一種鑒別煙粉虱隱種和白粉虱的引物及鑒別方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種鑒別煙粉虱隱種和白粉虱的引物及鑒別方法。一種鑒別煙粉虱MEAM1隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物，所述引物為一對，分別為SEQ?ID?NO.1和SEQ?ID?NO.2所示的核苷酸序列。本發(fā)明還涉及利用上述引物鑒別煙粉虱隱種和白粉虱的方法。本發(fā)明所述鑒別煙粉虱MEAM1隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物能夠擴(kuò)增煙粉虱MEAM1隱種和煙粉虱MED隱種基因組DNA中的BtabCSP2基因，而對白粉虱基因組DNA沒有擴(kuò)增作用，為鑒定煙粉虱MEAM1隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決了現(xiàn)有煙粉虱MEAM1隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱鑒定較繁瑣的問題。
【專利說明】一種鑒別煙粉虱隱種和白粉虱的引物及鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種鑒別煙粉虱隱種和白粉虱的引物及鑒別方法，特別涉及一種鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物及鑒別方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]煙粉風(fēng)(Bemisatabaci)和白粉風(fēng)(Trialeurodes vaporariorum)是兩種世界性的雜食性害蟲。白粉虱一直是我國北方重要的農(nóng)業(yè)害蟲。自20世紀(jì)90年代末期以來，煙粉虱在我國廣大地區(qū)突然大面積暴發(fā)成災(zāi)。兩種粉虱除直接危害農(nóng)作物外，還傳播多種重要的植物病毒病。在我國北方地區(qū)，它們寄主重疊、危害習(xí)性相同、生活史也十分相近，且體型微小、外形相似，經(jīng)常同域發(fā)生，僅靠外部形態(tài)很難區(qū)分。
[0003]煙粉虱是一種包含30多個(gè)隱種的物種復(fù)合體。在世界范圍內(nèi)分布并造成嚴(yán)重危害的是煙粉虱MEAMl隱種和MED隱種，從2000年前后傳入我國并迅速擴(kuò)散，到2009年在我國除重慶、西藏和遼寧之外所有省市均發(fā)現(xiàn)MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱，在南方及東南沿海地區(qū)以MEAMl隱種煙粉虱為主，在長江流域和東部沿海地區(qū)以MED隱種為主。[0004]由于長期使用農(nóng)藥，MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱對常見農(nóng)藥都產(chǎn)生了抗藥性，包括有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類、生長調(diào)節(jié)劑類及新煙堿類。MED隱種煙粉虱對吡蟲啉、噻蟲嗪等新煙堿類殺蟲劑抗性較高，而MEAMl隱種煙粉虱較為敏感，針對不同煙粉虱隱種應(yīng)該制定相應(yīng)的防治策略。因此開發(fā)MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱快速準(zhǔn)確的鑒定方法對于有效防控?zé)煼凼哂兄匾饬x。
[0005]MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱在寄主范圍、傳毒能力及抗藥性方面存在差異，但在外形上難以區(qū)分，目前主要依靠分子生物學(xué)方法鑒定，包括mtCOI測序、RAPD, AFLP, SSR和SCAR，其中最常用的是mtCOI測序法。mtCOI方法需要進(jìn)行測序，費(fèi)用較高，而且時(shí)間長。
[0006]限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-RFLP)技術(shù)，又稱為酶切位點(diǎn)多態(tài)性序列(CSPS)技術(shù)，是利用已知DNA序列設(shè)計(jì)特異性引物來擴(kuò)增一段DNA片段，再利用限制性內(nèi)切酶對PCR產(chǎn)物進(jìn)行消化，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，進(jìn)行RFLP分析。該技術(shù)是以已知DNA序列上酶切位點(diǎn)的分布為基礎(chǔ)，能揭示單個(gè)堿基的差異，因此非常適合鑒別MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱這種DNA差異較小的物種。Khansdan等(2005)曾利用mtCOI和核鈉離子通道基因?yàn)榛A(chǔ)開發(fā)了鑒別MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱的方法，由于所擴(kuò)DNA片段均大于800bp，所以擴(kuò)增成功的難度較大。
[0007]因此需要開發(fā)一種易于擴(kuò)增的PCR-RFLP方法來鑒別MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱以及經(jīng)?；旌习l(fā)生且較難區(qū)分的白粉虱。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物及鑒別方法。
[0009]一種鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物，所述引物為一對，分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
[0010]正義引物Bc2-F:5，-CAAATCAGTTTAGTGGAGGC-3，；SEQ ID N0.1
[0011]反義引物Bc2-R:5’ -TAAGCAATCCGAACTTGACTA-3’ ；SEQ ID N0.2
[0012]一種鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的方法，步驟如下:
[0013](I)提取待鑒別樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；
[0014]所述待鑒別樣品為煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種或白粉虱；
[0015](2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用上述鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)電泳結(jié)果中顯示有一條463bp的條帶時(shí)，待鑒別樣品為煙粉虱；當(dāng)電泳結(jié)果中沒有條帶時(shí)，則待鑒別樣品為白粉虱； [0016](3)用限制性內(nèi)切酶Sac II酶切步驟(2)制得的長度為463bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，制得酶切產(chǎn)物；
[0017](4)對步驟(3)制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)電泳結(jié)果中顯示有一條463bp的條帶時(shí)，則該待鑒別樣品為煙粉虱MEAMl隱種；當(dāng)電泳結(jié)果中顯示有一條235bp的條帶時(shí)，則該待鑒別樣品為煙粉虱MED隱種。
[0018]所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為:
[0019]基因組DNA 溶液 2.5μ 1，20μΜ 引物 0.5μ l，5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaqBuffer (緩沖液)2.5 μ 1，IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ I ；
[0020]優(yōu)選的，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下:
[0021]94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72°C延伸7分鐘。
[0022]所述步驟(3)中限制內(nèi)切酶Sac II酶切反應(yīng)條件如下:37°C酶切2小時(shí)。
[0023]上述步驟(1)中提取待鑒別樣品的基因組DNA、步驟(2)和步驟(4)中瓊脂糖凝膠電泳分析均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實(shí)驗(yàn)步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(北京:科學(xué)出版社，2002)。
[0024]有益效果
[0025]1、本發(fā)明所述鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物能夠擴(kuò)增煙粉虱MEAMl隱種和煙粉虱MED隱種基因組DNA中的BtabCSP2基因，而對白粉虱基因組DNA沒有擴(kuò)增作用，為鑒定煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決了現(xiàn)有煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱鑒定較繁瑣的問題；
[0026]2、本發(fā)明所述的限制性內(nèi)切酶為常用的限制性內(nèi)切酶，為篩選煙粉虱MEAMl隱種和煙粉虱MED隱種提供了簡便穩(wěn)定的酶切標(biāo)記；
[0027]3、本發(fā)明從分子水平探索了煙粉虱MEAMl隱種和煙粉虱MED隱種BtabCSP2基因序列差異，探索建立了 MEAMl隱種和MED隱種煙粉虱的鑒別技術(shù)，為今后煙粉虱MEAMl隱種和煙粉虱MED隱種的種群動態(tài)鑒定、生物學(xué)以及綜合防治奠定了基礎(chǔ)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0028]圖1是實(shí)施例2中PCR產(chǎn)物經(jīng)Sac II酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0029]其中:MEAM1:煙粉虱 MEAMl 隱種，MED:煙粉虱 MED 隱種，M:DL2000DNAMarkero[0030]圖2是實(shí)施例3中利用引物Bc2_F和Bc2_R PCR擴(kuò)增田間粉虱樣品的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0031]其中:1-5為濰坊蜀葵的粉虱樣品，6-10為濰坊向日葵的粉虱樣品。11-15為德州棉花的粉虱樣品，16-20為德州茄子的粉虱樣品，21-25為青島辣椒的粉虱樣品，26-30為濟(jì)南甘藍(lán)的粉虱樣品；
[0032]圖3是實(shí)施例3中利用內(nèi)切酶Sac 11酶切PCR產(chǎn)物后的瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0033]其中:1-5為濰坊蜀葵的粉虱樣品，6-10為濰坊向日葵的粉虱樣品。11-15為德州棉花的粉虱樣品，16-20為德州茄子的粉虱樣品，21-25為青島辣椒的粉虱樣品，26-30為濟(jì)南甘藍(lán)的粉風(fēng)樣品。
【具體實(shí)施方式】
[0034]下面結(jié)合實(shí)施例及說明書附圖對本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。
[0035]實(shí)施例1、實(shí)施例2中所述煙粉虱MEAMl隱種和煙粉虱MED隱種為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)種群；
[0036]實(shí)施例3中所述煙粉虱和白粉虱于2013年采集于山東省各地(表1)。
[0037]表1
[0038]
【權(quán)利要求】
1.一種鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物，所述引物為一對，分別為SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示的核苷酸序列。
2.一種鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的方法，其特征在于，步驟如下: (1)提取待鑒別樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液； 所述待鑒別樣品為煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種或白粉虱； (2)以步驟(1)提取的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的鑒別煙粉虱MEAMl隱種、煙粉虱MED隱種和白粉虱的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)電泳結(jié)果中顯示有一條463bp的條帶時(shí)，待鑒別樣品為煙粉虱；當(dāng)電泳結(jié)果中沒有條帶時(shí)，則待鑒別樣品為白粉風(fēng)； (3)用限制性內(nèi)切酶SacII酶切步驟(2)制得的長度為463bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，制得酶切產(chǎn)物； (4)對步驟(3)制得的酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)電泳結(jié)果中顯示有一條463bp的條帶時(shí)，則該待鑒別樣品為煙粉虱MEAMl隱種；當(dāng)電泳結(jié)果中顯示有一條235bp的條帶時(shí)，則該待鑒別樣品為煙粉虱MED隱種。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為: 基因組 DNA 溶液 2.5 μ 1，20 μ M 引物 0.5 μ l,5U/y I Taq 酶 0.25 μ 1，IOXTaq 緩沖液2.5μ l, IOmM dNTP0.5 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 25 μ l。
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下: 94°C預(yù)變性2分鐘；94°C變性30秒，52°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸7分鐘。
5.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)中限制內(nèi)切酶SacII酶切反應(yīng)條件如下:37°C酶切2小時(shí)。
【文檔編號】C12Q1/68GK103898225SQ201410145254
【公開日】2014年7月2日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】劉國霞, 讓·弗朗西斯·皮西姆邦, 宣寧, 步迅, 謝紅艷, 岳壽松, 楊連群, 張全芳, 范仲學(xué) 申請人:山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心