本發(fā)明涉及溫室白粉虱在分離番茄褪綠病毒的應(yīng)用，屬于植物保護(hù)和生物技術(shù)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

自2012年以來，一種新的植物病毒-番茄褪綠病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)成功入侵中國內(nèi)陸并呈迅速擴散趨勢，目前在我國山東、山西、內(nèi)蒙古、浙江等多個地區(qū)均檢測到該病毒的存在，給番茄等蔬菜產(chǎn)業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟損失。

危害番茄的病毒種類很多，如番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)、番茄花葉病毒(Tomato masaic virus,ToMV)、黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、蠶豆萎蔫病毒(Broad bean wilt virus,BBWV)等。其中TYLCV自2002年傳入中國以來，快速蔓延，迅速成為危害我國蔬菜的主要病毒之一，在多個番茄種植區(qū)均檢測到其存在。煙粉虱(Bemisia tabaci)作為我國主要的蔬菜害蟲之一，擴散能力強，是TYLCV和ToCV的主要傳播媒介，能夠同時完成對兩種病毒的有效傳播，并且研究者也證實了二者在田間復(fù)合侵染的現(xiàn)象。由于ToCV傳入我國內(nèi)陸不久，且剛上升為一種主要番茄病毒，對其發(fā)生、傳播等特點仍然知之甚少，對其針對性開展一系列基礎(chǔ)研究則顯得尤為必要。對于科研工作者而言，獲得穩(wěn)定單一的毒源是后續(xù)研究的必要前提。目前ToCV的侵染性克隆仍未見報道，而田間采集樣品中多同時攜帶TYLCV和ToCV兩種病毒，因此如何從現(xiàn)有復(fù)合侵染樣品中分離出單一ToCV是解決上述問題的關(guān)鍵。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供溫室白粉虱在分離番茄褪綠病毒的應(yīng)用。目前從TYLCV和ToCV復(fù)合侵染植株中分離單一病毒的空缺，提供一種快速、可靠的分離ToCV的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

溫室白粉虱在從感染番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒的病株中分離番茄褪綠病毒的應(yīng)用。

上述應(yīng)用，包括如下步驟：

(1)將溫室白粉虱用被番茄黃化曲葉病毒和番茄褪綠病毒侵染的番茄病株飼喂，制得染毒溫室白粉虱；

(2)用步驟(1)制得的染毒溫室白粉虱侵染番茄健康植株，制得感染番茄褪綠病毒的番茄植株。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的溫室白粉虱為初羽化的溫室白粉虱。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(1)中的飼喂步驟如下：

將溫室白粉虱放入直徑1.5cm的微蟲籠中，置于番茄病株從頂部數(shù)第二片葉上，待溫室白粉虱全部飛至番茄葉片上計時，飼喂24h以上。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，所述步驟(2)中的侵染步驟如下：

將步驟(1)制得的染毒溫室白粉虱置于微蟲籠中，然后固定于番茄苗從頂部數(shù)第二片葉上，待溫室白粉虱全部飛到葉片上，開始計時，24h后，將溫室白粉虱取出，即得。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，還包括對步驟(1)制得的染毒溫室白粉虱進(jìn)行體內(nèi)ToCV和TYLCV檢測的步驟，體內(nèi)ToCV檢測具體步驟如下：

將溫室白粉虱置于液氮冷凍5s，然后用去RNase的研磨棒進(jìn)行充分研磨后，再加入1mL Trizol試劑，并按照Trizol提取RNA法的說明書完成溫室白粉虱總RNA的提取，取1μg總RNA，通過cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成第一鏈cDNA的合成；

根據(jù)ToCV基因組序列設(shè)計一對檢測引物：

上游引物ToCV-F：GGGGAATGTGCGTTTAAAGA；SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-R：GAACCAAATCAACGCGATCT；SEQ ID NO.2

ToCV檢測反應(yīng)體系為：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃后延伸7min后，將樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目的條帶有無判斷溫室白粉虱是否成功獲取ToCV；

體內(nèi)TYLCV檢測具體步驟如下：

將溫室白粉虱置于液氮冷凍5s，然后用去RNase的研磨棒進(jìn)行充分研磨后，按照動物組織DNA提取試劑盒說明書步驟完成蟲體基因組DNA的提?。?/p>

TYLCV檢測引物如下：

上游引物TYLCV-F：CGCCCGTCTCGAAGGTTC；SEQ ID NO.3

下游引物TYLCV-R：GCCATATACAATAACAAGGC；SEQ ID NO.4

TYLCV檢測反應(yīng)體系：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃后延伸7min后，將樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)目的條帶有無判斷溫室白粉虱是否成功獲取TYLCV。

根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的，還包括對步驟(2)制得的感染番茄褪綠病毒的番茄植株進(jìn)行檢測的步驟，具體步驟如下：

將感染番茄褪綠病毒的番茄植株放入人工氣候室，在27℃，RH 60％，L:D＝14:10的條件下培養(yǎng)一個月，觀察發(fā)病情況。

有益效果

1、本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)溫室白粉虱具有只傳播番茄褪綠病毒而不傳播番茄黃化曲葉病毒的特點，從而利用上述特點高效批量進(jìn)行ToCV單一毒株的建立，不僅可以保證病毒分離的可靠穩(wěn)定性，而且利用媒介進(jìn)行傳毒也較大程度地提高了毒株建立的效率和成功率；

2、本發(fā)明所述方法只需通過處理溫室白粉虱以完成整個過程，無需制備侵染性克隆、病毒研磨提取等繁瑣步驟，容易掌握，簡便實用，成本低廉；

3、本發(fā)明通過優(yōu)化侵染條件，大幅提高了侵染的成功率。

附圖說明

圖1：獲毒24h后，溫室白粉虱攜毒情況PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：泳道M為DNA Maker DL2000，條帶從上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4分別為獲毒溫室白粉虱、ToCV陽性對照、陰性對照(健康溫室白粉虱)、空白對照；泳道5-8分別為獲毒溫室白粉虱、TYLCV陽性對照、陰性對照(健康溫室白粉虱)、空白對照；

圖2：傳毒番茄植株攜毒情況PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：泳道M為DNA Maker DL2000，條帶從上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4分別為傳毒番茄植株、ToCV陽性對照、陰性對照(健康番茄植株)、空白對照；泳道5-8分別為傳毒番茄植株、TYLCV陽性對照、陰性對照(健康番茄植株)、空白對照。

圖3：煙粉虱傳毒后，番茄植株攜毒情況PCR檢測的瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖中：泳道M為DNA Maker DL2000，條帶從上到下依次代表2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道1-4分別為傳毒番茄植株、ToCV陽性對照、陰性對照(健康番茄植株)、空白對照；泳道5-8分別為傳毒番茄植株、TYLCV陽性對照、陰性對照(健康番茄植株)、空白對照。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的原理和內(nèi)容進(jìn)行詳細(xì)描述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于此。

實施例1、溫室白粉虱的獲毒與檢測

準(zhǔn)備1株TYLCV和ToCV復(fù)合侵染的番茄作為毒源。

取40頭初羽化的溫室白粉虱，放入直徑1.5cm的微蟲籠中，將帶有溫室白粉虱的微蟲籠夾在從頂部數(shù)第二片葉上。等待溫室白粉虱全部飛至番茄葉片上后，開始計時，24h后將蟲子吸出，制得染毒溫室白粉虱。取20頭準(zhǔn)備傳毒，剩余20頭，分別用來提取RNA(15頭)和DNA(5頭)，用于檢測溫室白粉虱獲毒情況。

溫室白粉虱體內(nèi)ToCV檢測：將15頭溫室白粉虱放入1.5mL RNase Free的離心管中，并將其用液氮冷凍5s，用去RNase的研磨棒進(jìn)行充分研磨后，加入1mL Trizol，并按照賽默飛世爾公司的Trizol提取RNA法的說明書完成溫室白粉虱總RNA的提取。取1μg總RNA，通過寶生物工程有限公司的PrimeScript RT reagent Kit(Perfect Real Time)試劑盒完成第一鏈cDNA的合成。根據(jù)ToCV基因組序列設(shè)計一對檢測引物：

上游引物ToCV-F：GGGGAATGTGCGTTTAAAGA；SEQ ID NO.1

下游引物ToCV-R：GAACCAAATCAACGCGATCT；SEQ ID NO.2

ToCV檢測反應(yīng)體系為：

10×PCR Buffer(Mg²⁺plus)2.5μL、dNTP Mixture 2μL、上游和下游引物各1μL、cDNA模板1μL、r Taq 0.25μL、ddH₂O 17.25μL；

PCR反應(yīng)程序為：

94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35個循環(huán)；72℃延伸7min；

然后后將樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明從溫室白粉虱樣品中成功擴增出約250bp左右的ToCV目的片段條帶(如圖1所示)，并將PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLASTn比對，結(jié)果證實該序列為ToCV次要衣殼蛋白基因片段(如SEQ ID NO.5所示)，證明此方法能夠使溫室白粉虱成功獲取ToCV。

溫室白粉虱體內(nèi)TYLCV檢測：將5頭溫室白粉虱放入1.5mL RNase Free的離心管中，并將其用液氮冷凍5s，用去RNase的研磨棒進(jìn)行充分研磨后，按照動物組織DNA提取試劑盒說明書步驟完成蟲體基因組DNA的提取。

TYLCV檢測引物序列如下：

上游引物TYLCV-F：CGCCCGTCTCGAAGGTTC；SEQ ID NO.3

下游引物TYLCV-R：GCCATATACAATAACAAGGC；SEQ ID NO.4

TYLCV檢測反應(yīng)體系同ToCV檢測；PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性3min；94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸50s，35個循環(huán)；72℃延伸7min；

然后將樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果表明從溫室白粉虱樣品中成功擴增出TYLCV目的片段條帶，約600bp左右(如圖1所示)，證明取毒24h后，溫室白粉虱體內(nèi)也帶有TYLCV。

實施例2、ToCV單一侵染番茄植株的建立

準(zhǔn)備3-4真葉期的番茄苗，將20頭已獲毒24h的溫室白粉虱放入微蟲籠中，并固定至番茄苗從頂部數(shù)第二片葉上，待溫室白粉虱全部飛到葉片上，開始計時，24h后，將蟲子取出。將傳毒后的番茄苗放入人工氣候室(27℃，RH 60％，L:D＝14:10)中培養(yǎng)，一個月后觀察發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)番茄植株下部葉片出現(xiàn)了輕微的葉脈間褪綠現(xiàn)象，疑似ToCV發(fā)病癥狀，但是整株并未發(fā)現(xiàn)葉片發(fā)黃及卷曲等TYLCV發(fā)病癥狀。初步斷定番茄植株可能只感染ToCV，有待于進(jìn)行分子檢測。

用酒精消毒的鑷子剪取從下部數(shù)第一片葉。稱取0.1g放入去RNase的研缽中，加入液氮后充分研磨，將磨碎的植物組織粉末轉(zhuǎn)移到含有1mL Trizol的1.5mL RNase Free離心管中，按照Trizol提取RNA法的說明書完成番茄葉片總RNA的提取。取1μg總RNA，通過cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒完成第一鏈cDNA的合成。番茄中ToCV的PCR檢測引物、體系和方法同實施例(1)中溫室白粉虱中ToCV檢測方法。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可看出，檢測樣品在250bp左右出現(xiàn)目的條帶(如圖2中的泳道1-4所示)，說明傳毒植株成功攜帶ToCV。

用酒精消毒的鑷子剪取從下部數(shù)第二片葉。稱取0.5g放入已高溫滅菌處理過的研缽中，加入液氮充分研磨后，按照植物組織基因組DNA提取試劑盒的步驟完成番茄葉片基因組DNA的提取。番茄中TYLCV的PCR檢測引物、體系和方法同實施例(1)中溫室白粉虱中TYLCV檢測方法。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測樣品并未擴增出TYLCV目的片段條帶(如圖2中的泳道5-8所示)，說明該植株不攜帶TYLCV，證明此方法成功分離出ToCV單一毒株，切實可行。

運用該方法對30株3-4真葉期的番茄苗傳毒，1個月后觀察每株番茄苗的發(fā)病情況，并進(jìn)行分子檢測，結(jié)果表明有28株番茄苗已成功感染ToCV，所有番茄苗均未感染TYLCV，本方法侵染單一ToCV的成功率為93.33％。

對比例1

同樣，選擇煙粉虱作為待試?yán)ハx，按照實施例1中的方法進(jìn)行獲毒，并按照實施例2中的方法進(jìn)行傳毒，1個月后進(jìn)行傳毒植株的觀察，發(fā)現(xiàn)番茄苗下部葉片出現(xiàn)了輕微的葉脈間褪綠現(xiàn)象，頂部葉片有輕微的發(fā)黃卷曲現(xiàn)象。

按照實施例2中的方法對植株攜毒情況進(jìn)行分子檢測，ToCV檢測瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，檢測樣品在250bp左右出現(xiàn)目的條帶(如圖3中的泳道1-4所示)，說明傳毒植株攜帶ToCV；TYLCV檢測瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，檢測樣品在600bp左右出現(xiàn)目的條帶(如圖3中的泳道5-8所示)，說明傳毒植株同樣攜帶TYLCV。

由此可以得出，溫室白粉虱能夠成功分離出單一ToCV病毒，而煙粉虱不具備此特性。

對比例2

如實施例2所述的ToCV單一侵染番茄植株的建立方法，不同之處在于，開始計時后的傳毒時間為12h。運用此方法對30株3-4真葉期的番茄苗進(jìn)行傳毒，1個月后觀察發(fā)病癥狀。

采用實施例2中的方法對番茄植株病毒侵染情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，僅有12株番茄植株成功攜帶ToCV，所有番茄植株均不攜帶TYLCV，表明傳毒時間縮短至12h后，分離單一ToCV的成功率僅為40％。而實施例2中的分離傳毒成功率為93.33％，傳毒時間是影響傳毒成功率的重要因素，在一定范圍內(nèi)，相對延長昆蟲傳毒時間，能夠提高其傳毒的成功率。