復實驗，結果如表2所示，表2中雜交種A于2014年和2015年進行了重復實驗；雜交種C于2015年和2016年進行了重復實驗；雜交種G于2014年和2015年進行了重復實驗；雜交種J于2015年和2016年進行了重復實驗：

表2不同基因型茄子花藥培養(yǎng)的胚狀體誘導結果

由表2可知，采用本發(fā)明的方法，胚狀體誘導頻率一般在20％-40％。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明作任何形式上和實質上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明技術方案范圍內，當可利用以上所揭示的技術內容，而作出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質技術對以上實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術方案的范圍內。