本發(fā)明涉及烏龜?shù)姆庇椒?，具體涉及一種烏龜三倍體純系高效育成的方法。

背景技術(shù)：

烏龜隸屬爬行綱、龜鱉目、龜科，是現(xiàn)存古老的爬行動物，常見的為二倍體，身上長有非常堅固的甲殼，雌龜生長速度為一領(lǐng)齡龜體重在15克左右，二齡龜50克，三齡龜100克，四齡龜200克，無齡龜250克，雄龜生長慢，性成熟最大個體一般為250克以下。因三倍體的不育特征，使烏龜在生長速度、抗病性、肉質(zhì)等方面表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢?，F(xiàn)有技術(shù)中，要獲得三倍體不育烏龜，最快捷有效的方式是通過四倍體烏龜與二倍體烏龜倍間雜交獲得，那么就需要建立遺傳穩(wěn)定、純度極高的四倍體烏龜體系。但在烏龜?shù)倪z傳育種中，目前為止還未見烏龜三倍體高效育成的報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種方法穩(wěn)定、種群純度高達100%的烏龜三倍體純系高效育成的方法。

為達到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

烏龜三倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為10～16g/500g喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母龜產(chǎn)蛋前5～10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g烏龜投喂20～30g，下午6：00每100g烏龜投喂10～15g，直至產(chǎn)蛋；

（3）冷休克處理：在一次卵裂時，采用冷休克的方法，把步驟（2）中的受精蛋放入溫度為-1～1℃的冷箱中，持續(xù)時間為3～5min；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180～250mg/l，睪酮的濃度為100～150mg/l；

（5）用步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟（3）處理后的受精蛋進行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為10～20ml，保持孵化器的溫度29～33℃、濕度50～90%，進行孵化；從而獲得烏龜雄性四倍體純系。

（6）取步驟（5）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

本發(fā)明的優(yōu)點：1、本發(fā)明中對母本進行添加他莫昔芬飼料投喂，起到抑制DNA分裂和促雄性的雙重作用的同時，將受精蛋第一次卵裂的時間推遲了3～5min，并提高所有受精蛋第一次卵裂的同步程度（可達99%），為操作下一步提供時間保障和奠定染色體加倍基礎(chǔ)；2、在受精卵第一次卵裂采用冷休克處理，進一步阻止其染色體分裂，加強了四倍體的形成機率；3、雌激素抑制劑溶液噴灑，再一次強化與保證其雄性的轉(zhuǎn)化率；4、用純系的雄性四倍體與原有的雌性二倍體回交，有效保證了三倍體的純度。因而通過此方法，可獲得100%的三倍體純系，提高了三倍體的育成率與出苗率，減少了育種與選種的麻煩，更主要是對自然水產(chǎn)品種種質(zhì)和生態(tài)環(huán)境無污染。

具體實施方式

現(xiàn)結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步描述。

實施例一

烏龜三倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為16g/500g喂養(yǎng)料，待用；

（2）投喂：在母龜產(chǎn)蛋前5天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g烏龜投喂30g喂養(yǎng)料，下午6：00每100g烏龜投喂15g喂養(yǎng)料；

（3）冷休克處理：在一次卵裂時，采用冷休克的方法，把步驟（2）中的受精蛋放入溫度為0℃的冷箱中，持續(xù)時間為5min；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于90%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為180mg/l，睪酮的濃度為100mg/l；

（5）用步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟（3）中的受精蛋進行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為15ml，保持孵化器的溫度29℃、濕度80%，進行孵化；從而獲得烏龜雄性四倍體純系。

（6）取步驟（5）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

實施例二

烏龜三倍體純系高效育成的方法，包括如下步驟：

（1）他莫昔芬喂養(yǎng)料的配備：取純度為95%以上的他莫昔芬粉劑，加入到烏龜常規(guī)飼養(yǎng)飼料中，制成喂養(yǎng)料，其中他莫昔芬含量為16g/500g飼料，待用；

（2）投喂：在母龜產(chǎn)蛋前10天，按常規(guī)飼料投喂方法對母本進行投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，每天兩次，早上8：00每100g烏龜投喂25g，下午6：00每100g烏龜投喂15g；

（3）冷休克處理：在一次卵裂時，采用冷休克的方法，把步驟（2）中的受精蛋放入溫度為-1℃的冷箱中，持續(xù)時間為3min；

（4）雌激素抑制劑溶液的配制：將氯米芬和睪酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸餾水配制成雌激素抑制劑溶液，其中雌激素抑制劑溶液中氯米芬的濃度為230mg/l，睪酮的濃度為140mg/l；

（5）用步驟（4）所制備的雌激素抑制劑溶液，放入噴霧器中，對步驟（3）中的受精蛋進行均勻噴霧，用量每100只受精蛋為20ml，保持孵化器的溫度33℃、濕度70%，進行孵化；從而獲得烏龜雄性四倍體純系。

（6）取步驟（5）的雄性四倍體作為父本，取普通二倍體作為母本，采用回交的方式，獲得100%三倍體。

上述兩個實施例僅為本發(fā)明的優(yōu)選方案之二，并不能限制本發(fā)明的保護范圍，任意與本發(fā)明等同或相似的技術(shù)手段視為本發(fā)明的保護范圍。以下附上本發(fā)明部分處理方式及結(jié)果統(tǒng)計。

附：烏龜三倍體育成結(jié)果統(tǒng)計

注：上述結(jié)果是母龜產(chǎn)蛋前10天投喂他莫昔芬喂養(yǎng)料，冷休克3min所取得的結(jié)果。