本發(fā)明涉及藥劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種液基細(xì)胞保存液及其制備方法。

背景技術(shù)：

近年來，細(xì)胞生物治療技術(shù)逐漸代替?zhèn)鹘y(tǒng)藥物治療，在各大疾病治療領(lǐng)域上發(fā)揮越來越重要的作用。細(xì)胞生物治療技術(shù)是指利用具有某些特定功能的細(xì)胞，采用生物工程方法通過體外擴(kuò)增、特殊培養(yǎng)等處理后，使這些細(xì)胞具有增強(qiáng)免疫、殺死病原體和腫瘤細(xì)胞、促進(jìn)組織器官再生和機(jī)體康復(fù)等治療功效，從而達(dá)到治療疾病的目的。為了進(jìn)一步的適應(yīng)臨床應(yīng)用的需要，開發(fā)一種能在長時(shí)間的保存和運(yùn)輸過程中能維持細(xì)胞的存活率及活力的新保存液成為了當(dāng)務(wù)之急。

在申請?zhí)枮镃N200910034575.4的專利申請中，介紹了一種液基細(xì)胞保存液，其主要成分為醇類、雙蒸水、磷酸鹽、滅菌劑和粘液分解劑組成，該液基細(xì)胞保存液的獨(dú)特粘液分解劑能把樣本中被粘液包裹的細(xì)胞成功分離出來，避免了陽性細(xì)胞堆積與丟失，但是這些會(huì)導(dǎo)致將粘液溶解試劑殘留在細(xì)胞樣本中，抑制后續(xù)的檢測。在申請?zhí)枮镃N201110325314.5的專利申請中，介紹了一種間充質(zhì)干細(xì)胞保存液，其含有人AB型臍帶血血漿和低分子肝素鈣，該間充質(zhì)干細(xì)胞保存液其臨床應(yīng)用安全可靠且制備方法簡單，然而同體輸注的成本極高，若是異體輸注則存在安全隱患。

綜上所述，制備具有長時(shí)間維持細(xì)胞活性、對細(xì)胞無損傷、成本低廉且安全性好的液基細(xì)胞保存液對于細(xì)胞生物治療技術(shù)的實(shí)際應(yīng)用具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種具有長時(shí)間維持細(xì)胞活性、對細(xì)胞無損傷、成本低廉且安全性好的液基細(xì)胞保存液。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種液基細(xì)胞保存液，該保存液由固定劑、抗凝劑、緩沖劑、注射液、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑以及添加劑組成，其成分組成按重量份計(jì)為：固定劑20-60重量份、抗凝劑0.1-0.5重量份、緩沖劑0.5-5重量份、注射液40-60重量份、營養(yǎng)劑0.1-0.5重量份、抑制劑0.01-0.1重量份、消除劑0.2-0.5重量份以及添加劑0.01-0.05重量份。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述固定劑為乙醇、甲醇和丙醇中的一種或多種。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述抗凝劑為EDTA。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述緩沖劑為磷酸鹽和/或碳酸鹽緩沖液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述注射液為質(zhì)量百分比為0.9％的氯化鈉注射液。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述營養(yǎng)劑為L-谷氨酰胺。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述抑制劑為胰島素。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述消除劑為N-乙酰半胱氨酸。

作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述添加劑為亞硒酸鈉。

同時(shí)提出一種液基細(xì)胞保存液的制備方法，其步驟如下：在注射液中分別加入緩沖劑、抗凝劑、固定劑、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑及添加劑，混勻即可。

本發(fā)明液基細(xì)胞保存液穩(wěn)定性好、成本低廉、無毒副作用，便于細(xì)胞的保存和運(yùn)輸，制備方法簡單，適應(yīng)細(xì)胞治療的臨床大規(guī)模使用，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。

具體實(shí)施方式

為了使本技術(shù)領(lǐng)域人員更好地理解本發(fā)明的技術(shù)方案，并使本發(fā)明的上述特征、目的以及優(yōu)點(diǎn)更加清晰易懂，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

醇類(包括乙醇、甲醇和丙醇)、EDTA、磷酸鹽和/或碳酸鹽緩沖液購自上海如吉生物科技發(fā)展有限公司；質(zhì)量百分比為0.9％氯化鈉注射液購自江蘇亞邦生緣藥業(yè)有限公司；L-谷氨酰胺購自浙江綠州生物技術(shù)有限公司；胰島素購自永華化學(xué)科技(江蘇)有限公司；N-乙酰半胱氨酸購自武漢伊美特生物技術(shù)有限公司；亞硒酸鈉購自上海勤聯(lián)化工有限公司。

實(shí)施例1

一種液基細(xì)胞保存液，該保存液由固定劑、抗凝劑、緩沖劑、注射液、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑以及添加劑組成，其成分組成按重量份計(jì)為：60重量份固定劑乙醇、0.5重量份抗凝劑EDTA、5重量份緩沖劑碳酸鹽、20重量份注射液質(zhì)量百分比為0.9％的氯化鈉溶液、0.5重量份營養(yǎng)劑L-谷氨酰胺、0.1重量份抑制劑胰島素、0.5重量份消除劑N-乙酰半胱氨酸以及0.05重量份添加劑亞硒酸鈉。乙醇可用等質(zhì)量的甲醇或丙醇或者甲醇、乙醇、丙醇三者形成的混合物代替。碳酸鹽可用等質(zhì)量的磷酸鹽或者碳酸鹽和磷酸鹽的混合物代替。

制備的方法為在注射液中分別加入上述的緩沖劑、抗凝劑、固定劑、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑及添加劑，混勻即可。

實(shí)施例2

一種液基細(xì)胞保存液，該保存液由固定劑、抗凝劑、緩沖劑、注射液、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑以及添加劑組成，其成分組成按重量份計(jì)為：20重量份固定劑甲醇、0.1重量份抗凝劑EDTA、5重量份緩沖劑碳酸鹽、60重量份注射液質(zhì)量百分比為0.9％的氯化鈉溶液、0.1重量份營養(yǎng)劑L-谷氨酰胺、0.01重量份抑制劑胰島素、0.2重量份消除劑N-乙酰半胱氨酸以及0.01重量份添加劑亞硒酸鈉。甲醇可用等質(zhì)量的乙醇或丙醇或者甲醇、乙醇、丙醇三者形成的混合物代替。碳酸鹽可用等質(zhì)量的磷酸鹽或者碳酸鹽和磷酸鹽的混合物代替。

制備的方法為在注射液中分別加入上述的緩沖劑、抗凝劑、固定劑、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑及添加劑，混勻即可。

實(shí)施例3

一種液基細(xì)胞保存液，該保存液由固定劑、抗凝劑、緩沖劑、注射液、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑以及添加劑組成，其成分組成按重量份計(jì)為：40重量份固定劑丙醇、0.3重量份抗凝劑EDTA、2重量份緩沖劑碳酸鹽、40重量份注射液質(zhì)量百分比為0.9％的氯化鈉溶液、0.3重量份營養(yǎng)劑L-谷氨酰胺、0.05重量份抑制劑胰島素、0.3重量份消除劑N-乙酰半胱氨酸以及0.03重量份添加劑亞硒酸鈉。丙醇可用等質(zhì)量的乙醇或丙醇或者甲醇、乙醇、丙醇三者形成的混合物代替。碳酸鹽可用等質(zhì)量的磷酸鹽或者碳酸鹽和磷酸鹽的混合物代替。

制備的方法為在注射液中分別加入上述的緩沖劑、抗凝劑、固定劑、營養(yǎng)劑、抑制劑、消除劑及添加劑，混勻即可。

對比例1

新型液基細(xì)胞保存液的制備方法同實(shí)施例2，只是沒有添加緩沖劑。

對比例2

新型液基細(xì)胞保存液的制備方法同實(shí)施例1，只是沒有添加營養(yǎng)劑L-谷氨酰胺。

對比例3

新型液基細(xì)胞保存液的制備方法同實(shí)施例3，只是沒有添加抑制劑胰島素。

對比例4

新型液基細(xì)胞保存液的制備方法同實(shí)施例2，只是沒有添加消除劑N-乙酰半胱氨酸。

對比例5

新型液基細(xì)胞保存液的制備方法同實(shí)施例1，只是沒有添加添加劑亞硒酸鈉。

任意的采用肝細(xì)胞作為樣品采用上述實(shí)施例和對比例中由MTT法測得細(xì)胞存活率，測試結(jié)果見表1。

表1 實(shí)施例1-3和對比例1-5所制細(xì)胞保存液的性能

本發(fā)明實(shí)施例1-3相比于對比例1-5具備上述優(yōu)良性能的原因在于：固定劑用于固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，維持細(xì)胞DNA和蛋白質(zhì)完整性；緩沖劑為磷酸鹽和/或碳酸鹽緩沖液，其可以抑制氫離子的堆積，解除對糖酵解的抑制，從而減輕細(xì)胞內(nèi)酸化；營養(yǎng)劑為L-谷氨酰胺，其為細(xì)胞提供能量，補(bǔ)充細(xì)胞能量丟失，并有效減輕細(xì)胞損害，降低機(jī)體對無氧酵解的依賴，減輕細(xì)胞內(nèi)酸化；抑制劑為胰島素，能夠抑制細(xì)胞的調(diào)亡；消除劑為N-乙酰半胱氨酸，其可以直接提供電子還原自由基或增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而清除自由基，并具有延遲、抑制和阻斷氧化損傷的作用；添加劑為亞硒酸鈉，可與N-乙酰半胱氨酸協(xié)同消除氧自由基和氧化物酶對細(xì)胞的傷害，穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明同現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

(1)本發(fā)明液基細(xì)胞保存液安全，能長時(shí)間維持細(xì)胞的活性，且細(xì)胞形態(tài)正常、不影響其增殖擴(kuò)增能力、不影響間細(xì)胞表型特征；

(2)本發(fā)明液基細(xì)胞保存液減輕細(xì)胞內(nèi)酸化，減輕氧自由基損傷、穩(wěn)定細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、補(bǔ)充細(xì)胞能量丟失；

(3)本發(fā)明液基細(xì)胞保存液在制片后所得的涂片背景清晰透明、細(xì)胞單層均勻分布，便于病理科醫(yī)生的讀片。

本發(fā)明液基細(xì)胞保存液穩(wěn)定性好、成本低廉、無毒副作用，便于細(xì)胞的保存和運(yùn)輸，制備方法簡單，適應(yīng)細(xì)胞治療的臨床大規(guī)模使用，具有良好的應(yīng)用前景和經(jīng)濟(jì)效益。

上述實(shí)施方式僅供說明本發(fā)明之用，而并非是對本發(fā)明的限制，有關(guān)技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的情況下，還可以作出各種變化和變型，因此所有等同的技術(shù)方案也應(yīng)屬于本發(fā)明的范疇。