本發(fā)明屬于林木組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種翅果油樹定芽增殖與植株再生方法。

背景技術(shù)：

翅果油樹(Elaeagnusmollis Diels)，為胡頹子科胡頹子屬多年生落葉喬木或灌木，是第四紀(jì)冰川幸存的中國特有的古老植物種。翅果油樹種子油營養(yǎng)豐富、均衡、全面，富含多不飽和脂肪酸，其中亞油酸含量高達(dá)45％，亞油酸是一種人和動物體自身不能合成而必須從食物中攝取的不飽和脂肪酸，具有預(yù)防高血壓、高血脂、血管硬化等病癥的功能。翅果油樹種仁中維生素E的含量尤為驚人，高達(dá)1558.1mg/100g。維生素E與人體的生長發(fā)育密切相關(guān)，有著顯著的抗氧化、抗衰老作用。翅果油樹葉中富含黃酮類化合物，可為心血管類疾病藥物研制提供來源。此外，因其花蜜量大，材質(zhì)細(xì)密堅實，根系發(fā)達(dá)并具有根瘤固氮活性，在蜜源植物、用材林栽培，水土保持、改善土壤肥力方面，翅果油樹也具有一定的應(yīng)用前景。

過去由于對翅果油樹缺乏正確的認(rèn)知和可持續(xù)性利用意識，人類的砍伐、墾荒以及大規(guī)模無限制的直接采摘野生翅果油樹種子榨油等生產(chǎn)活動對翅果油樹的自然群落產(chǎn)生了嚴(yán)重干擾破壞。除了人為因素外，翅果油樹自身脆弱的生物學(xué)特性如自然生境狹窄；結(jié)實率低，易發(fā)育不良；自然條件下，種子壽命短，發(fā)芽率低等也加劇了其種群的瀕危。因此，有必要采取措施恢復(fù)、擴(kuò)大翅果油樹種群，從而保護(hù)這一重要的遺傳資源和優(yōu)良的珍稀油料樹種，充分利用其經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和科研價值。

翅果油樹的繁育通常有種子繁殖和分根繁殖。但翅果油樹自然條件下種子壽命短，發(fā)芽率低，而分根繁殖存在繁殖系數(shù)不高的問題。組織培養(yǎng)是一項已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的生物技術(shù)，但翅果油樹組織培養(yǎng)過程中誘導(dǎo)愈傷及不定芽時易發(fā)生褐化，本方法則避開這一難題，利用翅果油樹葉腋處易萌發(fā)新芽的特點(diǎn)，采用定芽增殖的方法，促進(jìn)腋芽萌發(fā)、伸長，實現(xiàn)植株再生。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種翅果油樹定芽增殖與植株再生方法，避開傳統(tǒng)的翅果油樹組織培養(yǎng)方法中愈傷及不定芽誘導(dǎo)過程中易出現(xiàn)褐化的問題，實現(xiàn)翅果油樹無性繁殖。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

一種翅果油樹定芽增殖與植株再生方法，包括以下步驟：

(1)選取發(fā)育良好的成熟翅果油樹果實，剝?nèi)ネ鈱訄杂补麣?，進(jìn)行清洗、消毒、無菌處理；然后在解剖鏡下去除內(nèi)層種皮，置于3/4MS+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基，獲得腋芽飽滿、健壯的實生苗；

(2)將獲得的實生苗剪成帶有2～4個腋芽或頂芽，長3～4cm的莖段，水平接種于3/4MS+TDZ 0.006～0.008mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基，處理7～10d；

(3)將步驟(2)獲得的莖段豎直接種于3/4MS+BA0.4～0.5mg/L+NAA0.05～0.07mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂7g/L培養(yǎng)基培養(yǎng)，20d時繼代一次；

(4)待步驟(3)中定芽伸長到6cm以上，具有一定木質(zhì)化程度后，接種于生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.01～0.03+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L中繼續(xù)培養(yǎng)，進(jìn)行生根誘導(dǎo)；最終獲得小苗。

步驟(1)中，以少量洗潔精和84消毒液浸泡10min并流水沖洗1h后，于超凈臺中用70％酒精浸泡40s，再以適量0.1％升汞并少量Tween～20，振蕩浸泡20min，無菌水沖洗4～5次。

步驟(3)中，培養(yǎng)基為3/4MS+BA 0.5mg/L+NAA0.05～0.07mg/L。

步驟(4)中，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.01～0.03mg/L+KT 0.01mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L。

步驟(4)中，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 1.5mg/L+NAA 0.03mg/L+KT 0.01mg/L+蔗糖25g/L+瓊脂7g/L。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的采用定芽增殖的方法，可避開傳統(tǒng)的翅果油樹組織培養(yǎng)方法中愈傷及不定芽誘導(dǎo)過程中易出現(xiàn)褐化的難題；帶有腋芽或定芽的莖段接種于包含0.006～0.008mg/LTDZ和0.1mg/LNAA的芽啟動培養(yǎng)培養(yǎng)基上，處理7～10d，能有效促進(jìn)葉腋處腋芽萌發(fā)，縮短育苗周期；芽伸長培養(yǎng)基的BA0.5mg/L和NAA0.05～0.07mg/L的激素配比，可有效促進(jìn)定芽伸長為具有一定高度、粗度和木質(zhì)化程度的嫩枝，有利于生根。

附圖說明

圖1是芽啟動培養(yǎng)實物圖；

圖2是芽伸長培養(yǎng)結(jié)果圖；

圖3是生根圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

以下實施例使用的培養(yǎng)條件為：光照強(qiáng)度(2000lx)，光照時間14h/d，培養(yǎng)溫度25℃左右；培養(yǎng)基pH5.7～5.8。

實施例1

一種翅果油樹定芽增殖與植株再生方法，包括以下步驟：

(1)無菌苗的獲得：選取發(fā)育良好的成熟翅果油樹果實，物理機(jī)械法剝?nèi)ネ鈱訄杂补麣?，以少量洗潔精?4消毒液浸泡10min并流水沖洗1h后，于超凈臺中用70％酒精浸泡40s，再以適量0.1％氯化汞并少量Tween～20，振蕩浸泡20min，無菌水沖洗4～5次；然后在解剖鏡下去除果實內(nèi)層種皮，置于3/4MS培養(yǎng)基，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，獲得腋芽飽滿，健壯的實生苗。

(2)芽啟動培養(yǎng)基的選擇：將獲得的實生苗，剪成帶2～4個腋芽或頂芽長約3～4cm的莖段，如圖1所示，水平接種于3/4MS基本培養(yǎng)基，附加的激素濃度配比為0.004、0.006、0.008、0.01、0.02、0.05、0.1mg/LTDZ和0.1mg/L NAA，處理時長5d、10d、15d。

(3)芽伸長培養(yǎng)基的選擇：將上述芽啟動培養(yǎng)基中處理5d、10d、15d的莖段接種于3/4MS基本培養(yǎng)基，附加的激素濃度配比為0.1、0.3、0.5、0.7、0.9mg/L BA和0.03、0.05、0.07、0.09mg/L NAA，20d繼代一次。

芽啟動培養(yǎng)過程中，TDZ濃度愈大，處理時間愈長，莖段膨大畸形程度及玻璃化程度愈嚴(yán)重，轉(zhuǎn)至芽伸長培養(yǎng)基中進(jìn)行芽伸長培養(yǎng)也相應(yīng)的愈加困難。TDZ>0.01mg/L，處理時間>10d時，莖段過于膨大畸形，玻璃化嚴(yán)重；當(dāng)0.004<TDZ<0.08mg/L，處理時間5～10d時，莖段出現(xiàn)一定程度的膨大，原本無腋芽的葉腋處萌發(fā)新芽，轉(zhuǎn)至附加0.5mg/L BA，0.05～0.07mg/LNAA的芽伸長培養(yǎng)基，每莖段平均定芽數(shù)增至4～8個，如圖2所示。

綜合考慮外植體玻璃化程度、芽增殖率、芽伸長難易、培養(yǎng)周期長短等因素，芽啟動培養(yǎng)基以TDZ濃度為0.006～0.008mg/L，處理時長7～10d為宜；芽伸長培養(yǎng)基以BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度為0.05～0.07mg/L最佳，35d左右時，芽苗高度約4～6cm。

(4)生根培養(yǎng)：待芽伸長至具有一定粗度、高度(約6cm以上)及木質(zhì)化程度后，接種于1/2MS基本培養(yǎng)基，附加IBA、NAA、KT和25g/L蔗糖，35d時統(tǒng)計數(shù)據(jù)。生根率＝生根成功的苗數(shù)/接種的苗數(shù)；生根條數(shù)＝根的總條數(shù)/生根成功的苗數(shù)。

生根培養(yǎng)基和激素使用情況及相應(yīng)的結(jié)果如表1和圖3所示。生長素濃度極大的影響翅果油樹組培苗的長勢和根的誘導(dǎo)效率。生長素濃度較低(IBA<1.0mg/L，NAA<0.03mg/L)時，不生根或生根慢，根數(shù)量少；生長素濃度較高(IBA>1.5mg/L，NAA>0.03mg/L)時，苗基部易形成愈傷，落葉嚴(yán)重，導(dǎo)致生根失敗。

表1生根培養(yǎng)基和激素使用及相應(yīng)的實驗結(jié)果

綜合考慮外植體生根率、根的質(zhì)量、苗的長勢，適合生根的培養(yǎng)基為IBA1.5mg/L，IAA0.03mg/L，附加或不附加0.01mg/L KT，生根率達(dá)30.0％～36.7％。