本發(fā)明屬于2型糖尿病領(lǐng)域，特別涉及一種用于mTORC1通路的小鼠模型及其建立方法。
背景技術(shù)：
伴隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展及生活方式的改變，在全球范圍內(nèi)2型糖尿病的發(fā)病率處于明顯上升趨勢(shì)。據(jù)估計(jì)，在2010年由糖尿病直接引起，或由大血管并發(fā)癥造成的死亡人數(shù)可達(dá)1300萬人以上。而同期中國的糖尿病患病率高達(dá)11.6％，其中僅有10％的患者通過治療得到較好的血糖控制，可見加強(qiáng)對(duì)2型糖尿病的研究是十分必要和迫切的。一般認(rèn)為，外周組織胰島素抵抗及胰島β細(xì)胞功能異常是2型糖尿病發(fā)病機(jī)制中的兩個(gè)中心環(huán)節(jié)，而后者對(duì)于全身糖代謝穩(wěn)態(tài)的維持尤為關(guān)鍵，β細(xì)胞功能和質(zhì)量的機(jī)制研究是糖尿病基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
雷帕霉素理論性靶點(diǎn)蛋白(mechanistic Target of Rapamycin，mTOR)是一個(gè)高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，它可整合來自上游不同營養(yǎng)物質(zhì)、激素、生長(zhǎng)因子等信號(hào)，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、活力及功能等方面有著重要的調(diào)控作用。mTOR信號(hào)通路依賴于它的兩個(gè)復(fù)合體mTORC1和mTORC2而起作用，兩者對(duì)于雷帕霉素的敏感性及上下游調(diào)控方式均有著明顯的差異。mTORC1對(duì)于雷帕霉素的抑制作用比較敏感。兩個(gè)mTOR復(fù)合體均由多個(gè)蛋白組成，除兩者共同含有的mTOR，mLST8，DEPTOR之外，mTORC1特異性含有Raptor及PRAS40，而Rictor和mSin1是mTORC2的特異組成部分。
在大鼠，小鼠，人胰島β細(xì)胞的多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素通過抑制mTORC1活性來調(diào)節(jié)β細(xì)胞的功能和凋亡，雷帕霉素可以降低胰島β細(xì)胞的活力，加速其凋亡，并且能夠負(fù)性調(diào)控糖刺激的胰島素分泌。另外“活體胰島代償模型”(孕鼠模型、糖尿病Psammomys Obesus模型和60％胰腺切除小鼠模型)共同證實(shí)了mTORC1信號(hào)通路在胰島β細(xì)胞功能代償中的重要作用。其中，雷帕霉素通過抑制胰島β細(xì)胞的代償性增殖參與維持早期功能性β細(xì)胞質(zhì)量的代償?？紤]到雷帕霉素除了影響β細(xì)胞功能，還能導(dǎo)致外周胰島素敏感性改變，并且也只能抑制一部分mTORC1的活性，所以轉(zhuǎn)基因小鼠模型對(duì)于研究mTORC1對(duì)于β細(xì)胞功能的作用更有價(jià)值。全身敲除mTORC1可導(dǎo)致致死型胚胎畸形，提示此通路在組織發(fā)育中的重要作用。通過β細(xì)胞特異性過表達(dá)Rheb或者敲除TSC1/2從而使mTORC1活性增強(qiáng)可以增加β細(xì)胞質(zhì)量并且改善糖耐量。與之相反，在全身敲除S6K1和rpS6小鼠模型中，敲除小鼠表現(xiàn)為低胰島素血癥，糖耐量異常和β細(xì)胞大小減小等表型。以上研究都共同證明mTORC1在促進(jìn)β細(xì)胞生長(zhǎng)，胰島素合成以及胰島β細(xì)胞質(zhì)量中的重要作用。然而在這些轉(zhuǎn)基因小鼠模型在胰島β細(xì)胞增殖和凋亡結(jié)果中存在不一致性。
最近，通過對(duì)不同組織(脂肪，肌肉，肝臟)特異性敲除mTORC1伴隨蛋白R(shí)aptor的轉(zhuǎn)基因小鼠研究，揭示了mTORC1通路在不同組織，對(duì)維持全身代謝穩(wěn)態(tài)具有相對(duì)特異的功能。目前尚缺乏β細(xì)胞特異性mTORC1敲除小鼠。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于mTORC1通路的小鼠模型及其建立方法，該小鼠模型建立方法簡(jiǎn)單，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)被β細(xì)胞特異性敲除Raptor的小鼠TORC1信號(hào)通路在胰島中被特異性地抑制，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的一種用于mTORC1通路的小鼠模型，所述小鼠模型為β細(xì)胞中特異性敲除Raptor小鼠。
所述小鼠模型通過PCR基因分型驗(yàn)證。
所述PCR所用引物為
Raptor：F：CTCAGTAGTGGTATGTGCTCAG；R：GGGTACAGTATGTCAGCACAG；
RIP-Cre：F：CGATGCAACGAGGATGAGG；R：GCATTGCTGTCACTTGGTCGT；
CD8：F：GGTGCATTCTCACTCTGAGTTCC；R：GCAGACAGAGCTGATTTCCTATGTG。
所述PCR反應(yīng)體系為：組織提取液1μl，PCR緩沖液5μl，上下游引物各0.1μl，ddH2O 3.8μl。
所述PCR反應(yīng)條件為：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。
本發(fā)明的一種用于mTORC1通路的小鼠模型的建立方法，包括：
在C57品系的Raptor lox/lox小鼠上，與RIP-Cre小鼠交配，獲得Raptor雜合型小鼠，即RIP-Cre Raptor lox/w小鼠；再通過Raptor雜合型小鼠的自身交配，獲得帶有RIP-Cre的Raptor lox/lox小鼠，即得β細(xì)胞中特異性敲除Raptor小鼠。
有益效果
本發(fā)明建立方法簡(jiǎn)單，經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)被β細(xì)胞特異性敲除Raptor的小鼠TORC1信號(hào)通路在胰島中被特異性地抑制，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)，具有良好的應(yīng)用前景。
附圖說明
圖1A為βRapKO小鼠不同組織中的Raptor蛋白水平；圖1B為WT和βRapKO小鼠胰島中mTORC1信號(hào)通路的活性。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
實(shí)施例1
1、小鼠繁殖及交配方案
8周齡性成熟雄性小鼠與雌性小鼠合籠，所生小鼠滿3周齡時(shí)進(jìn)行編號(hào)分籠，同時(shí)剪取少量鼠尾組織以便后續(xù)基因分型。在C57品系的Raptor lox/lox小鼠上，與RIP-Cre小鼠交配，獲得Raptor雜合型小鼠，即RIP-Cre Raptor lox/w小鼠，并通過Raptor雜合型小鼠的自身交配，獲得帶有或不帶有RIP-Cre的Raptor lox/lox小鼠。前者即為在β細(xì)胞中特異性敲除Raptor小鼠(βRapKO小鼠)，而不帶有RIP-Cre則作為對(duì)照組小鼠。
2、基因分型
1)DNA抽提
a)用干凈無菌的剪刀將組織剪碎后加入100ul AD1緩沖液和25ul的AD2緩沖液；
b)室溫孵育10分鐘后，95℃金屬浴3分鐘；
c)加入100ul AD3緩沖液，混勻后凍存在-20℃冰箱或者直接用作模板進(jìn)行PCR。
2)PCR引物
Raptor：
Forward：CTCAGTAGTGGTATGTGCTCAG
Reverse：GGGTACAGTATG TCA GCACAG
RIP-Cre：
Forward：CGATGCAAC GAG TGA TGA GG
Reverse：GCATTGCTG TCA CTT GGTCGT
CD8：(作為所加DNA樣本的質(zhì)控)
Forward：GGT GCA TTC TCA CTC TGA GTT CC
Reverse：GCA GAC AGA GCT GAT TTC CTA TGT G
3)PCR檢測(cè)
a)反應(yīng)體系：組織提取液1μl，PCR緩沖液5μl，上下游引物各0.1μl，ddH2O 3.8μl。
b)反應(yīng)程序：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。
4)瓊脂糖凝膠電泳
a)稱取DNA電泳用瓊脂糖2g放入250ml的燒瓶中加入混有Gel-Red的100ml 1×TAE緩沖液，配置成濃度為2％，混勻后，將燒瓶置于微波爐加熱煮沸，直至瓊脂糖完全溶解。
b)取出燒瓶將其置室溫下冷卻至70℃左右(手握燒瓶可以耐受)，將凝膠溶液倒入膠板鋪板。
c)半小時(shí)左右待瓊脂糖凝固后拔出梳齒取出凝膠置入已加入1×TAE緩沖液的電泳槽中；
d)依次加樣及DNA marker，注意加樣器吸頭應(yīng)恰好置于凝膠點(diǎn)樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外。
e)接通電源，調(diào)節(jié)電壓至130伏，電泳40分鐘后，將凝膠板取出，在紫外燈下觀察結(jié)果。
4、總蛋白的抽提
1)細(xì)胞蛋白抽提
a)用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次后吸凈殘余液體；
b)6孔板每孔加200ul細(xì)胞裂解液，置于冰上5min；
c)用1ml槍頭刮下細(xì)胞，移入離心管，冰上靜置20min；
d)4℃13000g離心30min，取上清分裝后－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>
2)胰島蛋白抽提
a)取出-80℃保存的胰島，加入適量蛋白裂解液，裂解液為RIPA與PMSF按照100:1的比例配比(如需檢測(cè)磷酸化蛋白需加入磷酸酶抑制劑)；
b)冰上靜置20min，
c)細(xì)胞超聲儀(BioruptorTM UCD-200)H檔超聲10秒裂解胰島；
d)取出標(biāo)本，重新加入碎冰；
e)再放入標(biāo)本，超聲H檔再超聲10秒裂解胰島；
f)將樣本于4℃下，以13000g離心30min，取上清，分裝至0.6ml離心管，-80℃保存。
3)蛋白定量(BCA法)
a)2mg/ml BSA標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋；
b)從-80℃取出待測(cè)濃度的胰島蛋白樣本，冰上慢慢融化，用三蒸水10倍稀釋；按說明書配好標(biāo)準(zhǔn)品：
c)在96孔酶標(biāo)版中依次加入梯度稀釋好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品以及稀釋后的待測(cè)樣本，25μl/孔，每個(gè)樣品做副孔；
d)每孔加入200μl的BCA工作液，輕微振蕩30s；
e)37℃孵育30min，570nm測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到樣本濃度。
5.結(jié)果
測(cè)定βRapKO小鼠不同組織中的Raptor蛋白水平(圖1A)(其中，RAPTOR：雷帕霉素理論性靶點(diǎn)調(diào)控相關(guān)蛋白；ACTIN：肌動(dòng)蛋白；PS6(240/244)：磷酸化核糖體蛋白S6(絲氨酸240/244位點(diǎn))；4E-BP1：真核翻譯起始因子4E結(jié)合蛋白1；TUBULIN：微管蛋白)，發(fā)現(xiàn)除了胰島中Raptor蛋白表達(dá)有顯著下降以外，在心臟、肝臟、肌肉、腎臟、脂肪以及下丘腦組織中表達(dá)都未受明顯影響。然后，比較了WT和βRapKO小鼠胰島中mTORC1信號(hào)通路的活性(圖1B)。結(jié)果顯示β細(xì)胞內(nèi)Raptor的表達(dá)顯著下降，mTORC1下游兩個(gè)靶分子p-S6和4E-BP1(由高磷酸化β，γ狀態(tài)向低磷酸化α狀態(tài)轉(zhuǎn)變)的磷酸化水平都降低。以上結(jié)果提示，mTORC1信號(hào)通路在胰島中被特異性地抑制，證明已經(jīng)成功建立了β細(xì)胞特異性敲除Raptor的小鼠模型。