專利名稱：超雄魚繁育體系的建立技術(shù)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了一類超雄魚繁育體系的建立技術(shù)。它屬于魚類性別控制技術(shù)領(lǐng)域。
建立超雄魚(YY，♂)繁育體系是在漁業(yè)生產(chǎn)上推廣養(yǎng)殖全雄魚(YY，♂)的先決條件，在本發(fā)明提出之前，世界各國的水產(chǎn)科技工作者采用雄核發(fā)育的技術(shù)途徑獲得超雄魚(YY，♂)，然后與普遍的雌魚(XX，♀)交配，產(chǎn)生出全雄魚(XY，♂)后代。楊永銓(1980)曾提出三系配套繁育全雄羅非魚的技術(shù)途徑，但由于具有YY染色體的超雄魚的檢測很困難，難以在生產(chǎn)上實(shí)施，而雄核發(fā)育的技術(shù)途徑，也因超雄魚各個基因座位高度純合、理化方法處理雄核發(fā)育卵子第一次有絲分裂使染色體加倍時，染色體組受到嚴(yán)重的損傷，以及理化方法使卵核失活的同時，也使卵細(xì)胞質(zhì)的線粒體DNA受損，導(dǎo)致雄核發(fā)育的后代存活率很低，從魚苗孵化至開口攝食的存活率在1％至5％左右，而從攝食期至性成熟的存活率尚無確切的報道。
國內(nèi)外水產(chǎn)科技工作者采用雄核發(fā)育技術(shù)或其它方法，獲得過川鰈(Platichthys flesus)、歐洲泥鰍(Misgurnus fossilis)、鮭鱒魚類、紅鯉、團(tuán)頭魴和草魚、斑馬魚、尼羅羅非魚、鰻尾泥鰍、虹鱒等的雄核發(fā)育單倍體胚胎或幼魚，少數(shù)種類養(yǎng)成性成熟的超雄魚(YY，♂)，但由于超雄魚存活率極低，至今，尚未見到建立超雄魚繁育體系的報道，因而未能在漁業(yè)生產(chǎn)上利用超雄魚產(chǎn)生全雄性后代。
本發(fā)明的發(fā)明目的是為克服上述的魚類雄核發(fā)育技術(shù)存在的問題，避免或減少目前人工雄核發(fā)育產(chǎn)生超雄魚技術(shù)的種種弊端，采取全新的技術(shù)路線，大大提高雄核發(fā)育二倍體的孵化率、存活率與生命力，并將一部分超雄魚性轉(zhuǎn)化為生理“雌魚”(YY，♀)，然后通過超雄魚(YY，♀)與生理“雌魚”(YY，♀)交配，生產(chǎn)出大量的超雄魚(YY，♂)后代，在漁業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用超雄魚與普通雌魚(XX，♀)交配，獲得大批量的全雄魚(XY，♂)。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的所采取的技術(shù)措施是超雄魚繁育體系的技術(shù)路線包括如下3個步驟1.人工雄核發(fā)育二倍體的獲得(1)用適當(dāng)濃度的細(xì)胞分裂阻斷劑對性成熟的雄魚進(jìn)行腹腔注射，獲得不減數(shù)的二倍體精子(XX，♂；YY，♂)。
(2)用適當(dāng)濃度的細(xì)胞分裂阻斷劑對性成熟的雜種雄魚進(jìn)行腹腔注射，獲得不減數(shù)的異源二倍體精子(XX，♂，YY，♂)。
(3)用適當(dāng)劑量的γ-射線、紫外線或x-射線照射同種魚性成熟的雌魚卵子，使卵核完全失活。
(4)將二倍體精子與卵核失活的卵子進(jìn)行人工授精，然后在恒溫孵育箱中孵化出魚苗，雄性個體便是人工雄核發(fā)育的超雄魚(YY，♂)。
(5)或?qū)?4)的受精卵發(fā)育至囊胚期的囊胚細(xì)胞用電融合或核移植技術(shù)，將囊胚細(xì)胞核注入同種魚成熟的未受精卵中，然后置恒溫孵育箱中孵化出魚苗，其中的雄性個體便是人工雄核發(fā)育的超雄魚(YY，♂)。
2.生理“雌魚”(YY，♂)的獲得將一部分超雄魚魚苗在開口攝食后的適當(dāng)日齡時，用拌有雌激素的人工飼料喂食適當(dāng)?shù)臅r日，其中的雌性個體便是性轉(zhuǎn)化的生理“雌魚”，其基因型仍然是YY，♀。
3.全部為超雄魚后代的獲得將1、2獲得的超雄魚(YY，♂)與生理“雌魚”(YY，♀)進(jìn)行人工授精，或人工催情自然產(chǎn)卵，便可獲得100％超雄魚后代。
通過1、2、3，三個主要步驟，建立一個超雄魚繁育體系，便可在漁業(yè)生產(chǎn)上利用超雄魚與普通雌魚(XX，♀)交配，生產(chǎn)出100％的全雄魚(XY，♂)，達(dá)到降低成本，提高效益的目的。
本發(fā)明的創(chuàng)新點(diǎn)是(1)采用活體注射適當(dāng)濃度的紡錘絲阻斷劑，產(chǎn)生不減數(shù)二倍體精子，與卵核失活的卵子受精，不需再經(jīng)染色體加倍處理，直接發(fā)育成超雄魚(YY，♂)；(2)采用活體注射適當(dāng)濃度的紡錘絲阻斷劑，產(chǎn)生不減數(shù)的異源二倍體配子，雌、雄配子受精后獲得異源四倍體后代，然后用異源二倍體精子與卵核失活的卵子受精，不需再經(jīng)染色體加倍處理，直接發(fā)育成異源超雄性(YY，♂)；(3)采用電融合或細(xì)胞核移值技術(shù)，將二倍體雄核發(fā)育的囊胚細(xì)胞核注射至成熟的未受精卵中，孵育出正常的超雄性(YY，♂)。
與已有技術(shù)相比較，本發(fā)明采用新的技術(shù)途徑獲得超雄魚的優(yōu)點(diǎn)是(1)采用活體注射細(xì)胞分裂阻斷劑體內(nèi)加倍方法，產(chǎn)生二倍體精子，與目前一般采取理、化方法阻斷雄核發(fā)育單倍體第一次有絲分裂，使染色體加倍，產(chǎn)生二倍體超雄魚的技術(shù)相比較，本發(fā)明的技術(shù)途徑對卵子較少損傷，從而提高孵化率與魚苗的存活率；(2)采用活體注射細(xì)胞分裂阻斷劑體內(nèi)加倍方法，產(chǎn)生異源二倍體精子，提高了二倍體精子基因座位的雜合性，從根本上提高雄核發(fā)育的孵化率、魚苗的存活率和超雄魚的生命力，大大增加超雄魚的獲得率；
(3)采用電融合或細(xì)胞核移植技術(shù)，將雄核發(fā)育二倍體囊胚細(xì)胞核注入成熟的未受精卵，孵出正常的超雄魚，避免了卵細(xì)胞質(zhì)線粒體損傷對胚胎及其后代的長遠(yuǎn)影響，從而提高雄核發(fā)育的孵化率、存活率與生命力，增加超雄魚的獲得率；(4)采用活體注射細(xì)胞分裂阻斷劑體內(nèi)加倍方法，有可能產(chǎn)生二倍體不減數(shù)的配子，受精后獲得同源或異源四倍體后代，如果四倍體是能育的，則可獲得一個人工合成的四倍體新種系，與普通二倍體交配，產(chǎn)生三倍體不育魚，形成一個新的四倍體——三倍體繁育體系，在生產(chǎn)上養(yǎng)殖三倍體不育魚。
本專利技術(shù)基本上適用于任何一種卵生的魚類超雄魚及其繁育體系的開發(fā)。
實(shí)施例泥鰍(Misgurnus anguilicaudatus)超雄魚繁育體系。
已知泥鰍的性染色體為雌魚(♀，XX)，雄魚(♂，XY)1.選擇性成熟的雄性泥鰍在18～24℃水溫條件下，每條按常規(guī)方法注射HCG2001.U.后4～6小時內(nèi)，腹腔注射0.2％秋水仙素0.2～0.4ml，并于2～4小時后擠出成熟的不減數(shù)的二倍體精子(XX，♂，XY，♂)，備用。
2.選擇性成熟(IV期中)的雌性泥鰍，在18～24℃水溫條件下，每條魚注射HCG4001.U.后，并于10～12小時后擠出成熟的未受精卵。
3.將(2)獲得未受精卵置人工合成卵巢液中用100～130mJ/cm2的紫外線輻照處理，使卵核失活，備用。
4.將(1)所得不減數(shù)的二倍體精子與(3)所得的核失活未受精卵進(jìn)行人工授精，受精卵置24℃恒溫箱中，孵出魚苗，然后按常規(guī)養(yǎng)成性成熟個體，其中存活的雄性個體便是人工雄核發(fā)育的超雄魚(YY，♂)。
5.將(4)所得的部份魚苗，在開口攝食的5～7天后，用拌有雌二醇的人工飼料(60mg/kg)喂養(yǎng)6～8周，其中的雌性個體便是性轉(zhuǎn)化的生理“雌魚”，其基因型仍然是YY，♀。
6.將(4)所得超雄魚(YY，♂)與(5)所得的生理“雌魚”(YY，♀)進(jìn)行人工授精，便可獲得100％超雄魚后代(YY，♂)。
通過以上步驟，建立起泥鰍超雄魚繁育體系。
權(quán)利要求
1.一類超雄魚繁育體系的建立技術(shù)，其特征在于選擇性成熟的雄魚按常規(guī)方法注射催產(chǎn)激素后，采用活體注射一定濃度細(xì)胞分裂阻斷劑，產(chǎn)生不減數(shù)同源二倍體精子；同時，按同樣處理獲得不減數(shù)異源二倍體精子；另將成熟的未受精卵經(jīng)射線處理成卵核失活卵子，將不減數(shù)同源或異源二倍體精子與卵核失活卵子受精后獲得雄核發(fā)育囊胚期胚胎，再采用電融合或細(xì)胞核移值技術(shù)，將二倍體雄核發(fā)育的囊胚細(xì)胞核注射至成熟的未受精卵中，孵育出正常的超雄魚魚苗，將一部分超雄魚魚苗，經(jīng)激素處理性轉(zhuǎn)化成生理雌魚，最后，由超雄魚與生理雌魚交配，產(chǎn)生100％超雄魚后代。由此，建立起超雄魚繁育體系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的超雄魚繁育體系的建立技術(shù)，其特征在于超雄魚繁育的具體繁育控制條件如下(1)選擇性成熟的雄魚按常規(guī)方法注射催產(chǎn)激素后6～10小時內(nèi)，腹腔注射0.2％秋水仙素0.1～0.6ml或0.01％的細(xì)胞松馳素-B0.1～0.6ml，并于4～8小時后擠出成熟的不減數(shù)的二倍體精子即XX，♂；YY，♂，備用；(2)按(1)方法對性成熟的雜種雄魚進(jìn)行腹腔注射，獲得不減數(shù)的異源二倍體精子即XX♂，YY♂，備用；(3)選擇IV期中性成熟的雌魚，在20～28℃水溫條件下，按常規(guī)注射催產(chǎn)激素，獲得未受精卵，然后在人工合成卵巢液中用15000～25000rad的γ-射線或7500～12000rad x-射線或100～250mJ/cm2的紫外線輻照處理，使卵核失活，備用。(4)用(1)、(2)不減數(shù)的二倍體精子與(3)卵核失活的未受精卵，按常規(guī)進(jìn)行人工授精，受精卵置22～28℃恒溫箱孵育出魚苗，然后按常規(guī)養(yǎng)成性成熟的個體，其中雄體個體便是人工雄核發(fā)育的超雄魚即YY，♂；(5)或?qū)?4)的受精卵發(fā)育至囊胚期的囊胚細(xì)胞按常規(guī)用電融合或核移植技術(shù)，將囊胚細(xì)胞核注入同種魚的成熟未受精卵中，然后置22～28℃恒溫箱中孵出魚苗后養(yǎng)成性成熟的個體，其中雄性個性便是人工雄核發(fā)育的超雄魚即YY，♂；(6)將(4)、(5)所得的部分魚苗，在開口攝食的一周內(nèi)，用拌有為含量25～120mg/kg雌二醇或含量為25～200mg/kg苯甲基雌二醇的飼料喂養(yǎng)6～8周，然后按常規(guī)養(yǎng)成性成熟的雌魚，便是性轉(zhuǎn)化的生理“雌魚”即YY，♀；(7)將(4)、(5)所得的超雄魚與(6)所得的生理“雌魚”即YY，♀，進(jìn)行人工授精，便可獲得100％超雄魚后代即YY，♂，由此建立起超雄魚繁育體系。
全文摘要
本發(fā)明公開了超雄魚繁育體系的建立技術(shù),采用活體注射一定濃度的阻斷劑,產(chǎn)生不減數(shù)同源或異源二倍體精子;將同源或異源二倍體精子與卵核失活卵子受精后的雄核發(fā)育囊胚細(xì)胞核注射至成熟未受精卵中,直接發(fā)育成同源或異源超雄魚魚苗,將一部分超雄魚苗性轉(zhuǎn)化成生理“雌魚”,最后,由超雄魚與生理“雌魚”交配,孵育出正常的100%超雄魚后代。本發(fā)明對人工培育新魚種、漁業(yè)規(guī)模生產(chǎn)養(yǎng)殖全雄魚、保護(hù)種質(zhì)資源具有巨大作用。
文檔編號A01K61/00GK1340298SQ0011597
公開日2002年3月20日 申請日期2000年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2000年8月25日
發(fā)明者陳宏溪, 崔書勤, 郭海 申請人:武漢康祥科技發(fā)展有限公司