本發(fā)明涉及棉花組織培育領(lǐng)域，具體涉及一種棉花愈傷快速誘導(dǎo)增殖的處理方法.

背景技術(shù)：

在棉花組織培育技術(shù)中，棉花愈傷培育是實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌侵染或基因槍轉(zhuǎn)基因后體細(xì)胞培育第一個(gè)關(guān)鍵步驟，該技術(shù)決定著棉花愈傷形成的效率的高低，直接影響后續(xù)幼苗誘導(dǎo)形成、植株發(fā)育等試驗(yàn)階段.

因此，在組織培育中，提高棉花愈傷誘導(dǎo)增殖有利于縮短棉花再生植株培育時(shí)間.在試驗(yàn)過(guò)程中，棉花通過(guò)組織培育技術(shù)多用于利用轉(zhuǎn)基因棉花的植株再生，目的是將外源目的基因轉(zhuǎn)入常規(guī)棉花中，從而培育具有目的基因的棉花新種質(zhì)資源，其常規(guī)組織培養(yǎng)方法為：培育棉花無(wú)菌苗，下胚軸切成1厘米的小段，利用攜帶外源目的基因的農(nóng)桿菌侵染受體棉花下胚軸，或者非侵染的下胚軸.共培養(yǎng)后放入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，愈傷分化成胚狀體即胚型愈傷，胚型愈傷分化生成再生株，再生株移植等環(huán)節(jié).其中，在整個(gè)愈傷培養(yǎng)過(guò)程中，愈傷生長(zhǎng)增殖是組織培養(yǎng)的重要環(huán)節(jié)，該環(huán)節(jié)直接決定試驗(yàn)過(guò)程中愈傷繼代時(shí)間和次數(shù)，以及后續(xù)分化誘導(dǎo)等試驗(yàn)進(jìn)程。

其常規(guī)愈傷繼代方法為：下胚軸放入愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，在16小時(shí)白光光照，8小時(shí)黑暗條件下，恒溫28度，誘導(dǎo)下胚軸愈傷生長(zhǎng)，期間根據(jù)培養(yǎng)基中養(yǎng)分的消耗，約每2-3月?lián)Q一次愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基，增殖期間則培養(yǎng)基換2次/月，直至愈傷生長(zhǎng)到一定大小后，取下愈傷繼續(xù)培養(yǎng)直至有胚性愈傷出現(xiàn)后誘導(dǎo)分化，該時(shí)間一般為8個(gè)月以上，甚至1年以上，因此愈傷誘導(dǎo)在棉花 組織培養(yǎng)中是時(shí)間花費(fèi)最長(zhǎng)的一個(gè)階段.期間愈傷由于長(zhǎng)時(shí)間光照容易變綠色，并造成愈傷硬化和生長(zhǎng)較慢.

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種棉花愈傷快速誘導(dǎo)增殖的處理方法，其可有效加快棉花愈傷生長(zhǎng)，同時(shí)降低了愈傷硬化和變綠.

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種棉花愈傷快速誘導(dǎo)增殖的處理方法，包括步驟如下：

S1、利用質(zhì)量百分比為15％的雙氧水(過(guò)氧化氫)消毒處理棉花種子半小時(shí)，倒去雙氧水，在超凈臺(tái)用滅菌水清洗2-3次洗凈雙氧水后，用滅菌水浸泡種子24小時(shí)，露白后種入MS培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)生長(zhǎng)7天，得無(wú)菌幼苗；

S2、取所得無(wú)菌幼苗的下胚軸，切段約1厘米，農(nóng)桿菌侵染5-10分鐘后，倒掉農(nóng)桿菌菌液，用無(wú)菌濾紙吸干殘留菌液，轉(zhuǎn)移放入共培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，具體配方為MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)；

S3、共培養(yǎng)結(jié)束后，將所得的棉花下胚軸放入含有抗性篩選的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，置于波長(zhǎng)為660nm，光照強(qiáng)度為200-400勒克斯的單色紅光下，16小時(shí)紅光光照，8小時(shí)黑暗，間隔進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)1-2個(gè)月，期間根據(jù)需要換新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

S4、待愈傷生長(zhǎng)約黃豆顆粒大小時(shí)，將獲得的愈傷取下轉(zhuǎn)入新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體配方為MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，直至形成胚型愈傷。在整個(gè)愈傷誘導(dǎo)期間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)的人生長(zhǎng)效率及觀測(cè)愈傷顏色變化并比較.

本發(fā)明具有以下有益效果：

加快棉花愈傷生長(zhǎng)，同時(shí)降低了愈傷硬化和變綠.

表1不同光條件下不同時(shí)間內(nèi)愈傷誘導(dǎo)生長(zhǎng)效率及變綠初步統(tǒng)計(jì)

注：期間淘汰抗性篩選條件下無(wú)愈傷生長(zhǎng)的莖段.

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明.應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明.

本發(fā)明實(shí)施例提供了一種棉花愈傷快速誘導(dǎo)增殖的處理方法，包括步驟如下：

S1、利用質(zhì)量百分比為15％的雙氧水(過(guò)氧化氫)消毒處理棉花種子半小時(shí)，倒去雙氧水，在超凈臺(tái)用滅菌水清洗2-3次洗凈雙氧水后，用滅菌水浸泡種子24小時(shí)，露白后種入MS培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)生長(zhǎng)7天，得無(wú)菌幼苗；

S2、取所得無(wú)菌幼苗的下胚軸，切段約1厘米，利用含有基因載體的農(nóng)桿菌侵染5-10分鐘后，倒掉農(nóng)桿菌菌液，用無(wú)菌濾紙吸干殘留菌液，轉(zhuǎn)移放入共培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)；

S3、共培養(yǎng)結(jié)束后，將所得的棉花下胚軸放入含有抗性篩選的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，置于波長(zhǎng)為660nm，光照強(qiáng)度為200-400勒克斯的單色紅光下，16小時(shí)紅光光照，8小時(shí)黑暗，間隔進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)1-2個(gè)月，期間根據(jù)需要換新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

S4、待愈傷生長(zhǎng)約黃豆顆粒大小時(shí)，將獲得的愈傷取下轉(zhuǎn)入新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、篩選劑、頭孢0.5g/L，直至形成胚型愈傷.在整個(gè)愈傷誘導(dǎo)期間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)的人生長(zhǎng)效率及觀測(cè)愈傷顏色變化并比較.

實(shí)施例1

已轉(zhuǎn)phyB-RNAi基因?yàn)槔?/p>

S1、利用15％雙氧水過(guò)氧化氫消毒處理棉花種子半小時(shí)，倒去雙氧水，在超凈臺(tái)用滅菌水清洗2-3次洗凈雙氧水后，用滅菌水浸泡種子24小時(shí)，露白后種入MS培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)生長(zhǎng)7天，得無(wú)菌幼苗；

S2、取所得無(wú)菌幼苗的下胚軸，切段約1厘米，利用含有phyB-RNAi基因載體的農(nóng)桿菌侵染5-10分鐘后，倒掉農(nóng)桿菌菌液，用無(wú)菌濾紙吸干殘留菌液，轉(zhuǎn)移放入共培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)；

S 3、共培養(yǎng)結(jié)束后，將所得的棉花下胚軸放入含有抗性篩選的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，置于波長(zhǎng)為660nm，光照強(qiáng)度為200-400勒克斯的單色紅光下，16小時(shí)單色紅光光照，8小時(shí)黑暗，間隔進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)1-2個(gè)月，期間根據(jù)需要換新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

S4、待愈傷生長(zhǎng)約黃豆顆粒大小時(shí)，將獲得的愈傷取下轉(zhuǎn)入新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，直至形成胚型愈傷.在整個(gè)愈傷誘導(dǎo)期間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)的人生長(zhǎng)效率及觀測(cè)愈傷顏色變化并比較.

對(duì)比例

實(shí)施例2

已轉(zhuǎn)P105載體基因?yàn)槔?/p>

S1、利用質(zhì)量百分比為15％的雙氧水過(guò)氧化氫消毒處理棉花種子半小時(shí)， 倒去雙氧水，在超凈臺(tái)用滅菌水清洗2-3次洗凈雙氧水后，用滅菌水浸泡種子24小時(shí)，露白后種入MS培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)生長(zhǎng)7天，得無(wú)菌幼苗；

S2、取所得無(wú)菌幼苗的下胚軸，切段約1厘米，利用含有P105基因載體的農(nóng)桿菌侵染5-10分鐘后，倒掉農(nóng)桿菌菌液，用無(wú)菌濾紙吸干殘留菌液，轉(zhuǎn)移放入共培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗條件下共培養(yǎng)48小時(shí)；

S3、共培養(yǎng)結(jié)束后，將所得的棉花下胚軸放入含有抗性篩選的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，置于波長(zhǎng)為660nm，光照強(qiáng)度為200-400勒克斯的單色紅光下，16小時(shí)紅光光照，8小時(shí)黑暗，間隔進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)1-2個(gè)月，期間根據(jù)需要換新鮮愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基；

S4、待愈傷生長(zhǎng)約黃豆顆粒大小時(shí)，將獲得的愈傷取下轉(zhuǎn)入新鮮誘導(dǎo)培養(yǎng)基，具體配方為MS(4g/L、KNO3(1g/L、葡萄糖25g/L、瓊脂(6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、頭孢0.5g/L，直至形成胚型愈傷.在整個(gè)愈傷誘導(dǎo)期間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)愈傷誘導(dǎo)的人生長(zhǎng)效率及觀測(cè)愈傷顏色變化并比較。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。