一種用于檢測雞青脛性狀連鎖snp位點基因型的引物、試劑盒及檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物、試劑盒及檢測方法，屬于生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明針對雞青脛性狀特有的一個SNP位點，在其附近的DNA片段設(shè)計引物對P，PCR擴增后對擴增產(chǎn)物進行BamHI酶切，若該突變位點為G，存在BamHI酶切序列GGATCC，則PCR產(chǎn)物酶切后片段為263bp；若該突變位點為T，不存在BamHI酶切序列GGATCC，則PCR產(chǎn)物酶切后片段為317bp。與SSCP和直接測序法相比，該檢測方法操作簡便，成本低、周期短，能大大提高SNP位點基因型判定的準(zhǔn)確性，不需要特殊的儀器，易推廣普及。試驗表明該方法能有效判定雞青脛性狀SNP位點的基因型，可用于雞青脛性狀分子標(biāo)記輔助選擇，為青脛雞群的建立提供有效的分子標(biāo)記。
【專利說明】-種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物、試 劑盒及檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物，以及包含 該引物的試劑盒，同時還涉及檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，屬于生物檢測

【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著城市衛(wèi)生的規(guī)范管理和環(huán)境控制要求的嚴(yán)格，大中城市農(nóng)貿(mào)市場活禽銷售量 將逐漸減少，白條雞和分割雞形式上市的肉雞產(chǎn)品份額將不斷增加。對于冷鮮雞市場來說， 優(yōu)質(zhì)雞區(qū)別于快大肉雞的顯著標(biāo)識顯得異常重要。我國的地方雞常具有青脛的特征，因此 人們常常以白條雞脛色來進行判定，所以青脛雞在品種的培育中具有重要意義。
[0003] 對于雞青脛基因位點，青脛雞分為純合型和雜合型兩種類型。我們在青脛雞的育 種中需要選育出純合青脛基因型，來滿足的育種需求。因此利用分子生物手段來診斷某個 體在青脛位點的基因型，這對我們育種來說是非常重要和必要的。
[0004] 近年來，人們發(fā)展了多種用于探尋分子遺傳標(biāo)記的方法，最常見的有限制性內(nèi)切 酶片段長度多態(tài)性分析（PCR-RFLP)、單鏈構(gòu)象多態(tài)技術(shù)（SSCP)和直接測序技術(shù)等，但SSCP 操作繁瑣、耗時長，結(jié)果易造成誤判；而直接測序技術(shù)的成本較高。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物。
[0006] 同時，本發(fā)明還提供一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒。
[0007] 最后，本發(fā)明還提供一種檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法。
[0008] 為了實現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0009] 一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物，包括引物對P :
[0010] 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'（如 SEQ ID NO. 1 所示），
[0011] 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'（如 SEQ ID NO. 2 所示）。
[0012] 一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，主要包括引物對P :
[0013] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0014] 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
[0015] 具體的，用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，還可以包括2XTaq PCRMaster Mix (含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、Mg2+及緩沖液）、內(nèi)切酶 BamHI、IXNEBuffer3. 1 (含NaCl、Mg2+、BSA及緩沖液)、超純水及DNA Marker等。
[0016] 更具體的，用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，包括：引物對 P20 μ L、2XTaq PCR Master Mix (含 22mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)，55mM KCl，1.65mM MgCl2, 220 μ MdGTP，220 μ M dATP，220 μ M dTTP，220 μ M dCTP，22U 重組 Taq DNA 聚合酶 /ml) lmL、 1(^/^1^內(nèi)切酶8&111!115(^1^、1\冊811打6『3.1(10〇1111似(：1，5〇11111'1^8-!1(：1，1〇11111%(：1 2， 100yg/ml BSA) 200yL、滅菌超純水 500yL及 DNA Marker (600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp) 30μ L。
[0017] 一種檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，包括以下步驟：
[0018] (1)以待檢測雞全基因組DNA為模板，采用引物對P進行PCR擴增，得到擴增片段；
[0019] (2)取擴增片段進行BamHI酶切，酶切產(chǎn)物電泳后根據(jù)電泳結(jié)果判定雞青脛基因 型；
[0020] 所述步驟（1)中引物對P為：
[0021] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0022] 下游引物 P-R : 5 ' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3 '。
[0023] 所述步驟（1)中待檢測雞全基因組DNA可采用苯酚-氯仿粗提法或蛋白酶K法提 取。
[0024] 所述步驟（1)中PCR擴增的反應(yīng)體系為：2 X Taq PCR Master Mix6. 25 μ L， ddH204. 25 μ L，P-FO. 5 μ L，P-RO. 5 μ L，DNA 模板 I. 0 μ L。
[0025] 所述的 2XTaq PCR Master Mix 的組分為：22mM Tris-HCl (ρΗ8· 4)、55mM KC1、 1.65mMMgCl2、220yM dGTP、220yM dATP、220yM (1ΤΤΡ、220μΜ dCTP、22U 重組 Taq DNA 聚 合酶/ml。
[0026] 所述步驟（1)中PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，55°C退 火30s，72°C延伸20s，35個循環(huán)；72°C延伸IOmin ;4°C保存。
[0027] 所述步驟（2)中BamHI酶切的反應(yīng)體系為：步驟（1)的擴增片段10 μ L， IX NEBuffer3. 11. 5μ L, lOU/μ L BamHIO. 5 μ L, ddH203. 0 μ L〇
[0028] 所述的 lXNEBuffer3. 1 的組分為：100mM NaCl、50mM Tris-HClUOmM MgCl2、 100yg/ml BSA。
[0029] 所述步驟（2)中BamHI酶切的反應(yīng)條件為：溫度37°C，酶切時間15min。
[0030] 所述步驟（2)中電泳采用質(zhì)量濃度為1. 5%的瓊脂糖凝膠。
[0031] 所述步驟（2)中電泳的條件為：電壓120V，電泳時間40min。
[0032] 所述步驟（2)中判定雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法為：TT基因型表現(xiàn)為 317bp條帶；TG基因型表現(xiàn)為317bp和264bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為264bp。
[0033] 本發(fā)明的有益效果：
[0034] 本發(fā)明針對雞青脛性狀特有的一個SNP位點，在其附近的DNA片段設(shè)計引物對P， PCR擴增后對擴增產(chǎn)物進行BamHI酶切，若該突變位點為G (如SEQ ID NO. 3所示)，存在 BamHI酶切序列GGATCC，則PCR產(chǎn)物酶切后片段為263bp ;若該突變位點為T (如SEQ ID NO. 4所示)，不存在BamHI酶切序列GGATCC，則PCR產(chǎn)物酶切后片段為317bp。
[0035] 本發(fā)明用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒使用方便，便于攜帶， 可根據(jù)PCR產(chǎn)物酶切后片段的電泳結(jié)果判定雞青脛性狀的基因型。對于雞青脛性狀連鎖 SNP位點為TT的個體，PCR產(chǎn)物酶切前后，片段為317bp ;雞青脛性狀連鎖SNP位點為TG的 個體，PCR產(chǎn)物酶切前后，片段為317bp和263bp ;SNP位點為GG的個體，PCR產(chǎn)物酶切前后， 片段為263bp。
[0036] 本發(fā)明通過對待測雞進行翅靜脈采血，提取基因組DNA，采用引物對P進行PCR擴 增，對擴增產(chǎn)物進行BamHI37°C酶切15min，酶切產(chǎn)物電泳后根據(jù)電泳結(jié)果判定SNP位點的 基因型。與SSCP和直接測法相比，本發(fā)明建立的分子生物學(xué)方法操作更加簡便，成本低、周 期短，能大大提高SNP位點基因型判定的準(zhǔn)確性，不需要特殊的儀器，易推廣普及。試驗表 明該方法能有效判定雞青脛性狀，可用于雞青脛性狀分子標(biāo)記輔助選擇，為青脛雞群的建 立提供有效的分子標(biāo)記。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0037] 圖1為本發(fā)明實施例3中檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的技術(shù)流程示意 圖；
[0038] 圖2為實施例3中用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點的PCR引物位置和擴增產(chǎn)物 中突變位點位置的示意圖；
[0039] 圖3為實施例3中各樣本在雞青脛性狀連鎖SNP位點的酶切電泳圖。

【具體實施方式】
[0040] 下述實施例僅對本發(fā)明作進一步詳細說明，但不構(gòu)成對本發(fā)明的任何限制。
[0041] 實施例1
[0042] 本實施例中用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物，包括引物對P :
[0043] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0044] 下游引物 P-R : 5 ' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3 '。
[0045] 實施例2
[0046] 本實施例中用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，包括：引物對 P20yL、2XTaq PCR Master Mix (含 22mM Tris-HCl(pH8.4)，55mM KCl，1.65mM MgCl2, 220 μ MdGTP，220 μ M dATP，220 μ M dTTP，220 μ M dCTP，22U 重組 Taq DNA 聚合酶 /ml) lmL、 1(^/^1^內(nèi)切酶8&111!115(^1^、1\冊811打6『3.1(10〇1111似(：1，5〇11111'1^8-!1(：1，1〇11111%(：1 2， 100 μ g/ml BSA) 200 μ L、滅菌超純水 500 μ L 及 DNA Marker (600bp、500bp、400bp、300bp、 200bp 和 IOObp) 30μ L ;
[0047] 所述的引物對P為：
[0048] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0049] 下游引物 P-R : 5，-TTGCTGTTACACCATCATCT-3，。
[0050] 實施例3
[0051] 本實施例中檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的技術(shù)流程示意圖如圖1所示， 具體方法包括以下步驟：
[0052] (1)試樣的制備與保存
[0053] 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)種雞場固始雞24只、絲羽烏骨雞24只、海賽克斯A系24只、絲羽烏 骨雞與海賽克斯A系正交Fl代24只和反交Fl代24只，翅靜脈采血，加1/3抗凝劑，用蛋 白酶K法提取血液DNA，將DNA樣品保存于4°C冰箱保存?zhèn)溆茫?br> [0054] (2 )以待檢測雞全基因組DNA為模板，采用引物對P進行PCR擴增，得到擴增片段；
[0055] 引物對P為：
[0056] 上游引物 P-F : 5 ' -AATCCAACCAACCAACCAA-3 '，
[0057] 下游引物 P-R : 5 ' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3 ' ；
[0058] PCR 擴增的反應(yīng)體系為：12· 5μ L 體系，2XTaq PCR Master Mix (含 22mM Tris-HCl (pH8. 4) ,55mM KCl,1.65mM MgC12,220 yM dGTP,220 yM dATP,220 yM dTTP, 220μMdCTP，22U重組TaqDNA聚合酶/ml)6·25μL，ddH204·25μL，P-F0·5μL，P-R0·5μL， DNA 模板 I. 0 μ L ;
[0059] PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，55°C退火30s，72°C延伸 2〇8,35個循環(huán)；721：延伸1〇1^11;41：保存 ；
[0060] (3)取擴增片段進行BamHI酶切，酶切反應(yīng)體系為：步驟（2)的擴增片段10 μ L， lXNEBuffer3. I (IOOmM NaCl,50mM Tris-HCl, IOmM MgCl2,100 μ g/ml BSA) I. 5 μ L, IOU/ μ L BamHIO. 5 μ L，ddH203. 0 μ L ;酶切反應(yīng)條件為：溫度37°C，酶切時間15min ;
[0061] (4)取8 μ L PCR擴增后的酶切產(chǎn)物，1. 5%的瓊脂糖凝膠電泳（電泳條件為：電壓 120V，電泳時間40min)點樣，凝膠成像系統(tǒng)檢測，電泳圖譜詳見圖3 (圖中編號說明如下： 2?5、7為TT基因型，1、6為TG基因型，8為GG基因型，M為DNA Marker);
[0062] (5)根據(jù)電泳圖譜中出現(xiàn)的條帶的大小判定雞青脛基因位點的基因型：若只有 263bp的片段，則為黃（白)脛純合子(表型為黃（白)脛);若只有317bp的片段，則為青脛純合 子(表型為青脛）；若既有263bp又有317bp的片段，則為青脛雜合子(表型為青黃（白）脛）； 試驗結(jié)果如下表1所示。
[0063] 表1待測雞在青脛位點的判型結(jié)果
[0064]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的引物，其特征在于：包括引物對P : 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'， 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
2. -種用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，其特征在于：主要包括引 物對P : 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'， 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，其 特征在于：還包括2XTaq PCR Master Mix、內(nèi)切酶BamHI、lXNEBuffer3.1、超純水及 DNAMarker 〇
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的試劑盒，其特 征在于：包括引物對 P20yL、2XTaq PCR Master MixlmL、10U/yL 內(nèi)切酶 BamHI50yL、 1 XNEBuffer3. 1200 μ L、滅菌超純水 500 μ L 及 DNA Marker30 μ L。
5. -種檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，其特征在于：包括以下步驟： (1) 以待檢測雞全基因組DNA為模板，采用引物對P進行PCR擴增，得到擴增片段； (2) 取擴增片段進行BamHI酶切，酶切產(chǎn)物電泳后根據(jù)電泳結(jié)果判定雞青脛基因型； 所述步驟（1)中引物對P為： 上游引物 P-F :5' -AATCCAACCAACCAACCAA-3'， 下游引物 P-R :5' -TTGCTGTTACACCATCATCT-3'。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，其特征在于： 所述步驟（1)中 PCR 擴增的反應(yīng)體系為：2XTaq PCR Master Mix6. 25μ L，ddH204. 25 μ L， P-FO. 5 μ L，P-RO. 5 μ L，DNA 模板 1· 0 μ L。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，其特征在于： 所述步驟（1)中PCR擴增的反應(yīng)程序為：95°C預(yù)變性5min ;95°C變性30s，55°C退火30s， 72°〇延伸2〇8,35個循環(huán)；721：延伸1〇1^11;41：保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，其特 征在于：所述步驟（2)中BamHI酶切的反應(yīng)體系為：步驟（1)的擴增片段10yL， lXNEBuffer3. 11. 5μ L, lOU/μ L BamHIO. 5μ L, ddH203. 0μ L〇
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，其特征在于： 所述步驟（2)中BamHI酶切的反應(yīng)條件為：溫度37°C，酶切時間15min。
10. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測雞青脛性狀連鎖SNP位點基因型的方法，其特征在于： 所述步驟（2)中判定雞青脛基因型的方法為：TT基因型表現(xiàn)為317bp條帶；TG基因型表現(xiàn) 為317bp和264bp條帶；GG基因型表現(xiàn)為264bp。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293905SQ201410145047
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年4月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月11日
【發(fā)明者】康相濤, 楊朋坤, 蔣瑞瑞, 韓瑞麗, 李轉(zhuǎn)見, 任俊曉, 王順紅, 田亞東, 劉小軍, 孫桂榮, 李國喜, 閆峰賓, 王彥彬 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)