本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種利用三七愈傷組織產(chǎn)生紫色素的方法。
背景技術(shù)：
：三七為五加科人參屬植物，有“金不換”、“南國神草”、“參中之王”等美譽(yù)，是云南特有的名貴中藥材，也是我國中醫(yī)藥中一顆璀璨的明珠。三七紫色素為一種存在于三七植株莖、葉、花及根的細(xì)胞液中的化合物，使植株呈現(xiàn)出紅、紫紅、蘭等不同顏色。三七紫色素的本質(zhì)為花色苷，花色苷是類黃酮--以黃酮核為基礎(chǔ)的一類物質(zhì)中能呈現(xiàn)紅色的一族化合物。由于它具有獨(dú)特的功能性，而被應(yīng)用于清除體內(nèi)自由基、增殖葉黃素、抗腫瘤、抗癌、抗炎、抑制脂質(zhì)過氧化和血小板凝集、預(yù)防糖尿病、減肥、保護(hù)視力等。花色苷作為一種天然色素，安全、無毒，且對(duì)人體具有許多保健功能，已被應(yīng)用于食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥等行業(yè)。然而，目前并無關(guān)于三七紫色素的利用與開發(fā)的相關(guān)文獻(xiàn)及報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種通過組織培養(yǎng)手段培養(yǎng)出富含紫色素的三七愈傷組織，并利用其提取紫色素。本發(fā)明提供的技術(shù)方案：一種利用三七愈傷組織產(chǎn)生紫色素的方法，以三七植株幼嫩的莖、葉、花或花藥作為外植體，經(jīng)過滅菌、接種、誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生愈傷組織，對(duì)愈傷組織進(jìn)行二次滅菌、接種及繼代培養(yǎng)得到傳代愈傷組織，并從傳代愈傷組織中提取所述紫色素；其中所述的誘導(dǎo)培養(yǎng)中的光照控制為4～8小時(shí)光照條件和4～8小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行；所述繼代培養(yǎng)的光照控制為10～15小時(shí)光照條件和10～15小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行。進(jìn)一步的，所述愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+0.1～2mg/L2,4-D+0.1～2mg/LBA+0.002～1mg/LTDZ+30～60g/L蔗糖(即：在每一升的MS培養(yǎng)基中添加0.1～2mg2,4-D、0.1～2mgBA、0.002～1mgTDZ和30～60g蔗糖)；或MS+0.1～2mg/LNAA+0.1～2mg/LBA+0.002～1mg/LTDZ+30～60g/L蔗糖(即：在每一升的MS培養(yǎng)基中添加0.1～2mgNAA、0.1～2mgBA、0.002～1mgTDZ和30～60g蔗糖)。所述MS為MS培養(yǎng)基，NAA為萘乙酸，2，4-D為2,4-二氯苯氧乙酸，BA為芐氨基腺嘌呤，TDZ為噻苯隆。進(jìn)一步的，所述愈傷組織繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為：MS+0.1～2mg/LNAA+0.1～2mg/LBA+0.002～4mg/LTDZ(即：在每一升的MS培養(yǎng)基中添加0.1～2mgNAA、0.1～2mgBA和0.002～1mgTDZ)。進(jìn)一步的，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1500—2000lx。進(jìn)一步的，所述繼代培養(yǎng)的光照強(qiáng)度為1000—1500lx。進(jìn)一步的，所述的愈傷組織的大小為直徑1～2cm。進(jìn)一步的，所述紫色素的提取方法包括溶劑提取、超聲提取、超臨界流體萃取、微波提取中的一種或多種。進(jìn)一步的，還包括對(duì)所述紫色素的純化處理。進(jìn)一步的，所述的純化處理包括萃取、重結(jié)晶、柱層析分離，大孔樹脂分離、離子樹脂分離中的一種或多種組合。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過對(duì)光照時(shí)間、培養(yǎng)基、濕度、溫度等條件控制，培養(yǎng)出富含紫色素、誘導(dǎo)率高的愈傷組織。本發(fā)明通過縮短光照與黑暗的交替時(shí)間的方法有效的提高了三七紫色素的含量，并在培養(yǎng)基中加入TDZ及與其他植物激素的搭配，使三七愈傷組織的誘導(dǎo)率明顯提高，并有利于紫色素的形成。同時(shí)本發(fā)明也對(duì)愈傷組織進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，使誘導(dǎo)出的愈傷組織避免分化，形成大量增殖的愈傷組織，并對(duì)繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基及環(huán)境控制、對(duì)光照時(shí)間、濕度、溫度等條件控制，培養(yǎng)出富含紫色素、增殖率高的愈傷組織。本發(fā)明誘導(dǎo)培養(yǎng)的三七愈傷組織紫色素含量高，誘導(dǎo)率高，增殖率高。本發(fā)明利用組織培養(yǎng)繁殖效率高、生長周期短的優(yōu)點(diǎn)，建立適合三七紫色素愈傷組織生長的組培條件，從而提供大量的優(yōu)質(zhì)的富含紫色素的愈傷組織，為從三七愈傷組織中提取紫色素提供物質(zhì)基礎(chǔ)，有利于自動(dòng)化、規(guī)模化生產(chǎn),提高生產(chǎn)效率。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種利用三七愈傷組織產(chǎn)生紫色素的方法，包括以下步驟：選取健康的三七植株幼嫩的莖、葉、花作為外植體，用清水沖洗5次，先用70％的酒精滅菌10s，用無菌水沖洗3次后，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1％的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗6次，備用。在無菌環(huán)境中將經(jīng)過滅菌的莖、葉、花切割為0.5cm2的塊狀外植體；在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的外植體接種到培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種3～5塊外植體。在MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ+30g/L蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)周期為4—5周。其中，光照控制為4小時(shí)光照條件和4小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行，光照強(qiáng)度為1500lx；溫度：22℃；空氣相對(duì)濕度：50％。選取生長至直徑1cm的三七愈傷組織，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基上，其中，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ，培養(yǎng)4周，得到傳代愈傷組織。其中，光照控制為10小時(shí)光照、10小時(shí)黑暗，交替進(jìn)行，光照控制的光強(qiáng)度為1000lx。繼代培養(yǎng)的溫度為22℃；空氣相對(duì)濕度：50％。將培養(yǎng)得到的傳代愈傷組織用有機(jī)溶劑乙醇進(jìn)行溶劑提取和超聲提取，并進(jìn)行萃取、重結(jié)晶純化得到紫色素。實(shí)施例2一種利用三七愈傷組織產(chǎn)生紫色素的方法，包括以下步驟：選取健康的三七植株幼嫩的莖、葉、花作為外植體，用清水沖洗6次，先用70％的酒精滅菌10s，用無菌水沖洗3次后，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1％的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗8次，備用。在無菌環(huán)境中將經(jīng)過滅菌的莖、葉、花切割為0.5cm2的塊狀外植體；在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的外植體接種到培養(yǎng)基上，每瓶培養(yǎng)基接種5塊外植體。其中的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2mg/L2,4-D+2mg/LBA+1mg/LTDZ+60g/L蔗糖。其中，光照控制為8小時(shí)光照條件和8小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,光照強(qiáng)度為2000lx；溫度：25℃；空氣相對(duì)濕度：80％；培養(yǎng)周期為5周。選取生長至直徑1-2cm的三七愈傷組織，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基上，其中，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+2mg/LNAA+2mg/LBA+4mg/LTDZ,培養(yǎng)5周。其中，光照控制為15小時(shí)光照、15小時(shí)黑暗，交替進(jìn)行，光照控制的光強(qiáng)度為1500lx。繼代培養(yǎng)的溫度為25℃；空氣相對(duì)濕度：80％。將培養(yǎng)得到的傳代愈傷組織進(jìn)行超聲提取，并用柱層析分離的方法純化得到紫色素。實(shí)施例3一種利用三七愈傷組織產(chǎn)生紫色素的方法，包括以下步驟：選取健康的三七的花藥作為外植體，將三七花清水沖洗5次，先用70％的酒精滅菌10s，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1％的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗6次，備用。在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?；在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將花藥接種到組培瓶中，每瓶15粒；在MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.002mg/LTDZ+30g/L蔗糖，的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。其中，光照控制為6小時(shí)光照條件和6小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行，光照強(qiáng)度為1600lx；溫度：22℃；空氣相對(duì)濕度：50％，培養(yǎng)周期為6周。選取生長至直徑2cm的三七愈傷組織，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基上，其中，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+1mg/LNAA+1.2mg/LBA+0.08mg/LTDZ，培養(yǎng)4周。其中，光照控制為12小時(shí)光照、12小時(shí)黑暗，交替進(jìn)行，光照控制的光強(qiáng)度為1200lx。繼代培養(yǎng)的溫度為23℃；空氣相對(duì)濕度：60％。將培養(yǎng)得到的傳代愈傷組織進(jìn)行超臨界流體萃取方法提取，并用大孔樹脂及柱層析分離的方法純化得到紫色素。實(shí)施例4一種利用三七愈傷組織產(chǎn)生紫色素的方法，包括以下步驟：選取健康的三七的花藥作為外植體，將三七花清水沖洗6次，先用70％的酒精滅菌10s，再將沖洗后的外植體置于濃度為0.1％的升汞中，浸泡滅菌，無菌去離子水沖洗8次，備用。在無菌濾紙上剝?nèi)』ㄋ?；在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將花藥接種到組培瓶中，每瓶20粒；在MS+2mg/LNAA+2mg/LBA+1mg/LTDZ+60g/L蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。其中，光照控制為5小時(shí)光照條件和5小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行，光照強(qiáng)度為1700lx；溫度:25℃；空氣相對(duì)濕度:80％，培養(yǎng)周期為7周。選取生長至直徑2cm的三七愈傷組織，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到繼代培養(yǎng)基上，其中，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS+0.8mg/LNAA+0.5mg/LBA+2mg/LTDZ，培養(yǎng)4周。其中，光照控制為13小時(shí)光照、13小時(shí)黑暗，交替進(jìn)行，光照控制的光強(qiáng)度為1400lx。繼代培養(yǎng)的溫度為23℃；空氣相對(duì)濕度：60％。將培養(yǎng)得到的傳代愈傷組織進(jìn)行微波方法提取，并用離子樹脂的方法純化得到紫色素。不同植物激素對(duì)三七愈傷組織的誘導(dǎo)率及紫色素含量的影響試驗(yàn)：選取4組健康的三七植株幼嫩的莖作為外植體，經(jīng)過相同的滅菌處理，分別接種于4組誘導(dǎo)培養(yǎng)基：(1)MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+30g/L蔗糖、(2)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+30g/L蔗糖、(3)MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖、(4)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖。在相同的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，其中光照控制為8小時(shí)光照條件和8小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,光照強(qiáng)度為2000lx；溫度：25℃；空氣相對(duì)濕度：80％；培養(yǎng)5周后對(duì)其誘導(dǎo)率及紫色素的含量進(jìn)行測試。表1，不同植物激素對(duì)三七愈傷組織的誘導(dǎo)率及紫色素含量編號(hào)2,4-DNAABATDZ誘導(dǎo)率紫色素含量10.100.108％1％200.10.106％2％30.100.10.148％18％400.10.10.151％19％從表1的結(jié)果可以看出，TDZ的添加能明顯提高三七的誘導(dǎo)愈傷組織的誘導(dǎo)率，有利于愈傷組織的增殖及富含紫色素愈傷組織的誘導(dǎo)，使其紫色素的含量明顯提高。不同植物激素對(duì)三七愈傷組織的繼代培養(yǎng)增殖率及紫色素含量的影響試驗(yàn)：選取3組相同的三七愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，分別將切好的愈傷組織接種到3組不同的繼代培養(yǎng)基上，其中，繼代培養(yǎng)基分別為：(1)MS+0.1mg/LTDZ、(2)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA及(3)MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ。在相同的環(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，其中光照控制為12小時(shí)光照條件和12小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,光照強(qiáng)度為1000lx；溫度：25℃；空氣相對(duì)濕度：80％；培養(yǎng)5周后對(duì)其增殖率及紫色素的含量進(jìn)行測試。表2，不同植物激素對(duì)三七愈傷組織的繼代培養(yǎng)的增殖率及紫色素含量編號(hào)NAABATDZ增殖率紫色素含量1000.112％8％20.10.1042％1％30.10.10.172％19％從表2的結(jié)果可以看出，TDZ的添加能明顯有利于三七的愈傷組織的繼代培養(yǎng)，能明顯提高愈傷組織的增殖率及愈傷組織中紫色素的含量，獲得高增殖率及紫色素含量高的愈傷組織。TDZ與NAA和BA的協(xié)同作用有利于愈傷組織的增殖與生長，及紫色素的產(chǎn)生。不同光照條件對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率及紫色素含量的影響試驗(yàn)：選取6組健康的三七植株幼嫩的莖作為外植體，經(jīng)過相同的滅菌處理，接種于相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖中。對(duì)其進(jìn)行不同的光照處理，分別為(1)4小時(shí)光照條件和4小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(2)6小時(shí)光照條件和6小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(3)8小時(shí)光照條件和8小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(4)12小時(shí)光照條件和12小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(5)24小時(shí)光照條件和24小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(6)36小時(shí)光照條件和36小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行。6組的光照強(qiáng)度為2000lx；溫度：25℃；空氣相對(duì)濕度：80％；培養(yǎng)5周后對(duì)其誘導(dǎo)率及紫色素的含量進(jìn)行測試。表3，不同光照條件對(duì)三七愈傷組織的誘導(dǎo)率及紫色素含量光照交替時(shí)間468122436誘導(dǎo)率32％48％39％24％20％18％紫色素含量14％18％12％5％1％1％從表3的結(jié)果可以看出，使用光照與黑暗交替的光照條件能有效提高三七愈傷組織中紫色素的形成，其中縮短光照與黑暗的交替時(shí)間與愈傷組織中紫色素的含量成正比。不同光照條件對(duì)愈傷組織的繼代培養(yǎng)的增殖率及紫色素含量的影響試驗(yàn)：選取6組相同的三七愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ的繼代培養(yǎng)基上，對(duì)其進(jìn)行不同的光照處理，分別為(1)5小時(shí)光照條件和5小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(2)10小時(shí)光照條件和10小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(3)12小時(shí)光照條件和12小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(4)15小時(shí)光照條件和15小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(5)20小時(shí)光照條件和20小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行,(6)30小時(shí)光照條件和30小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行。6組的光照強(qiáng)度為1000lx；溫度：25℃；空氣相對(duì)濕度：80％；培養(yǎng)5周后對(duì)其增殖率及紫色素的含量進(jìn)行測試。表4，不同光照條件對(duì)三七愈傷組織的繼代培養(yǎng)的增殖率及紫色素含量光照交替時(shí)間51012152030增殖率36％48％70％62％36％30％紫色素含量8％18％19％13％5％3％從表4的結(jié)果可以看出，使用光照與黑暗交替的光照條件與三七愈傷組織中紫色素的形成有影響，其中12小時(shí)光照條件和12小時(shí)黑暗條件最有利于紫色素的形成，紫色素的含量最高，同時(shí)還提高了三七愈傷組織繼代培養(yǎng)的增殖率。不同光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率及紫色素含量的影響試驗(yàn)：選取5組健康的三七植株幼嫩的莖作為外植體，經(jīng)過相同的滅菌處理，接種于相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中：MS+0.1mg/L2,4-D+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ+30g/L蔗糖，置于溫度：25℃；空氣相對(duì)濕度：80％；6小時(shí)光照條件和6小時(shí)黑暗條件交替進(jìn)行的環(huán)境中,。其中，5組的光照強(qiáng)度分別為800lx，1500lx，2000lx，2500lx；培養(yǎng)5周后對(duì)其誘導(dǎo)率及紫色素的含量進(jìn)行測試。表5，不同光照強(qiáng)度對(duì)三七愈傷組織的誘導(dǎo)率及紫色素含量光照強(qiáng)度8001500200025003000誘導(dǎo)率9％48％51％24％12％紫色素含量3％18％19％2％1％從表5的結(jié)果可以看出，光照強(qiáng)度為1500lx，2000lx的條件下有利于提高三七愈傷組織中紫色素的形成。不同光照強(qiáng)度對(duì)愈傷組織的繼代培養(yǎng)的增殖率及紫色素含量的影響試驗(yàn)：選取5組相同的三七愈傷組織進(jìn)行繼代培養(yǎng)，在無菌環(huán)境中將三七愈傷組織分割成0.5mm2的方型小塊，在無菌的條件下，在酒精燈火焰附近打開組培瓶，瓶口在火焰上灼燒一下，將切好的愈傷組織接種到MS+0.1mg/LNAA+0.1mg/LBA+0.1mg/LTDZ的繼代培養(yǎng)基上，其中，5組的光照強(qiáng)度分別為800lx，1000lx，1500lx，2000lx，2500lx；培養(yǎng)5周后對(duì)其增殖率及紫色素的含量進(jìn)行測試。表6，不同光照強(qiáng)度對(duì)三七愈傷組織的繼代培養(yǎng)的增殖率及紫色素含量光照強(qiáng)度80010001500200025003000增殖率52％70％72％42％32％12％紫色素含量3％18％19％5％2％0.5％從表6的結(jié)果可以看出，不同光照強(qiáng)度與三七愈傷組織中紫色素的形成有明顯的影響，其中1000lx～1500lx的光照強(qiáng)度最有利于紫色素的形成，紫色素的含量最高，同時(shí)還提高了三七愈傷組織繼代培養(yǎng)的增殖率。當(dāng)前第1頁1 2 3