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技術特征:

1.溫室白粉虱在從感染番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒的病株中分離番茄褪綠病毒的應用。

2.如權利要求1所述的應用,其特征在于,包括如下步驟:

(1)將溫室白粉虱用被番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒侵染的番茄病株飼喂,制得染毒溫室白粉虱;

(2)用步驟(1)制得的染毒溫室白粉虱侵染番茄健康植株,制得感染番茄褪綠病毒的番茄植株。

3.如權利要求2所述的應用,其特征在于,所述步驟(1)中的溫室白粉虱為初羽化的溫室白粉虱。

4.如權利要求2所述的應用,其特征在于,所述步驟(1)中的飼喂步驟如下:

將溫室白粉虱放入直徑1.5cm的微蟲籠中,置于番茄病株從頂部數(shù)第二片葉上,待溫室白粉虱全部飛至番茄葉片上計時,飼喂24h以上。

5.如權利要求2所述的應用,其特征在于,所述步驟(2)中的侵染步驟如下:

將步驟(1)制得的染毒溫室白粉虱置于微蟲籠中,然后固定于番茄苗從頂部數(shù)第二片葉上,待溫室白粉虱全部飛到葉片上,開始計時,24h后,將溫室白粉虱取出,即得。

6.如權利要求2所述的應用,其特征在于,還包括對步驟(1)制得的染毒溫室白粉虱進行體內(nèi)ToCV和TYLCV檢測的步驟。

7.如權利要求6所述的應用,其特征在于,所述體內(nèi)ToCV檢測具體步驟如下:

將溫室白粉虱置于液氮冷凍5s,然后用去RNase的研磨棒進行充分研磨后,再加入1mLTrizol試劑,并按照Trizol提取RNA法的說明書完成溫室白粉虱總RNA的提取,取1μg總RNA,通過cDNA反轉錄試劑盒完成第一鏈cDNA的合成;

根據(jù)ToCV基因組序列設計一對檢測引物:

上游引物ToCV-F:GGGGAATGTGCGTTTAAAGA;SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-R:GAACCAAATCAACGCGATCT;SEQ ID NO.2

ToCV檢測反應體系為:

10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL;

PCR反應程序為:94℃預變性3min;94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35個循環(huán);72℃后延伸7min后,將樣品進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)目的條帶有無判斷溫室白粉虱是否成功獲取ToCV。

8.如權利要求6所述的應用,其特征在于,所述體內(nèi)TYLCV檢測具體步驟如下:

將溫室白粉虱置于液氮冷凍5s,然后用去RNase的研磨棒進行充分研磨后,按照動物組織DNA提取試劑盒說明書步驟完成蟲體基因組DNA的提?。?/p>

TYLCV檢測引物如下:

上游引物TYLCV-F:CGCCCGTCTCGAAGGTTC;SEQ ID NO.3

下游引物TYLCV-R:GCCATATACAATAACAAGGC;SEQ ID NO.4

TYLCV檢測反應體系:

10×PCR Buffer 2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL;

PCR反應程序:94℃預變性3min;94℃變性30s,58℃退火30s,72℃延伸50s,35個循環(huán);72℃后延伸7min后,將樣品進行瓊脂糖凝膠電泳,根據(jù)目的條帶有無判斷溫室白粉虱是否成功獲取TYLCV。

9.如權利要求2所述的應用,其特征在于,還包括對步驟(2)制得的感染番茄褪綠病毒的番茄植株進行檢測的步驟,具體步驟如下:

將感染番茄褪綠病毒的番茄植株放入人工氣候室,在27℃,RH 60%,L:D=14:10的條件下培養(yǎng)一個月,觀察發(fā)病情況。

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