本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種鴨茅組織培養(yǎng)再生體系的建立方法。

背景技術：

鴨茅(又名雞腳草、果園草)的野生種分布于我國新疆、天山山脈的森林邊緣地帶、四川的峨眉山、二郎山、邛崍山脈、涼山及岷山山系海拔1600～3100米的森林邊緣、灌叢及山坡草地；并且散見于大興安嶺東南坡地。栽種鴨茅除馴化當?shù)匾吧N外多引自丹麥、美國、澳大利亞等國。目前，青海、甘肅、陜西、吉林、江蘇、湖北、四川及新疆等省(區(qū))均有栽培；鴨茅原產(chǎn)歐洲、北非和亞洲溫帶，后引入全世界溫帶地區(qū)。

鴨茅草質柔軟，牛、馬、羊、兔等均喜食。幼嫩時尚可用以喂豬。葉量豐富，葉占60％，莖約占40％。鴨茅可作用放牧或制作干草，也可收割青飼或制作青貯料。鴨茅的化學成分隨其成熟度而下降。再生草葉多莖少，基本處于營養(yǎng)生長，其成分與第一次由割前的孕穗期相近。其鉀、磷、鈣、鎂的含量也隨成熟度而下降，銅含量在整個生長期變化不大。第一次收割的草含鉀、銅、鐵較多，再生草含磷、鈣、鎂較多。鴨茅抽穗期的維生素含量很高，尤其胡蘿卜素含量，30毫克/千克、維生素E248毫克/千克。微量元素含量也豐富，鐵100毫克/千克、錳136毫克/千克、銅7.0毫克/千克、鋅21.0毫克/千克。鴨茅的必需氨基酸含量高，鴨茅形成大量的莖生葉和基生葉，適合于放牧、青貯或刈制干草。葉量豐富的放牧用草種，冬季保持青綠，在冬季氣候溫和的地方還能提供部分青料。在連續(xù)重牧條件下，不能較好地長久保持生長，但是，如果放牧不充分，形成大的株叢，就會變得粗糙而降低適口性，故適于輪牧。播種當年刈割1次，畝產(chǎn)鮮草1000千克，而第二、三年可刈割2～3次，畝產(chǎn)鮮草3000千克以上。生長在肥沃土壤條件下，畝產(chǎn)鮮草可達5000千克左右。此外，鴨茅較為耐蔭，與果樹結合，建立果園草地，在我國果品產(chǎn)區(qū)是有發(fā)展前途的。

鴨茅具有生長迅速、分蘗能力強、產(chǎn)量高、耐瘠薄等優(yōu)良特性，是中國南方草地農業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的草種。隨著分子生物學的發(fā)展，很多涉及到基因功能驗證的實驗需要通過組織培養(yǎng)進行遺傳轉化。傳統(tǒng)的組培方式多以鴨茅的幼嫩花穗，莖節(jié)或者幼苗為外植體進行愈傷的誘導，進而通過分化得到完整的植株，但這些方式也存在外植體的選取受季節(jié)的限制不能全年提供足夠的外植體進行實驗，同時實驗也相對比較耗時。因此，我們的組培是以種子為外植體，直接誘導愈傷從而得到完整的植株。克服了外植體供給的季節(jié)限制，同時也可以大大縮短實驗周期。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術問題是提供一種能夠克服外植體供給的季節(jié)限制且能夠大大縮短實驗周期的鴨茅組織培養(yǎng)再生體系的建立方法。

本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案為：該鴨茅組織培養(yǎng)再生體系的建立方法，包括以下步驟：

A、采用鴨茅成熟種子作為外植體，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)26～30d得到愈傷組織，所述誘導培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解絡蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的瓊脂組成，所述誘導培養(yǎng)基的PH＝5.8；

B、將愈傷組織轉入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～9d，所述繼代培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的瓊脂組成，所述繼代培養(yǎng)基的PH＝5.8；

C、將經(jīng)過步驟B處理的愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～22d，所述分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的瓊脂組成，所述分化培養(yǎng)基的PH＝5.8；

D、當幼苗長至2～3cm時，將其移栽。

進一步的是，在步驟A中，對鴨茅成熟種子清洗滅菌的處理方式如下所述：首先，將鴨茅成熟種子放入瓶中，并在瓶中添加無水乙醇浸泡1分鐘，接著鴨茅成熟種子取出用蒸餾水清洗干凈，然后在瓶中加入蒸餾水并將清洗干凈的鴨茅成熟種子放入瓶中，將瓶子置于4℃冰箱中進行泡種處理，所述泡種的時間為24h，泡種結束后，將鴨茅成熟種子取出放入70％的乙醇溶液中浸泡1min，再取出放入1％的NaClO溶液中浸泡30min，最后將鴨茅成熟種子取出后用雙蒸水清洗3-5次，并將其置于滅菌濾紙，晾干多余水分。

進一步的是，在步驟A中，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16d后，減去鴨茅成熟種子上發(fā)出的新芽并更換新的誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～16d后得到愈傷組織。

進一步的是，在步驟A中，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后，減去鴨茅成熟種子上發(fā)出的新芽并更換新的誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14d后得到愈傷組織。

進一步的是，所述誘導培養(yǎng)中含有的N6培養(yǎng)基由KNO₃、NH₄SO4、CaCl₂.2H₂O、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O ZnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₂BO₃、KI、甘氨酸、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆素組成，各組分的含量如下所述：KNO₃為2830mg/L，NH₄SO4為463mg/L，CaCl₂.2H₂O為166mg/L，MgSO4·7H₂O為,185mg/L，KH₂PO₄為400mg/L，MnSO₄·4H₂O為4.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O為1.6mg/L，H₃BO₃為0.8mg/L，KI為1.6mg/L，甘氨酸為2.0mg/L，煙酸為0.5mg/L，鹽酸硫胺素為1.0mg/L，鹽酸吡哆醇為0.5mg/L。

進一步的是，所述誘導培養(yǎng)中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的煙酸組成。

進一步的是，所述繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基中含有的MS培養(yǎng)基由KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂·2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇組成，各組分的含量如下所述：KNO₃為1900mg/L，NH₄NO₃為1650mg/L，MgSO4·7H₂O為370mg/L，KH₂PO₄為170mg/L，CaCl₂·2H₂O為440mg/L，MnSO₄·4H₂O為22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O為8.6mg/L，H₃BO₃為6.2mg/L，KI為0.83mg/L，NaMoO₄·2H₂O為0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O為0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O為0.025mg/L，Na₂-EDTA為37.3mg/L，F(xiàn)eSO₄·4H₂O為27.8mg/L，甘氨酸為2.0mg/L，鹽酸硫胺素為0.1mg/L，鹽酸吡哆醇為0.5mg/L，煙酸為0.5mg/L，肌醇為100mg/L。

進一步的是，在步驟A中，所述誘導培養(yǎng)的環(huán)境溫度為25℃，且培養(yǎng)方式為暗培。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明采用鴨茅成熟種子作為外植體，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)26～30d得到愈傷組織，由N6培養(yǎng)基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解絡蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的瓊脂組成的誘導培養(yǎng)基可以大大提高誘導率，接著將愈傷組織轉入愈傷組織繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～9d，由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的瓊脂組成的繼代培養(yǎng)基可以使愈傷組織增殖最快且質量好，再將其轉接到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～22d，由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的瓊脂組成的愈傷組織分化培養(yǎng)基可以大大提高分化率，當幼苗長至2～3cm時，將其移栽即可，通過上述方法建立了高效的鴨茅組織培養(yǎng)再生體系，為建立鴨茅組織高效遺傳轉化體系奠定基礎，為選育鴨茅組織優(yōu)良品種提供了技術參考，同時克服了外植體供給的季節(jié)限制，同時也大大縮短了實驗周期。

具體實施方式

本發(fā)明采用鴨茅成熟種子作為外植體，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)26～30d得到愈傷組織，由N6培養(yǎng)基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解絡蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的瓊脂組成的誘導培養(yǎng)基可以大大提高誘導率，接著將愈傷組織轉入愈傷組織繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～9d，由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的瓊脂組成的繼代培養(yǎng)基可以使愈傷組織增殖最快且質量好，再將其轉接到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～22d，由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的瓊脂組成的愈傷組織分化培養(yǎng)基可以大大提高分化率，當幼苗長至2～3cm時，將其移栽即可，通過上述方法建立了高效的鴨茅組織培養(yǎng)再生體系，為建立鴨茅組織高效遺傳轉化體系奠定基礎，為選育鴨茅組織優(yōu)良品種提供了技術參考，同時克服了外植體供給的季節(jié)限制，同時也大大縮短了實驗周期。具體的，本發(fā)明所述的鴨茅組織培養(yǎng)再生體系的建立方法，具體包括以下步驟：

A、采用鴨茅成熟種子作為外植體，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)26～30d得到愈傷組織，所述誘導培養(yǎng)基由N6培養(yǎng)基、Vb stock、30g/L的蔗糖、200mg/L的酸水解絡蛋白、500mg/L的脯氨酸、7.0mg/L的2，4-D、4.5g/L的瓊脂組成，所述誘導培養(yǎng)基的PH＝5.8；

B、將愈傷組織轉入繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)5～9d，所述繼代培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、5.0mg/L的2，4-D、1.0mg/L的6-BA、1.0g/L的活性炭、4.5g/L的瓊脂組成，所述繼代培養(yǎng)基的PH＝5.8；

C、將經(jīng)過步驟B處理的愈傷組織轉接到分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～22d，所述分化培養(yǎng)基由MS培養(yǎng)基、30g/L的蔗糖、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的GA、1.0mg/L的6-BA、4.5g/L的瓊脂組成，所述分化培養(yǎng)基的PH＝5.8；

D、當幼苗長至2～3cm時，將其移栽。

在上述鴨茅組織培養(yǎng)再生體系的建立方法過程中，在步驟A中，對鴨茅成熟種子清洗滅菌的處理方式可以采用多種方式，為了使清洗效果、殺菌效果達到最佳，本發(fā)明采用如下所述的方式：首先，將鴨茅成熟種子放入瓶中，并在瓶中添加無水乙醇浸泡1分鐘，接著鴨茅成熟種子取出用蒸餾水清洗干凈，然后在瓶中加入蒸餾水并將清洗干凈的鴨茅成熟種子放入瓶中，將瓶子置于4℃冰箱中進行泡種處理，所述泡種的時間為24h，泡種結束后，將鴨茅成熟種子取出放入70％的乙醇溶液中浸泡1min，再取出放入1％的NaClO溶液中浸泡30min，最后將鴨茅成熟種子取出后用雙蒸水清洗3-5次，并將其置于滅菌濾紙，晾干多余水分。

在步驟A中，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16d后，減去鴨茅成熟種子上發(fā)出的新芽并更換新的誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12～16d后得到愈傷組織。將初次發(fā)出的新芽去除，由于初次發(fā)出的新芽發(fā)芽率不高，故減去采用二次長出的新芽，該方法可以得到效果最佳的新芽。通常情況下，將鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到誘導培養(yǎng)基中培養(yǎng)14d后，減去鴨茅成熟種子上發(fā)出的新芽并更換新的誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14d后得到愈傷組織，最后得到的新芽效果最佳。

所述誘導培養(yǎng)中含有的N6培養(yǎng)基由KNO₃、NH₄SO4、CaCl₂.2H₂O、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、FeSO₄·7H₂O ZnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₂BO₃、KI、甘氨酸、煙酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆素組成，各組分的含量如下所述：KNO₃為2830mg/L，NH₄SO4為463mg/L，CaCl₂.2H₂O為166mg/L，MgSO4·7H₂O為,185mg/L，KH₂PO₄為400mg/L，MnSO₄·4H₂O為4.4mg/L，ZnSO₄·7H₂O為1.6mg/L，H₃BO₃為0.8mg/L，KI為1.6mg/L，甘氨酸為2.0mg/L，煙酸為0.5mg/L，鹽酸硫胺素為1.0mg/L，鹽酸吡哆醇為0.5mg/L。所述誘導培養(yǎng)中含有的Vb stock由9.9mg/L的Vb1、9.5mg/L的Vb6、4.5mg/L的煙酸組成。所述繼代培養(yǎng)基、分化培養(yǎng)基中含有的MS培養(yǎng)基由KNO₃、NH₄NO₃、MgSO4·7H₂O、KH₂PO₄、CaCl₂.2H₂O、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·7H₂O、H₃BO₃、KI、NaMoO₄·2H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O、Na₂-EDTA、FeSO₄·4H₂O、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、肌醇組成，各組分的含量如下所述：KNO₃為1900mg/L，NH₄NO₃為1650mg/L，MgSO4·7H₂O為370mg/L，KH₂PO₄為170mg/L，CaCl₂.2H₂O為440mg/L，MnSO₄·4H₂O為22.3mg/L，ZnSO₄·7H₂O為8.6mg/L，H₃BO₃為6.2mg/L，KI為0.83mg/L，NaMoO₄·2H₂O為0.25mg/L，CuSO₄·5H₂O為0.025mg/L，CoCl₂·6H₂O為0.025mg/L，Na₂-EDTA為37.3mg/L，F(xiàn)eSO₄·4H₂O為27.8mg/L，甘氨酸為2.0mg/L，鹽酸硫胺素為0.1mg/L，鹽酸吡哆醇為0.5mg/L，煙酸為0.5mg/L，肌醇為100mg/L。這種配方是專門針對鴨茅配置的，更加適宜鴨茅組織培養(yǎng)。

為了誘導培養(yǎng)的效果更好，所述誘導培養(yǎng)的環(huán)境溫度為25℃，且培養(yǎng)方式為暗培。

將多個鴨茅成熟種子清洗滅菌后接種到上述誘導培養(yǎng)基中，然后在25±2℃的培養(yǎng)室中黑暗培養(yǎng)14d后，減去鴨茅成熟種子上發(fā)出的新芽并更換新的誘導培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)14d后得到愈傷組織。觀察愈傷組織的質量并統(tǒng)計愈傷組織數(shù)計算愈傷組織誘導率，其愈傷組織誘導率高達73％，而且愈傷組織生長速度快、品質最好，呈淡黃色、致密、較大(直徑>1cm)顆粒。

繼代培養(yǎng)主要作用是使愈傷組織擴增，更有利于培養(yǎng)出更多的再生植株。將經(jīng)過誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)得到的愈傷組織轉入上述繼代培養(yǎng)基中，然后在培養(yǎng)室中黑暗培養(yǎng)7d，觀察愈傷組織的質量并統(tǒng)計愈傷組織最終重量，然后計算增值效率，增殖效率為一個愈傷分化出的幼芽數(shù)目，其增值效率高達1400％，且愈傷組織呈淡黃色的致密顆粒。

將經(jīng)過繼代培養(yǎng)基處理的愈傷組織轉接到上述分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)20d，然后在培養(yǎng)溫度25±2℃、光照強度1000lx條件下培養(yǎng)20d，統(tǒng)計綠苗分化率，其綠苗分化率高達80％。

當苗長至2～3cm時，將其移栽即可。

在本發(fā)明中min表示分鐘，d表示天數(shù)，NaClO表示次氯酸鈉，Vb表示維生素B，Vb1表示維生素B1，Vb6表示維生素B6，2,4-D表示2,4-二氯苯氧乙酸，6-BA表示6-芐氨基嘌呤，NAA表示萘乙酸，GA表示赤霉素。