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本發(fā)明涉及一種組合物，其包含協(xié)同有效量的(i)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁(exosporium)的芽孢桿菌屬(bacillus)細胞，以及(ii)至少一種殺真菌劑，所述融合蛋白包含：(x)至少一種植物生長刺激蛋白或肽，和(y)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞的孢子外壁的靶向序列；所述殺真菌劑選自本文所公開特定的殺真菌劑，其表現(xiàn)出改進植物生長和/或健康的能力，和/或?qū)估ハx、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的活性。此外，本發(fā)明涉及該組合物的用途以及一種用于增強植物生長、促進植物健康和/或減少植物和植物部位整體損害的方法。

背景技術：

在作物保護中，持續(xù)需要改進植物健康和/或生長的應用。更健康的植物通常會使植物或其產(chǎn)品的產(chǎn)量更高和/或質(zhì)量更好。

為了促進植物健康，在全世界范圍內(nèi)使用基于無機和有機物質(zhì)的肥料。肥料可以是單一物質(zhì)或組合物，并且用于向植物提供養(yǎng)分。肥料施用的一個重大突破是在1840年左右由justusvonliebig所開發(fā)的氮基肥料。然而，肥料可導致土壤酸化和土壤中養(yǎng)分平衡的不穩(wěn)定，包括礦物質(zhì)的消耗以及鹽和重金屬的富集。另外，過量的肥料使用可導致土壤動物區(qū)系的改變以及污染的地表水和地下水。此外，有害健康的物質(zhì)如硝酸鹽可能在植物和水果中富集。

另外，在全世界范圍內(nèi)使用殺蟲劑和殺真菌劑以防治害蟲。合成的殺蟲劑或殺真菌劑通常是非特異性的，并且因此可作用于除靶生物體之外的生物體，包括其他天然存在的有益生物體。由于其化學性質(zhì)，它們還可能是有毒且非生物可降解的。全世界的消費者日漸意識到與化學品殘留物相關的潛在環(huán)境和健康問題(特別是在食品方面)。這導致消費者對于減少使用化學(即，合成的)農(nóng)藥或至少降低其量的壓力日益增大。因此，需要管理食物鏈需求，同時仍能夠有效防治害蟲。

使用合成殺蟲劑或殺真菌劑所引起的另一個問題是，重復和專一性地施用一種殺蟲劑或殺真菌劑通常導致抗性動物害蟲或微生物的選擇。通常，這類菌株對具有相同作用模式的其他活性成分也產(chǎn)生交叉抗性。因此，不再可能使用所述活性化合物來有效防治病原體。然而，開發(fā)具有新的作用機制的活性成分是困難且昂貴的。

使用生物防治劑(bca)——其作為植物健康增強劑和/或植物保護劑——是肥料和合成農(nóng)藥的替代物。在某些情況下，bca的有效性與傳統(tǒng)殺蟲劑和殺真菌劑不在同一水平上，尤其是在嚴重感染壓力的情況下。因此，在某些情況下，生物防治劑、其突變體及由其產(chǎn)生的代謝物(特別是在低施用率下)并不完全令人滿意。因此，不斷需要開發(fā)新的增強植物健康的組合物和/或植物保護組合物(包括與合成的殺真菌劑和殺蟲劑結合使用的生物防治劑)，以力求滿足上述需求。

技術實現(xiàn)要素：

鑒于此，本發(fā)明的目的特別是提供組合物，其具有增強的改進植物生長和/或增強植物健康的能力或其表現(xiàn)出增強的對抗昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的活性。

因此，已發(fā)現(xiàn)這些目的由如下文所定義的本發(fā)明的組合物來實現(xiàn)。通過施用a)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及b)至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，所述融合蛋白包括：(i)至少一種選自以下的植物生長刺激蛋白或肽：產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶，降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶，以及保護植物免受病原體或害蟲侵襲的蛋白或肽，和(ii)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞的孢子外壁的靶向序列，能夠優(yōu)選以超加性的方式增加(i)植物生長、植物產(chǎn)量和/或植物健康和/或(ii)對抗昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的活性。

在本文中提及靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、融合蛋白和表達這類融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞不應被認為是獨立的實施方案。相反，在整個本申請中，提及靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段、融合蛋白和表達這類融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞應被認為是僅以與一種或多種本文所述的特定殺真菌劑組合(且優(yōu)選是協(xié)同組合)的方式被公開并要求保護。此外，提及“本文所公開的特定殺真菌劑”旨在包括以下段落[000185]-[000187]中所述的殺真菌劑。

本發(fā)明涉及一種組合物，其包含協(xié)同有效量的a)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及b)至少一種本文所公開的特定的殺真菌劑，所述融合蛋白包含：(i)至少一種選自以下的植物生長刺激蛋白或肽：產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶，降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶，或保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽，和(ii)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞的孢子外壁的靶向序列。

在一些實施方案中，所述靶向序列包含：與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；包含seqidno:1的氨基酸1-35的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸20-35的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸22-31的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸22-33的靶向序列；包含seqidno:1的氨基酸20-31的靶向序列；包含seqidno:1的靶向序列；或包含與seqidno:2具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白。

在一些實施方案中，所述產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞是蠟樣芽孢桿菌(bacilluscereus)家族成員的細胞。所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員可為炭疽芽孢桿菌(bacillusanthracis)、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)、蕈狀芽孢桿菌(bacillusmycoides)、假蕈狀芽孢桿菌(bacilluspseudomycoides)、bacillussamanii、bacillusgaemokensis、韋氏芽孢桿菌(bacillusweihenstephensis)、bacillustoyoiensis中任一種或其組合。在其他實施方案中，重組芽孢桿菌屬細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在某些方面，所述融合蛋白包含在產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶，所述酶選自3-羥基丁酮還原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸單加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、丙酮酸脫羧酶、雙乙酰還原酶、丁二醇脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶、色氨酸脫羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脫羧酶、吲哚-3-乙醛脫氫酶、色氨酸側鏈氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷異戊烯轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、cyp735a、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素順-反異構酶、玉米素o-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖苷酶、順-羥化酶、ck順-羥化酶、ckn-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素還原酶、羥胺還原酶、2-酮戊二酸雙加氧酶、赤霉素2b/3b水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脫乙酰殼多糖酶、殼多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶以及參與產(chǎn)生結瘤(nod)因子的酶。

在其他方面，所述融合蛋白包含降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶，所述酶選自纖維素酶、脂肪酶、木質(zhì)素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木質(zhì)酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果膠酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶和鐵載體。

在其他方面，所述融合蛋白包含保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽，所述蛋白或肽具有抗細菌活性、抗真菌活性或抗細菌和抗真菌活性。這種蛋白可包括細菌素、溶菌酶、溶菌酶肽、鐵載體、非核糖體活性肽、伴清蛋白、白蛋白、乳鐵蛋白、乳鐵蛋白肽、tasa或抗生蛋白鏈菌素。

在一些實施方案中，所述至少一種殺真菌劑選自雙苯三唑醇(bitertanol)、聯(lián)苯吡菌胺(bixafen)、糠菌唑(bromuconazole)、多菌靈(carbendazim)、氯環(huán)丙酰胺(carpropamid)、苯氟磺胺(dichlofluanid)、咪唑菌酮(fenamidone)、環(huán)酰菌胺(fenhexamid)、三苯基乙酸錫(fentinacetate)、毒菌錫(fentinhydroxide)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟吡菌酰胺(fluopyram)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟喹唑(fluquinconazole)、乙磷酸(fosetyl)、異菌脲(iprodione)、異丙菌胺(iprovalicarb)、異噻菌胺(isotianil)、苯氧菌胺(metominostrobin)、呋酰胺(ofurace)、戊菌隆(pencycuron)、戊苯吡菌胺(penflufen)、丙氯靈(prochloraz)、霜霉威(propamocarb)、丙森鋅(propineb)、丙硫菌唑(prothioconazole)、嘧霉胺(pyrimethanil)、螺環(huán)菌胺(spiroxamine)、戊唑醇(tebuconazole)、甲苯磺菌胺(tolylfluanid)、三唑酮(triadimefon)、三唑醇(triadimenol)、咪唑嗪(triazoxide)、肟菌酯(trifloxystrobin)、n-[5-氯-2-(三氟甲基)芐基]-n-環(huán)丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺以及2,6-二甲基-1h,5h-[1,4]二硫己烷[2,3-c:5,6-c']聯(lián)吡咯-1,3,5,7(2h,6h)-四酮。

在其他實施方案中，所述至少一種殺真菌劑選自多菌靈、氟喹唑、異噻菌胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙硫菌唑、戊唑醇和肟菌酯。

在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物包含協(xié)同有效量的a)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及b)至少一種殺真菌劑，所述融合蛋白包含：(i)至少一種選自以下的植物生長刺激蛋白或肽：產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶和降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶或至少一種保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽，和(ii)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞的孢子外壁的靶向序列；所述殺真菌劑選自多菌靈、氟喹唑、異噻菌胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙硫菌唑、氟吡菌酰胺、戊唑醇和肟菌酯。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為多菌靈；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為氟喹唑；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為異噻菌胺；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為戊菌??；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為戊苯吡菌胺；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為丙硫菌唑；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為氟吡菌酰胺；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為肟菌酯；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在上述實施方案的一個具體方面，(i)所述至少一種殺真菌劑為戊唑醇；(ii)所述靶向序列包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％；(iii)所述植物生長刺激蛋白或肽包含內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶，優(yōu)選分別與seqidno:107、108和109具有至少95％序列同一性；以及(iv)所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌的細胞。在另一個具體的實施方案中，所述重組蠟樣芽孢桿菌家族成員細胞為蘇云金芽孢桿菌bt013a的細胞。

在一些方面，所述組合物還包含至少一種選自以下的助劑：填充劑、溶劑、自發(fā)促進劑、載體、乳化劑、分散劑、防霜劑、增稠劑和佐劑。

在其他方面，本發(fā)明涉及用本文所公開的任何組合物處理的種子。

此外，本發(fā)明涉及所公開的組合物作為殺真菌劑和/或殺蟲劑的用途。在某些方面，所公開的組合物用于減少由昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體引起的植物和植物部位的整體損害以及采收的果實或蔬菜的損失。在其他方面，所公開的組合物用于增強植物生長和/或促進植物健康。

另外，本發(fā)明涉及一種處理植物、植物部位(如種子、根、根莖、球莖、鱗莖或塊莖)，和/或植物或植物部位生長的地點或其附近(如土壤)以增強植物生長和/或促進植物健康的方法，所述方法包括以下步驟：同時或依次地向植物、植物部位和/或植物的地點施用協(xié)同有效量的a)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及b)至少一種殺真菌劑，所述融合蛋白包含：(i)至少一種選自以下的植物生長刺激蛋白或肽：產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶，降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶，以及保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽，和(ii)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞的孢子外壁的靶向序列；所述殺真菌劑選自本文所公開的特定的殺真菌劑，其表現(xiàn)出對抗昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的活性。

在另一個實施方案中，本發(fā)明涉及一種減少由昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體引起的植物和植物部位的整體損害，以及減少采收果實或蔬菜的損失的方法，其包括以下步驟：同時或依次地向植物、植物部位(如種子、根、根莖、球莖、鱗莖或塊莖)，和/或植物或植物部位生長的地點或其附近(如土壤)施用協(xié)同有效量的a)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及b)至少一種殺真菌劑，所述融合蛋白包含：(i)至少一種選自以下的植物生長刺激蛋白或肽：產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶，降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶，以及保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽，和(ii)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞的孢子外壁的靶向序列；所述殺真菌劑選自本文所公開的特定殺真菌劑，其表現(xiàn)出抗昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的活性。

在以上段落中，術語“包含(comprise)”或其任何派生詞(例如包含(comprising)、包含(comprises))可以用“由...組成”或其適用的相應派生詞替換。

附圖說明

圖1示出了炭疽芽孢桿菌sterne菌株bcla的氨基-末端部分的氨基酸序列與蠟樣芽胞桿菌家族成員的各種孢子外壁蛋白的相應區(qū)域的比對。

具體實施方式

通常，“殺蟲的”意指物質(zhì)提高植物害蟲的死亡率或抑制其生長速率的能力。該術語在本文中用于描述物質(zhì)表現(xiàn)出抗昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的活性的特性。就本發(fā)明而言，術語“害蟲”包括昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體。

所指示的nrrl或atcc登錄號的變體還可被定義為這樣的菌株，其基因組序列與所示nrrl或atcc登錄號的基因組具有大于85％、更優(yōu)選大于90％或更優(yōu)選大于95％的序列同一性。多核苷酸或多核苷酸區(qū)(或多肽或多肽區(qū))與另一序列具有一定的“序列同一性”百分比(例如，80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)意指，當進行對比時，該百分比的堿基(或氨基酸)在比較這兩個序列時是相同的。該對比和同源性百分比或序列同一性可使用本領域中已知的軟件程序確定，例如記載于currentprotocolsinmolecularbiology(f.m.ausubel,etal.,eds.,1987)增刊30，第7.7.18節(jié)，表7.7.1.中的那些。

nrrl是美國農(nóng)業(yè)研究菌種保藏中心(agriculturalresearchserviceculturecollection)的縮寫，其地址為美國伊利諾伊州，皮奧里亞市，北部大學街1815號，美國農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究服務局，農(nóng)業(yè)應用研究國家中心，郵編61604。

attc是美國典型菌種保藏中心(americantypeculturecollection)的縮寫，其地址為美國弗吉尼亞州，馬綱薩斯市，大學林蔭大道10801號，atcc專利保藏中心，郵編10110。

本文所述的具有前綴為nrrl或atcc的登錄號的所有菌株已經(jīng)按照國際承認的用于專利程序的微生物保藏的布達佩斯條約保藏在上述各保藏機構。

“產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶”包括在刺激植物生長或改變植物結構的化合物的生物合成途徑中催化任何步驟的任何酶；或?qū)⒋碳ぶ参锷L或改變植物結構的化合物的無活性或活性較小的衍生物催化轉(zhuǎn)化為所述化合物的活性或更大活性形式的任何酶。這類化合物包括但不限于，例如小分子植物激素如生長素和細胞分裂素、生物活性肽以及由根際中的細菌或真菌合成的小植物生長刺激分子(例如，2,3-丁二醇)。

本文使用的“植物免疫系統(tǒng)增強蛋白或肽”包括對植物免疫系統(tǒng)具有有益作用的任何蛋白或肽。

本文使用的術語“植物生長刺激蛋白或肽”包括在暴露于蛋白或肽的植物中增加植物生長的任何蛋白或肽。

術語“促進植物生長”和“刺激植物生長”在本文中可互換使用，并且是指增強或增加植物的高度、重量、葉尺寸、根尺寸或莖尺寸中的至少一個，增加植物的蛋白質(zhì)產(chǎn)量或增加植物的谷物產(chǎn)量的能力。

本文使用的“保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物較不易受病原體感染的任何蛋白或肽。

本文使用的“增強植物的脅迫抗性的蛋白或肽”包括使暴露于所述蛋白或肽的植物對脅迫更具有抗性的任何蛋白或肽。

術語“植物結合蛋白或肽”是指能特異性地或非特異性地結合至植物的任何部位(例如，植物的根或地上部分如葉子、莖、花或果實)或結合至植物物質(zhì)的任何肽或蛋白。

本文使用的術語“靶向序列”是指使更長的多肽或蛋白定位至蠟樣芽孢桿菌家族成員的孢子外壁的多肽序列。

表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞

融合蛋白包含使所述融合蛋白靶向至蠟樣芽孢桿菌家族成員的孢子外壁的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及：(a)植物生長刺激蛋白或肽；(b)保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽；(c)增強植物脅迫抗性的蛋白或肽；(d)植物結合蛋白或肽；或(e)植物免疫系統(tǒng)增強蛋白或肽。當在蠟樣芽孢桿菌家族成員細菌中表達時，這些融合蛋白被靶向至孢子的孢子外壁層，并且被物理定向以使得蛋白或肽呈現(xiàn)在孢子的外部。

此芽孢桿菌屬孢子外壁呈現(xiàn)(bemd)系統(tǒng)可用于向植物(例如，向植物葉子、果實、花、莖或根)或向植物生長介質(zhì)如土壤遞送肽、酶及其他蛋白質(zhì)。以此方式遞送至土壤或另一植物生長介質(zhì)中的肽、酶和蛋白質(zhì)在土壤中存留且表現(xiàn)出活性的時間延長。將本文所述的表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞引入土壤或植物的根際中，使得在許多不同土壤條件下有益增強植物生長。使用bemd以產(chǎn)生這些酶使得它們在植物生命的最初幾個月持續(xù)對植物和根際施加它們的有益結果。

靶向序列、孢子外壁蛋白和孢子外壁蛋白片段

為了便于參考，本文中提及的肽和蛋白序列的seqidno.列于下表1中。

表1.肽序列和蛋白序列

aa＝氨基酸

*炭疽芽孢桿菌sterne菌株bcla與蘇云金芽孢桿菌bcla具有100％序列同一性。因此，seqidno:1、2和59還分別表示蘇云金芽孢桿菌bcla的氨基酸1-41、全長蘇云金芽孢桿菌bcla和蘇云金芽孢桿菌bcla的氨基酸1-196。同樣，seqidno:60還表示甲硫氨酸殘基加蘇云金芽孢桿菌bcla的氨基酸20-35。

**蕈狀芽孢桿菌假設蛋白tigr03720與蕈狀芽孢桿菌假設蛋白wp003189234具有100％序列同一性。因此，seqidno:57和58還分別表示蕈狀芽孢桿菌假設蛋白wp003189234的氨基酸1-136和全長蕈狀芽孢桿菌假設蛋白wp003189234。

芽孢桿菌屬是桿狀細菌屬。細菌的蠟樣芽孢桿菌家族包括以下物種：炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、假蕈狀芽孢桿菌、bacillussamanii、bacillusgaemokensis、bacillustoyoiensis以及韋氏芽孢桿菌。在脅迫環(huán)境條件下，蠟樣芽孢桿菌家族細菌經(jīng)歷孢子形成并形成橢圓形內(nèi)生孢子，所述內(nèi)生孢子可長時間保持休眠狀態(tài)。內(nèi)生孢子的最外層稱為孢子外壁并包含由毛發(fā)樣突出物的外部絨毛包圍的基底層。毛發(fā)樣絨毛上的絲主要由膠原樣糖蛋白bcla形成，而基底層由許多不同蛋白構成。另一種膠原相關蛋白bclb也存在于孢子外壁中并暴露于蠟樣芽孢桿菌家族成員的內(nèi)生孢子上。

已顯示bcla——表面絨毛的主要成分——附著于孢子外壁上，其氨基-末端(n-末端)位于基底層處且其羧基-末端(c-末端)由孢子向外延伸。

先前發(fā)現(xiàn)來自bcla和bclb的n-末端區(qū)域的某些序列可用于將肽或蛋白靶向至蠟樣芽孢桿菌內(nèi)生孢子的孢子外壁(參見美國專利申請公開no.2010/0233124和2011/0281316，以及thompsonetal.,“targetingofthebclaandbclbproteinstothebacillusanthracissporesurface,”molecularmicrobiology，70(2)：421-34(2008)，其全文各自以引用的方式納入本文)。還發(fā)現(xiàn)炭疽芽孢桿菌的beta/bas3290蛋白定位至孢子外壁。

特別地，發(fā)現(xiàn)來自炭疽芽孢桿菌sterne菌株的bcla的氨基酸20-35足以靶向至孢子外壁。bcla的氨基酸1-41(seqidno:1)與具有相關序列的若干其他蠟樣芽胞桿菌家族孢子外壁蛋白和蠟樣芽胞桿菌家族蛋白的相應n-末端區(qū)域的序列比對示于圖1中。由圖1可見，在對應于bcla的氨基酸20-41的區(qū)域中的所有蛋白中存在高同源性區(qū)域。然而，在這些序列中，對應于bcla的氨基酸36-41的氨基酸含有二級結構且不是融合蛋白定位至孢子外壁所必需的。bcla的保守靶向序列區(qū)域(seqidno:1的氨基酸20-35)以粗體示于圖1中，并且對應于定位至孢子外壁所需的最小靶向序列。在靶向序列內(nèi)跨越bcla的氨基酸25-35的更高保守區(qū)域以下劃線標注于圖1的序列中，并且是exsfa/bxpb/exsfb和同源物的識別序列，所述exsfa/bxpb/exsfb和同源物在孢子外壁表面上引導并組裝所述蛋白。圖1中的seqidno:3、5和7的氨基酸序列分別是炭疽芽孢桿菌sterne菌株beta/bas3290的氨基酸1-33、甲硫氨酸繼之以炭疽芽孢桿菌sterne菌株bas4623的氨基酸2-43以及炭疽芽孢桿菌sterne菌株bclb的氨基酸1-34。(對于bas4623，發(fā)現(xiàn)用甲硫氨酸替代天然蛋白位置1處存在的纈氨酸產(chǎn)生更佳表達。)如從圖1可以看出，這些序列各自含有對應于bcla的氨基酸20-35(seqidno:1；以粗體顯示)的保守區(qū)域，以及對應于bcla的氨基酸20-35的更高保守區(qū)域(加下劃線)。

來自蠟樣芽孢桿菌家族成員的其他蛋白也含有保守靶向區(qū)域。具體地，在圖1中，seqidno:9是炭疽芽孢桿菌sterne菌株bas1882的氨基酸1-30，seqidno:11是韋氏芽孢桿菌kbab42280基因產(chǎn)物的氨基酸1-39，seqidno:13是韋氏芽孢桿菌kbab43572基因產(chǎn)物的氨基酸1-39，seqidno:15是蠟樣芽孢桿菌vd200孢子外壁前導肽的氨基酸1-49，seqidno:17是蠟樣芽孢桿菌vd166孢子外壁前導肽的氨基酸1-33，seqidno:19是蠟樣芽孢桿菌vd200假設蛋白ikg_04663的氨基酸1-39，seqidno:21是韋氏芽孢桿菌kbab4yvtnβ-螺旋槳蛋白的氨基酸1-39，seqidno:23是韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸1-30，seqidno:25是韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸1-30，seqidno:27是韋氏芽孢桿菌kbab4含有三螺旋重復的膠原的氨基酸1-36，seqidno:29是蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyco0001_21660的氨基酸1-39，seqidno:31是蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_22540的氨基酸1-30，seqidno:33是蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-21，seqidno:35是蘇云金芽孢桿菌35646膠原三螺旋重復蛋白的氨基酸1-22，seqidno:43是蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp_69652的氨基酸1-35，seqidno:45是蠟樣芽孢桿菌孢子外壁前導wp016117717的氨基酸1-41，seqidno:47是蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽wp002105192的氨基酸1-49，seqidno:49是蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp87353的氨基酸1-38，seqidno:51是蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽02112369的氨基酸1-39，seqidno:53是蠟樣芽孢桿菌孢子外壁蛋白wp016099770的氨基酸1-39，seqidno:55是蘇云金芽孢桿菌假設蛋白yp006612525的氨基酸1-36，seqidno:57是蕈狀芽孢桿菌假設蛋白tigr03720的氨基酸1-136。如圖1所示，這些蛋白的n-末端區(qū)域各自含有與bcla(seqidno:1)的氨基酸20-35保守的區(qū)域以及對應于bcla的氨基酸25-35的更高保守區(qū)域。

包含氨基酸20-35的bcla的任何部分都可用作靶向序列。另外，全長孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可用于將融合蛋白靶向至孢子外壁。因此，全長bcla或包含氨基酸20-35的bcla片段可用于靶向至孢子外壁。例如，全長bcla(seqidno:2)或bcla的缺乏羧基-末端的中等大小的片段如seqidno:59(bcla的氨基酸1-196)可用于將融合蛋白靶向至孢子外壁。中等大小的片段(如seqidno:59的片段)具有比全長bcla更少的二級結構，并且且已被發(fā)現(xiàn)適于用作靶向序列。所述靶向序列還可包含短得多的bcla的部分，該部分包括氨基酸20-35，如seqidno:1(bcla的氨基酸1-41)、seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1的氨基酸20-35或seqidno:60(連接有甲硫氨酸殘基的bcla的氨基酸20-35)。僅包括氨基酸20-35中的一些的甚至更短的bcla片段也表現(xiàn)出將融合蛋白靶向至孢子外壁的能力。例如，靶向序列可包含seqidno:1的氨基酸22-31、seqidno:1的氨基酸22-33或seqidno:1的氨基酸20-31。

或者，下述的包括對應于bcla的氨基酸20-35的氨基酸的任何部分都可用作靶向序列：beta/bas3290、bas4623、bclb、bas1882、kbab42280基因產(chǎn)物、kbab43572基因產(chǎn)物、蠟樣芽孢桿菌vd200孢子外壁前導肽、蠟樣芽孢桿菌vd166孢子外壁前導肽、蠟樣芽孢桿菌vd200假設蛋白ikg_04663、韋氏芽孢桿菌kbab4yvtnβ-螺旋槳蛋白、韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2363、韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2131、韋氏芽孢桿菌kbab4含有三螺旋重復的膠原、蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyco0001_21660、蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_22540、蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_21510、蘇云金芽孢桿菌35646膠原三螺旋重復蛋白、蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp_69652、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁前導wp016117717、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽wp002105192、蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp87353、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽02112369、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁蛋白wp016099770、蘇云金芽孢桿菌假設蛋白yp006612525或蕈狀芽孢桿菌假設蛋白tigr03720。如從圖1可以看出，beta/bas3290的氨基酸12-27、bas4623的氨基酸23-38、bclb的氨基酸13-28、bas1882的氨基酸9-24、kbab42280基因產(chǎn)物的氨基酸18-33、kbab43572基因產(chǎn)物的氨基酸18-33、蠟樣芽孢桿菌vd200孢子外壁前導肽的氨基酸28-43、蠟樣芽孢桿菌vd166孢子外壁前導肽的氨基酸12-27、蠟樣芽孢桿菌vd200假設蛋白ikg_04663的氨基酸18-33、韋氏芽孢桿菌kbab4yvtnβ-螺旋槳蛋白的氨基酸18-33、韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24、韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24、韋氏芽孢桿菌kbab4含有三螺旋重復的膠原的氨基酸15-30、蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyco0001_21660的氨基酸18-33、蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24、蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_21510的氨基酸1-15、蘇云金芽孢桿菌35646膠原三螺旋重復蛋白的氨基酸1-16、蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp_69652的氨基酸14-29、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁前導wp016117717的氨基酸20-35、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽wp002105192的氨基酸28-43、蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp87353的氨基酸17-32、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽02112369的氨基酸18-33、蠟樣芽孢桿菌孢子外壁蛋白wp016099770的氨基酸18-33、蘇云金芽孢桿菌假設蛋白yp006612525的氨基酸15-30以及蕈狀芽孢桿菌假設蛋白tigr03720的氨基酸115-130對應于bcla的氨基酸20-35。因此，這些蛋白的包含以上所列的對應氨基酸的任何部分都可用作靶向序列。

此外，包含bcla的氨基酸20-35或任意的以上所列的對應氨基酸的任何氨基酸序列都可用作靶向序列。

因此，靶向序列可包含seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1的氨基酸20-35、seqidno:1、seqidno:60、seqidno:1的氨基酸22-31、seqidno:1的氨基酸22-33或seqidno:1的氨基酸20-31。或者，靶向序列由seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1的氨基酸20-35、seqidno:1或seqidno:60組成?；蛘?，靶向序列可由seqidno:1的氨基酸22-31、seqidno:1的氨基酸22-33或seqidno:1的氨基酸20-31組成?；蛘?，孢子外壁蛋白可包含全長bcla(seqidno:2)，或孢子外壁蛋白片段可包含缺乏羧基-末端的bcla的中等大小的片段，如seqidno:59(bcla的氨基酸1-196)?；蛘撸咦油獗诘鞍灼慰捎蓅eqidno:59組成。

靶向序列還可包含seqidno:3的氨基酸1-27、seqidno:3的氨基酸12-27或seqidno:3，或孢子外壁蛋白可包含全長beta/bas3290(seqidno:4)。還發(fā)現(xiàn)連接有甲硫氨酸殘基的beta/bas3290的氨基酸12-27可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:61。靶向序列還可包含seqidno:3的氨基酸14-23、seqidno:3的氨基酸14-25或seqidno:3的氨基酸12-23。

靶向序列還可包含seqidno:5的氨基酸1-38、seqidno:5的氨基酸23-38或seqidno:5，或孢子外壁蛋白可包含全長bas4623(seqidno:6)。

或者，靶向序列可包含seqidno:7的氨基酸1-28、seqidno:7的氨基酸13-28或seqidno:7，或孢子外壁蛋白可包含全長bclb(seqidno:8)。

靶向序列還可包含seqidno:9的氨基酸1-24、seqidno:9的氨基酸9-24或seqidno:9，或孢子外壁蛋白可包含全長bas1882(seqidno:10)。連接有甲硫氨酸殘基的bas1882的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:69.

靶向序列還可包含seqidno:11的氨基酸1-33、seqidno:11的氨基酸18-33或seqidno:11，或孢子外壁蛋白可包含全長韋氏芽孢桿菌kbab42280基因產(chǎn)物(seqidno:12)。連接有甲硫氨酸殘基的韋氏芽孢桿菌kbab42280基因產(chǎn)物的氨基酸18-33也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:62。

靶向序列還可包含seqidno:13的氨基酸1-33、seqidno:13的氨基酸18-33或seqidno:13，或孢子外壁蛋白可包含全長韋氏芽孢桿菌kbab43572基因產(chǎn)物(seqidno:14)。連接有甲硫氨酸殘基的韋氏芽孢桿菌kbab43572基因產(chǎn)物的氨基酸18-33也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:63。

或者，靶向序列可包含seqidno:15的氨基酸1-43、seqidno:15的氨基酸28-43或seqidno:15，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌vd200孢子外壁前導肽(seqidno:16)。

靶向序列還可包含seqidno:17的氨基酸1-27、seqidno:17的氨基酸12-27或seqidno:17，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌vd166孢子外壁前導肽(seqidno:18)。連接有甲硫氨酸殘基的蠟樣芽孢桿菌vd166孢子外壁前導肽的氨基酸12-27也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:64。

靶向序列還可包含seqidno:19的氨基酸1-33、seqidno:19的氨基酸18-33或seqidno:19，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌vd200假設蛋白ikg_04663(seqidno:20)。

或者，靶向序列包含seqidno:21的氨基酸1-33、seqidno:21的氨基酸18-33或seqidno:21，或孢子外壁蛋白可包含全長韋氏芽孢桿菌kbab4yvtnβ-螺旋槳蛋白(seqidno:22)。連接有甲硫氨酸殘基的韋氏芽孢桿菌kbab4yvtnβ-螺旋槳蛋白的氨基酸18-33也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:65。

靶向序列還可包含seqidno:23的氨基酸1-24、seqidno:23的氨基酸9-24或seqidno:23，或孢子外壁蛋白可包含全長韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2363(seqidno:24)。連接有甲硫氨酸殘基的韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2363的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:66。

靶向序列包含seqidno:25的氨基酸1-24、seqidno:25的氨基酸9-24或seqidno:25，或孢子外壁蛋白可包含全長韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2131(seqidno:26)。連接有甲硫氨酸殘基的韋氏芽孢桿菌kbab4假設蛋白bcerkbab4_2131的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:67。

或者，靶向序列包含seqidno:27的氨基酸1-30、seqidno:27的氨基酸15-30或seqidno:27，或孢子外壁蛋白可包含全長韋氏芽孢桿菌kbab4含有三螺旋重復的膠原(seqidno:28)。

靶向序列還可包含seqidno:29的氨基酸1-33、seqidno:29的氨基酸18-33或seqidno:29，或孢子外壁蛋白可包含全長蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyco0001_21660(seqidno:30)。

靶向序列還可包含seqidno:31的氨基酸1-24、seqidno:31的氨基酸9-24或seqidno:31，或孢子外壁蛋白可包含全長蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_22540(seqidno:32)。連接有甲硫氨酸殘基的蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_22540的氨基酸9-24也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:68。

或者，靶向序列包含seqidno:33的氨基酸1-15、seqidno:33，或孢子外壁蛋白包含全長蕈狀芽孢桿菌2048假設蛋白bmyc0001_21510(seqidno:34)。

靶向序列還可包含seqidno:35的氨基酸1-16、seqidno:35，或孢子外壁蛋白可包含全長蘇云金芽孢桿菌35646膠原三螺旋重復蛋白(seqidno:36)。

靶向序列可包含seqidno:43的氨基酸1-29、seqidno:43的氨基酸14-29或seqidno:43，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp_69652(seqidno:44)。

或者，靶向序列可包含seqidno:45的氨基酸1-35、seqidno:45的氨基酸20-35或seqidno:45，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌孢子外壁前導wp016117717(seqidno:46)。連接有甲硫氨酸殘基的蠟樣芽孢桿菌孢子外壁前導wp016117717的氨基酸20-35也可用作靶向序列。因此，靶向序列可包含seqidno:70。

靶向序列可包含seqidno:47的氨基酸1-43、seqidno:47的氨基酸28-43或seqidno:47，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽wp002105192(seqidno:48)。

靶向序列可包含seqidno:49的氨基酸1-32、seqidno:49的氨基酸17-32或seqidno:49，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌假設蛋白wp87353(seqidno:50)。

或者，靶向序列可包含seqidno:51的氨基酸1-33、seqidno:51的氨基酸18-33或seqidno:51，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌孢子外壁肽02112369(seqidno:52)。

靶向序列可包含seqidno:53的氨基酸1-33、seqidno:53的氨基酸18-33或seqidno:53，或孢子外壁蛋白可包含全長蠟樣芽孢桿菌孢子外壁蛋白wp016099770(seqidno:54)。

或者，靶向序列可包含seqidno:55的氨基酸1-30、seqidno:55的氨基酸15-30或seqidno:55，或孢子外壁蛋白可包含全長蘇云金芽孢桿菌假設蛋白yp006612525(seqidno:56)。

靶向序列還可包含seqidno:57的氨基酸1-130、seqidno:57的氨基酸115-130或seqidno:57，或孢子外壁蛋白可包含全長蕈狀芽孢桿菌假設蛋白tigr03720(seqidno:58)。

另外，從圖1中的序列比對可以容易地看出，雖然bcla的氨基酸20-35是保守的，并且氨基酸25-35是更保守的，但在此區(qū)域中仍可發(fā)生一定程度的變異，而不影響靶向序列將蛋白靶向至孢子外壁的能力。圖1列出每個序列的對應氨基酸各自與bcla的氨基酸20-35的同一性百分比(“20-35％同一性”)以及與bcla的氨基酸25-35的同一性百分比(“25-35％同一性)。因此，例如，與bcla的氨基酸20-35相比，beta/bas3290的對應氨基酸具有約81.3％同一性，bas4623的對應氨基酸具有約50.0％同一性，bclb的對應氨基酸具有約43.8％同一性，bas1882的對應氨基酸具有約62.5％同一性，kbab42280基因產(chǎn)物的對應氨基酸具有約81.3％同一性，kbab43572基因產(chǎn)物的對應氨基酸具有約81.3％同一性。其余序列在此區(qū)域上的序列同一性列于圖1中。

相對于bcla的氨基酸25-35，beta/bas3290的對應氨基酸具有約90.9％同一性，bas4623的對應氨基酸具有約72.7％同一性，bclb的對應氨基酸具有約54.5％同一性，bas1882的對應氨基酸具有約72.7％同一性，kbab42280基因產(chǎn)物的對應氨基酸具有約90.9％同一性，kbab43572基因產(chǎn)物的對應氨基酸具有約81.8％同一性。其余序列在此區(qū)域上的序列同一性列于圖1中。

因此，靶向序列可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％?；蛘?，靶向序列由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約43％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約54％。

靶向序列還可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約50％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約63％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約50％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約63％。

靶向序列還可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約50％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約72％?；蛘?，靶向序列由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約50％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約72％。

靶向序列還可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約56％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約63％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約56％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約63％。

或者，靶向序列可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約62％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約72％。靶向序列還可由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約62％的同一性，其中與seqidno:1的氨基酸25-35的同一性為至少約72％。

靶向序列可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少68％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約81％?；蛘撸邢蛐蛄杏梢韵掳被嵝蛄薪M成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少68％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約81％。

靶向序列還可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約75％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約72％。或者，靶向序列由以下氨基酸序列組成，所述氨基酸序列由16個氨基酸組成且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約75％的同一性，其中與seqidno:1的氨基酸25-35的同一性為至少約72％。

靶向序列還可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約75％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約81％?；蛘?，靶向序列由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約75％的同一性，其中與seqidno:1的氨基酸25-35的同一性為至少約81％。

靶向序列還可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約81％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約81％?；蛘?，靶向序列由以下氨基酸序列組成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成并且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約81％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約81％。

靶向序列可包含與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約81％同一性的氨基酸序列，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約90％?；蛘撸邢蛐蛄杏梢韵掳被嵝蛄薪M成：所述氨基酸序列由16個氨基酸組成且與seqidno:1的氨基酸20-35具有至少約81％的同一性，其中與氨基酸25-35的同一性為至少約90％。

技術人員會認識到以上序列的變體也可用作靶向序列，只要靶向序列包含bcla的氨基酸20-35，beta/bas3290、bas4263、bclb、bas1882、kbab42280基因產(chǎn)物或kbab3572基因產(chǎn)物的對應氨基酸，或存在包含任何以上所列的與bcla的氨基酸20-35和25-35的序列同一性的序列。

進一步發(fā)現(xiàn)，缺乏與bcla的氨基酸25-35具有同源性的區(qū)域的某些蠟樣芽胞桿菌家族孢子外壁蛋白也可用于將肽或蛋白靶向至蠟樣芽胞桿菌家族成員的孢子外壁。具體地，融合蛋白可包含含有seqidno:71的孢子外壁蛋白(蕈狀芽孢桿菌inha)、含有seqidno:72的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌sternebas1141(exsy))、含有seqidno:73的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌sternebas1144(bxpb/exsfa))、含有seqidno:74的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌sternebas1145(coty))、含有seqidno:75的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌sternebas1140)、含有seqidno:76的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌h9401exsfb)、含有seqidno:77的孢子外壁蛋白(蘇云金芽孢桿菌hd74inha1)、含有seqidno:78的孢子外壁蛋白(蠟樣芽孢桿菌atcc10876exsj)、含有seqidno:79的孢子外壁蛋白(蠟樣芽孢桿菌exsh)、含有seqidno:80的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌amesyjca)、含有seqidno:81的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌yjcb)、含有seqidno:82的孢子外壁蛋白(炭疽芽孢桿菌sternebclc)、含有seqidno:83的孢子外壁蛋白(蘇云金芽孢桿菌血清變型konkukian菌株97-27酸性磷酸酶)或含有seqidno:84的孢子外壁蛋白(蘇云金芽孢桿菌hd74inha2)。在本文所述的融合蛋白中納入包含seqidno:71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83或84的孢子外壁蛋白將導致靶向至蠟樣芽孢桿菌家族成員的孢子外壁。

此外，與上述的任何全長孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段具有高度序列同一性的孢子外壁蛋白也可用于將肽或蛋白靶向至蠟樣芽孢桿菌家族成員的孢子外壁上。因此，融合蛋白可包含含有與seqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一個具有至少85％同一性的氨基酸序列的孢子外壁蛋白?；蛘撸诤系鞍卓砂cseqidno:2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、44、46、48、50、52、54、56、58、59、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83和84中的任一個具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的孢子外壁蛋白。

或者，融合蛋白可包含由與seqidno:59具有至少85％同一性的氨基酸序列組成的孢子外壁蛋白片段?；蛘撸诤系鞍卓砂膳cseqidno:59具有至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列組成的孢子外壁蛋白片段。

在本文所述的任意的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段中，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在其羧基末端包含氨基酸序列gxt，其中x為任何氨基酸。

在本文所述的任意的靶向序列、孢子外壁蛋白以及孢子外壁蛋白片段中，所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可在靶向序列的對應于seqidno:1的氨基酸20的位置處包含丙氨酸殘基。

融合蛋白

融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一種植物生長刺激蛋白或肽。所述植物生長刺激蛋白或肽可包含肽激素、非激素肽、產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶或降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶。所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以為上述任意的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。

融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一種保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽。所述靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段可以為上述任意的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。

融合蛋白可使用本領域中已知的標準克隆和分子生物學方法制得。例如，編碼蛋白或肽的基因(例如，編碼植物生長刺激蛋白或肽的基因)可通過聚合酶鏈式反應(pcr)來擴增并且連接到編碼上述任何靶向序列的dna，以形成編碼融合蛋白的dna分子。編碼融合蛋白的dna分子可被克隆到任何適合的載體(例如質(zhì)粒載體)中。載體適當?shù)匕鄠€克隆位點，編碼融合蛋白的dna分子可容易地插入所述克隆位點中。載體還適當?shù)睾锌蛇x擇的標記，如抗生素抗性基因，以使可以容易地鑒定和分離用載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染或配對的細菌。當載體是質(zhì)粒時，所述質(zhì)粒還適當?shù)匕瑥椭破瘘c。編碼融合蛋白的dna適當?shù)卦阪咦有纬蓡幼?例如，來自蠟樣芽孢桿菌家族成員的天然bcla啟動子)的控制下，所述孢子形成啟動子將引起融合蛋白在蠟樣芽孢桿菌家族成員內(nèi)生孢子的孢子外壁上的表達?；蛘?，編碼融合蛋白的dna可整合到蠟樣芽孢桿菌家族成員宿主的染色體dna中。

融合蛋白還可包含其他多肽序列，所述多肽序列不是所述靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段，或植物生長刺激蛋白或肽、保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽、提高植物的脅迫抗性的蛋白或肽或植物結合蛋白或肽的一部分。例如，融合蛋白可包括標簽或標記以促進融合蛋白的純化或可視化(例如，多組氨酸標簽或熒光蛋白如gfp或yfp)或表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞孢子的可視化。

使用本文所述的靶向序列、孢子外壁蛋白以及孢子外壁蛋白片段增強了融合蛋白在孢子外壁上的表達，這是由于在這些序列的氨基-末端中缺乏二級結構，這允許融合蛋白的天然折疊和活性的保留。適當?shù)恼郫B可通過在靶向序列、孢子外壁蛋白、孢子外壁蛋白片段和融合伴侶(partner)蛋白之間納入短的氨基酸接頭來進一步增強。

因此，本文所述的任何融合蛋白可在靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段與植物生長刺激蛋白或肽、保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽、提高植物的脅迫抗性的蛋白或肽或植物結合蛋白或肽之間包含氨基酸接頭。

所述接頭可包含聚丙氨酸接頭或聚甘氨酸接頭。還可使用包含丙氨酸殘基與甘氨酸殘基的混合物的接頭。例如，當靶向序列包含seqidno:1時，融合蛋白可具有以下結構中的一種：

無接頭：seqidno:1-融合伴侶蛋白

丙氨酸接頭：seqidno:1-an-融合伴侶蛋白

甘氨酸接頭：seqidno:1-gn-融合伴侶蛋白

混合丙氨酸和甘氨酸接頭：seqidno:1-(a/g)n-融合伴侶蛋白

其中an、gn和(a/g)n分別是任意數(shù)量的丙氨酸、任意數(shù)量的甘氨酸、或任意數(shù)量的丙氨酸與甘氨酸的混合物。例如，n可為1至25，且優(yōu)選為6至10。當接頭包含丙氨酸殘基與甘氨酸殘基的混合物時，可使用甘氨酸殘基與丙氨酸殘基的任何組合。在以上結構中，“融合伴侶蛋白”代表植物生長刺激蛋白或肽、保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽、提高植物的脅迫抗性的蛋白或肽或植物結合蛋白或肽。

可選地或另外地，所述接頭可包含蛋白酶識別位點。納入蛋白酶識別位點使得能夠在暴露于識別所述蛋白酶識別位點的蛋白酶時靶向移除植物生長刺激蛋白或肽、保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽、提高植物的脅迫抗性的蛋白或肽或植物結合蛋白或肽。

植物生長刺激蛋白和肽

如上所述，融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一種植物生長刺激蛋白或肽。例如，所述植物生長刺激蛋白或肽可包括肽激素、非激素肽、產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶或降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶。

例如，當植物生長刺激蛋白或肽包括肽激素時，所述肽激素可包括植物磺肽素(phytosulfokine)(例如植物磺肽素-α)、clavata3(clv3)、系統(tǒng)素、zmlgf或scr/sp11。

當植物生長刺激蛋白或肽包括非激素肽時，所述非激素肽可包括rkn16d10、hg-syv46、enod40肽、蜂毒肽、肥大脫粒肽、mas7、rhpp、polaris或kunitz胰蛋白酶抑制劑(kti)。

植物生長刺激蛋白或肽可包括產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶。產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶可以是在刺激植物生長或改變植物結構的化合物的生物合成途徑中催化任何步驟的任何酶，或?qū)⒋碳ぶ参锷L或改變植物結構的化合物的無活性或活性較小的衍生物催化轉(zhuǎn)化為化合物的活性或更大活性形式的任何酶。

植物生長刺激化合物可包括由根際中的細菌或真菌產(chǎn)生的化合物，例如2,3-丁二醇。

或者，植物生長刺激化合物可包括植物生長激素，例如細胞分裂素或細胞分裂素衍生物、乙烯、生長素或生長素衍生物、赤霉酸或赤霉酸衍生物、脫落酸或脫落酸衍生物、或茉莉酸或茉莉酸衍生物。

當植物生長刺激化合物包括細胞分裂素或細胞分裂素衍生物時，所述細胞分裂素或細胞分裂素衍生物可包括激動素、順-玉米素、反-玉米素、6-芐氨基嘌呤、二羥基玉米素、n6-(d2-異戊烯基)腺嘌呤、玉米素核苷、n6-(d2-異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-順-玉米素核苷、順-玉米素核苷、反-玉米素核苷、2-甲硫基-反-玉米素核苷、玉米素核苷-5-單磷酸、n6-甲氨基嘌呤、n6-二甲氨基嘌呤、2'-脫氧玉米素核糖核苷、4-羥基-3-甲基-反-2-丁烯基氨基嘌呤、鄰拓撲林(ortho-topolin)、間拓撲林、芐基腺嘌呤、鄰甲基拓撲林、間甲基拓撲林或其組合。

當植物生長刺激化合物包括生長素或生長素衍生物時，所述生長素或生長素衍生物可包括活性生長素、無活性生長素、綴合生長素、天然存在的生長素或合成生長素或其組合。例如，所述生長素或生長素衍生物可包括吲哚-3-乙酸、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-乙酰胺、吲哚-3-乙腈、吲哚-3-乙醇、吲哚-3-丙酮酸、吲哚-3-乙醛肟、吲哚-3-丁酸、苯乙酸、4-氯吲哚-3-乙酸、葡萄糖綴合的生長素或其組合。

產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶可包括3-羥基丁酮還原酶、吲哚-3-乙酰胺水解酶、色氨酸單加氧酶、乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、丙酮酸脫羧酶、雙乙酰還原酶、丁二醇脫氫酶、氨基轉(zhuǎn)移酶(例如色氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶)、色氨酸脫羧酶、胺氧化酶、吲哚-3-丙酮酸脫羧酶、吲哚-3-乙醛脫氫酶、色氨酸側鏈氧化酶、腈水解酶(nitrilehydrolase)、腈水解酶(nitrilase)、肽酶、蛋白酶、磷酸腺苷異戊烯轉(zhuǎn)移酶、磷酸酶、腺苷激酶、腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶、cyp735a、5'核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、玉米素順-反異構酶、玉米素o-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、β-葡糖苷酶、順-羥化酶、ck順-羥化酶、ckn-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶、2,5-核糖核苷酸磷酸水解酶、腺苷核苷酶、嘌呤核苷磷酸化酶、玉米素還原酶、羥胺還原酶、2-酮戊二酸雙加氧酶、赤霉素2b/3b水解酶、赤霉素3-氧化酶、赤霉素20-氧化酶、脫乙酰殼多糖酶、殼多糖酶、β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶或參與產(chǎn)生結瘤因子的酶(例如，noda、nodb或nodi)。

當所述酶包括蛋白酶或肽酶時，所述蛋白酶或肽酶可以是裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以產(chǎn)生生物活性肽的蛋白酶或肽酶。所述生物活性肽可以是發(fā)揮生物活性的任何肽。

生物活性肽的實例包括rkn16d10和rhpp。

裂解蛋白、肽、原蛋白或前原蛋白以產(chǎn)生生物活性肽的蛋白酶或肽酶可包括枯草桿菌蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶、內(nèi)肽酶、外肽酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、羧化酶、絲氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。

蛋白酶或肽酶可裂解富含蛋白質(zhì)的粗粉(例如，大豆粉或酵母提取物)中的蛋白質(zhì)。

植物生長刺激蛋白還可包括降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶。這類酶包括纖維素酶、脂肪酶、木質(zhì)素氧化酶、蛋白酶、糖苷水解酶、磷酸酶、固氮酶、核酸酶、酰胺酶、硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、淀粉酶、氨氧化酶、木質(zhì)酶、葡糖苷酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、果膠酶、葡聚糖酶、硫酸酯酶、尿素酶、木聚糖酶或鐵載體。當被引入植物生長介質(zhì)中或施用于植物、種子或植物或植物種子周圍的區(qū)域時，包含降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶的融合蛋白可有助于加工植物附近的養(yǎng)分并增強植物或植物附近的有益的細菌或真菌對養(yǎng)分的攝取。

適合的纖維素酶包括內(nèi)切纖維素酶(例如，內(nèi)切葡聚糖酶如枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)內(nèi)切葡聚糖酶、蘇云金芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶、蠟樣芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶或克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)內(nèi)切葡聚糖酶)、外切纖維素酶(例如，里氏木霉(trichodermareesei)外切纖維素酶)以及β-葡糖苷酶(例如，枯草芽孢桿菌β-葡糖苷酶、蘇云金芽孢桿菌β-葡糖苷酶、蠟樣芽孢桿菌β-葡糖苷酶或克勞氏芽孢桿菌β-葡糖苷酶)。

脂肪酶可包括枯草芽孢桿菌脂肪酶、蘇云金芽孢桿菌脂肪酶、蠟樣芽孢桿菌脂肪酶或克勞氏芽孢桿菌脂肪酶。

在一個實施方案中，脂肪酶包括枯草芽孢桿菌脂肪酶。所述枯草芽孢桿菌脂肪酶可使用以下引物進行pcr擴增：ggatccatggctgaacacaatcc(正向，seqidno:37)和ggatccttaattcgtattctggcc(反向，seqidno:38)。

在另一個實施方案中，纖維素酶為枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶。所述枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶可使用以下引物進行pcr擴增：ggatccatgaaacggtcaatc(正向，seqidno:39)和ggatccttactaatttggttctgt(反向，seqidno:40)。

在另一個實施方案中，融合蛋白包含大腸桿菌(e.coli)蛋白酶ptrb。所述大腸桿菌蛋白酶ptrb可使用以下引物進行pcr擴增：ggatccatgctaccaaaagcc(正向，seqidno:41)和ggatccttagtccgcaggcgtagc(反向，seqidno:42)。

在某些實施方案中，融合蛋白含有源自seqidno:104中的核苷酸序列的內(nèi)切葡聚糖酶。

可以融合至靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及任選的接頭序列(如多聚-a接頭)的示例性內(nèi)切葡聚糖酶的氨基酸序列為以seqidno:107提供的融合蛋白。

在其他實施方案中，融合蛋白含有源自seqidno:105中所示的核苷酸序列的磷脂酶。

可以融合至靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及任選的接頭序列(如多聚-a接頭)的示例性磷脂酶的氨基酸序列為以seqidno:108提供的融合蛋白。

在其他實施方案中，所述融合蛋白含有源自seqidno:106中所示的核苷酸序列的脫乙酰殼多糖酶?？梢匀诤现寥诤系鞍字械陌邢蛐蛄?、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及任選的接頭序列(如多聚-a接頭)的示例性脫乙酰殼多糖酶的氨基酸序列以seqidno:109提供。

為了產(chǎn)生融合構建體，可以通過重疊延伸(soe)技術使用剪接將基因融合至編碼bcla的頭35個氨基酸(seqidno:1的氨基酸1-35)的蘇云金芽孢桿菌dna的天然bcla啟動子。將正確擴增子克隆到大腸桿菌/芽孢桿菌屬穿梭載體php13中，并且通過dna測序?qū)φ_的克隆進行篩選。將正確的克隆電穿孔至蘇云金芽孢桿菌(cry-、質(zhì)粒-)中并且針對氯霉素抗性進行篩選。將正確的轉(zhuǎn)化體在30℃下于腦心浸液肉湯中生長過夜，置于營養(yǎng)瓊脂板上，并且在30℃下孵育3天。通過在磷酸鹽緩沖鹽水(pbs)中洗滌將表達融合構建體的孢子(bemd孢子)從所述板上收集下來，并通過離心和在pbs中額外的洗滌而純化。

在這類融合蛋白中，內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶可以包含編碼分別與seqidno:107、108或109具有至少85％同一性的氨基酸序列的核苷酸序列。

在這類融合蛋白中，內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶可以包含分別與seqidno:107、108或109具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在這類融合蛋白中，內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶可以包含分別與seqidno:107、108或109具有至少95％同一性的氨基酸序列。

在這類融合蛋白中，內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶可以包含分別與seqidno:107、108或109具有至少98％同一性的氨基酸序列。

在這類融合蛋白中，內(nèi)切葡聚糖酶、磷脂酶或脫乙酰殼多糖酶可以包含分別與seqidno:107、108或109具有至少99％同一性的氨基酸序列。

適合的木質(zhì)素氧化酶包括木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶、乙二醛氧化酶、木質(zhì)酶以及錳過氧化物酶。

蛋白酶可包括枯草桿菌蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、蛋白酶、肽酶、內(nèi)肽酶、外肽酶、嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、鏈霉蛋白酶、羧化酶、絲氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、蘇氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶。

磷酸酶可包括磷酸單酯水解酶、磷酸單酯酶(例如phoa4)、磷酸二酯水解酶、磷酸二酯酶、三磷酸單酯水解酶、磷酰酸酐水解酶、焦磷酸酶、肌醇六磷酸酶(例如，枯草芽孢桿菌ee148肌醇六磷酸酶或蘇云金芽孢桿菌bt013a肌醇六磷酸酶)、三偏磷酸酶或三磷酸酶。

固氮酶可包括nif家族固氮酶(例如，馬賽類芽孢桿菌(paenibacillusmassiliensis)nifbdehknxv)。

保護植物免受病原體侵襲的蛋白和肽

融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段，以及至少一種保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽。

所述蛋白或肽可包括刺激植物免疫應答的蛋白或肽。例如，刺激植物免疫應答的蛋白或肽可包括植物免疫系統(tǒng)增強蛋白或肽。所述植物免疫系統(tǒng)增強蛋白或肽可為對植物的免疫系統(tǒng)具有有益作用的任何蛋白或肽。適合的植物免疫系統(tǒng)增強蛋白和肽包括過敏蛋白(harpin)、α-彈性蛋白、β-彈性蛋白、系統(tǒng)素、苯丙氨酸解氨酶、激發(fā)素、防御素、隱地蛋白、鞭毛蛋白以及鞭毛蛋白肽(例如flg22)。

或者，保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽可為具有抗細菌活性、抗真菌活性、或抗細菌和抗真菌活性的蛋白或肽。此類蛋白和肽的實例包括細菌素、溶菌酶、溶菌酶肽(例如lysm)、鐵載體、非核糖體活性肽、伴清蛋白、白蛋白、乳鐵蛋白、乳鐵蛋白肽(例如lfcinb)、抗生蛋白鏈菌素以及tasa。

保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽還可為具有殺蟲活性、殺蠕蟲活性，抑制昆蟲或蠕蟲捕食，或其組合的蛋白或肽。例如，保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽可包括殺蟲細菌毒素(例如，vip殺蟲蛋白)、內(nèi)毒素、cry毒素(例如，來自蘇云金芽孢桿菌的cry毒素)、蛋白酶抑制劑蛋白或肽(例如，胰蛋白酶抑制劑或慈菇蛋白酶抑制劑)、半胱氨酸蛋白酶或殼多糖酶。當cry毒素是來自蘇云金芽孢桿菌的cry毒素時，cry毒素可以是cry5b蛋白或cry21a蛋白。cry5b和cry21a兼具殺蟲和殺線蟲活性。

保護植物免受病原體侵襲的蛋白可包括酶。適合的酶包括蛋白酶和內(nèi)酯酶。所述蛋白酶和內(nèi)酯酶可特異性針對細菌信號傳導分子(例如，細菌內(nèi)酯高絲氨酸信號傳導分子)。

當酶是內(nèi)酯酶時，所述內(nèi)酯酶可包括1,4-內(nèi)酯酶、2-吡喃酮-4,6-二羧酸內(nèi)酯酶、3-氧代己二酸烯醇-內(nèi)酯酶、放線菌素內(nèi)酯酶、脫氧檸檬酸酯(deoxylimonate)a-環(huán)-內(nèi)酯酶、葡糖酸內(nèi)酯酶l-鼠李糖-1,4-內(nèi)酯酶、檸檬苦素-d-環(huán)-內(nèi)酯酶、類固醇-內(nèi)酯酶、三乙酸-內(nèi)酯酶或木糖酸-1,4-內(nèi)酯酶。

所述酶還可以是特異性針對細菌或真菌的細胞組分的酶。例如，所述酶可包括β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶、β-1,6-葡聚糖酶、脫乙酰殼多糖酶、殼多糖酶、脫乙酰殼多糖酶樣酶、溶細胞酶、肽酶、蛋白酶(proteinase)、蛋白酶(protease)(例如，堿性蛋白酶、酸性蛋白酶或中性蛋白酶)、變?nèi)芫?、葡萄球菌溶血?stapholysin)或溶菌酶。

提高植物脅迫抗性的蛋白和肽

融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一種提高植物脅迫抗性的蛋白或肽。

例如，提高植物脅迫抗性的蛋白或肽包括降解脅迫相關化合物的酶。脅迫相關化合物包括但不限于氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(acc)、活性氧種類、一氧化氮、氧脂素以及酚類物質(zhì)(phenolics)。具體的活性氧種類包括羥基、過氧化氫、氧以及超氧化物。降解脅迫相關化合物的酶可包括超氧化物歧化酶、氧化酶、過氧化氫酶、氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶、過氧化物酶、抗氧化酶或抗氧化肽。

提高植物脅迫抗性的蛋白或肽還可包括保護植物免受環(huán)境脅迫的蛋白或肽。所述環(huán)境脅迫可包括，例如，干旱、洪水、熱、冰凍、鹽、重金屬、低ph、高ph或其組合。例如，保護植物免受環(huán)境脅迫的蛋白或肽可包括冰核蛋白、脯氨酰肽酶、苯丙氨酸解氨酶、異分支酸合酶、異分支酸丙酮酸裂解酶或膽堿脫氫酶。

植物結合蛋白和肽

融合蛋白可包含靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段以及至少一種植物結合蛋白或肽。植物結合蛋白或肽可為能夠特異性地或非特異性地結合至植物的任何部位(例如，植物根部或植物的地上部分如葉、莖、花或果實)或植物物質(zhì)的任何蛋白或肽。因此，例如，植物結合蛋白或肽可以是根結合蛋白或肽或葉結合蛋白或肽。

適合的植物結合蛋白和肽包括粘附素(例如根鈣粘素(rhicadhesin))、鞭毛蛋白、omptin、外源凝集素、棒曲霉素、生物膜結構蛋白(例如tasa或yuab)、菌毛蛋白、卷曲蛋白(curlusprotein)、intimin、侵襲素、凝集素以及非菌毛(afimbrial)蛋白。

表達融合蛋白的重組芽孢桿菌屬

本文所述的融合蛋白可由重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞表達。所述融合蛋白可以是上述的任何融合蛋白。

重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可共表達上述的任何融合蛋白中的兩種或更多種。例如，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可共表達至少一種包含植物結合蛋白或肽的融合蛋白，與至少一種包含植物生長刺激蛋白或肽的融合蛋白、至少一種包含保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽的融合蛋白，或至少一種提高植物脅迫抗性的蛋白或肽。

重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可包括炭疽芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、假蕈狀芽孢桿菌、bacillussamanii、bacillusgaemokensis、韋氏芽孢桿菌、bacillustoyoiensis或其組合。例如，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可包括蠟樣芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌、假蕈狀芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌。具體地，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可包括蘇云金芽孢桿菌或蕈狀芽孢桿菌。

為了產(chǎn)生表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，可使用本領域中已知的標準方法(例如通過電穿孔)將任何蠟樣芽孢桿菌家族成員與編碼融合蛋白的載體綴合、用所述載體轉(zhuǎn)導或轉(zhuǎn)化。然后，可通過本領域中已知的任何方法篩選細菌以鑒定轉(zhuǎn)化體。例如，當載體包含抗生素抗性基因時，可就抗生素抗性對細菌進行篩選?；蛘?，可將編碼融合蛋白的dna整合到蠟樣芽孢桿菌家族成員宿主的染色體dna中。然后，可將重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞暴露于將誘發(fā)孢子形成的條件中。用于誘導孢子形成的適合的條件是本領域已知的。例如，可將重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞鋪于瓊脂板上，并且在約30℃的溫度下孵育若干天(例如，3天)。

還可適當?shù)厥褂靡陨先魏畏N類的失活菌株、無毒菌株或遺傳操作的菌株。例如，可使用缺乏cry毒素的蘇云金芽孢桿菌?？蛇x地或另外地，一旦表達融合蛋白的重組蠟樣芽孢桿菌家族孢子已經(jīng)產(chǎn)生，便可使它們失活以防止一旦使用時的進一步萌芽?？墒褂帽绢I域中已知的使細菌孢子失活的任何方法。合適的方法包括但不限于，熱處理、γ輻射、x-射線輻射、uv-a輻射、uv-b輻射、化學處理(例如，用戊二醛、甲醛、過氧化氫、乙酸、漂白劑或其任何組合處理)或其組合?；蛘?，可使用源自非產(chǎn)毒菌株或遺傳上或物理上失活菌株的孢子。

具有植物生長促進作用和/或其他有益屬性的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞

許多蠟樣芽孢桿菌家族成員菌株具有固有的有益屬性。例如，一些菌株具有植物生長促進作用。本文所述的任何融合蛋白都可在這類菌株中表達。

例如，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可包括細菌的植物生長促進菌株。

細菌的植物生長促進菌株可包括產(chǎn)生殺蟲毒素(例如，cry毒素)、產(chǎn)生殺真菌化合物(例如，β-1,3-葡聚糖酶、脫乙酰殼多糖酶、溶細胞酶或其組合)、產(chǎn)生殺線蟲化合物(例如，cry毒素)、產(chǎn)生殺細菌化合物、對一種或多種抗生素有抗性、包含一個或多個自主復制質(zhì)粒、結合至植物根部、定殖于植物根部、形成生物膜、溶解養(yǎng)分、分泌有機酸或其任何組合的細菌的菌株。

例如，當重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞包括細菌的植物生長促進菌株時，細菌的植物生長促進菌株可包括蕈狀芽孢桿菌bt155(nrrlno.b-50921)、蕈狀芽孢桿菌ee118(nrrlno.b-50918)、蕈狀芽孢桿菌ee141(nrrlno.b-50916)、蕈狀芽孢桿菌bt46-3(nrrlno.b-50922)、蠟樣芽孢桿菌家族成員ee128(nrrlno.b-50917)、蘇云金芽孢桿菌bt013a(nrrlno.b-50924)或蠟樣芽孢桿菌家族成員ee349(nrrlno.b-50928)。蘇云金芽孢桿菌bt013a還稱為蘇云金芽孢桿菌4q7。這些菌株各自于2014年3月10日保藏于美國農(nóng)業(yè)部(usda)農(nóng)業(yè)研究服務局(ars)(其地址為美國伊利諾伊州，皮奧里亞市，北部大學街1815號，郵編61604)，并且由括號中提供的nrrl保藏號來鑒定。

這些植物生長促進菌株分離自各種茁壯的植物的根際并且通過生物化學測定由其16srrna序列來鑒定。通過常規(guī)的生物化學和形態(tài)指標，將菌株至少鑒定為它們的屬名。用于經(jīng)確認的革蘭氏陽性菌株如芽孢桿菌屬的生物化學測定包括在pea培養(yǎng)基和營養(yǎng)瓊脂上的生長，顯微鏡檢查，在5％和7.5％nacl培養(yǎng)基上的生長，在ph5和ph9下的生長，在42℃和50℃下的生長，用纖維二糖、乳糖、甘油、葡萄糖、蔗糖、d-甘露醇以及淀粉發(fā)酵時產(chǎn)生酸的能力；熒光顏料產(chǎn)生；明膠水解；硝酸鹽還原；過氧化氫酶產(chǎn)生、淀粉水解；氧化酶反應、尿素酶產(chǎn)生以及活力。

例如，包含細菌的植物生長促進菌株的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可包括蕈狀芽孢桿菌bt155、蕈狀芽孢桿菌ee141或蘇云金芽孢桿菌bt013a。重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可表達本文所述的任何融合蛋白，例如，包含seqidno:60的靶向序列和非激素肽(例如，kunitz胰蛋白酶抑制劑(kti))，產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶(例如，脫乙酰殼多糖酶)，植物結合蛋白或肽(例如，tasa)；保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽(例如，tasa)，或降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶(例如，磷酸酶如phoa或肌醇六磷酸酶，或內(nèi)切葡聚糖酶)的融合蛋白。

啟動子

在本文所述的任何重組蠟樣芽孢桿菌家族成員中，融合蛋白可在融合蛋白的靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然啟動子的控制下表達。例如，當融合蛋白包含源自炭疽芽孢桿菌sternebcla的靶向序列(例如，seqidno:1的氨基酸20-35、seqidno:1的氨基酸1-35、seqidno:1或seqidno:60)時或當融合蛋白包含全長bcla(seqidno:2)或全長bcla的片段(例如，seqidno:59)時，融合蛋白可在通常與炭疽芽孢桿菌sterne的基因組中的bcla基因相關的啟動子(例如，seqidno:85的啟動子)的控制下表達。

或者，融合蛋白可在高表達孢子形成啟動子的控制下表達。在一些情況下，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然啟動子會是高表達孢子形成啟動子。在其他情況下，靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段的天然啟動子不會是高表達孢子形成啟動子。在后一種情況下，用高表達孢子形成啟動子替代天然啟動子可能是有利的。融合蛋白在高表達孢子形成啟動子的控制下的表達使融合蛋白在蠟樣芽孢桿菌家族成員的孢子外壁上的表達增加。

高表達孢子形成啟動子可包含一個或多個σ-k孢子形成特異性聚合酶啟動子序列。

用于在蠟樣芽孢桿菌家族成員中表達融合蛋白的適合的高表達孢子形成啟動子包括下表2中所列出的那些：

表2：啟動子序列

在上表2中所列出的啟動子序列中，σ-k孢子形成特異性聚合酶啟動子序列的位置由粗體和加下劃線的文本示出。cry1a啟動子(蘇云金芽孢桿菌hd-73；seqidno:90)具有總共四個σ-k序列，其中兩個相互重疊，如表2中的雙下劃線所示。

用于在蠟樣芽孢桿菌家族成員中表達融合蛋白的優(yōu)選高表達孢子形成啟動子包括beta啟動子(炭疽芽孢桿菌sterne；seqidno:86)、bcla啟動子(炭疽芽孢桿菌sterne；seqidno:85)、bcla簇糖基轉(zhuǎn)移酶操縱子1和2啟動子(炭疽芽孢桿菌sterne；seqidno:101和102)以及yvtnβ-螺旋槳蛋白啟動子(韋氏芽孢桿菌kbab4；seqidno:89)。

在本文所述的任何重組蠟樣芽孢桿菌家族成員中，融合蛋白可在孢子形成啟動子的控制下表達，所述孢子形成啟動子包含與seqidno:85-103中任一個的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核酸序列。

當孢子形成啟動子包含與seqidno:85-103中任一個的核酸序列具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％或至少99％同一性的核酸序列時，一個或多個σ-k孢子形成特異性聚合酶啟動子序列優(yōu)選與seqidno:85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102或103的對應核苷酸具有100％同一性。例如，如上表2所示，炭疽芽孢桿菌sterne的bcla啟動子(seqidno:85)在核苷酸24-32、35-43以及129-137處具有σ-k孢子形成特異性聚合酶啟動子序列。因此，如果孢子形成啟動子包含與seqidno:85的核酸序列具有至少90％同一性的序列，優(yōu)選對應于seqidno:85的核苷酸24-32、35-43以及129-137的孢子形成啟動子的核苷酸與seqidno:85的核苷酸24-32、35-43以及129-137具有100％同一性。

在本文所述的用于刺激植物生長的任何方法中，在包含重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種選自本文所公開的特定殺真菌劑的殺真菌劑的植物生長介質(zhì)中生長的植物表現(xiàn)出相對于在不含重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的相同植物生長介質(zhì)中的植物的生長的增強的生長。

在本文所述的用于刺激植物生長的任何組合物和方法中，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞可包括上文所述的任何細菌的重組植物生長促進菌株。

在本文所述的用于刺激植物生長的任何組合物和方法中，融合蛋白可在以上所述的任何啟動子的控制下表達。

殺真菌劑

通常，“殺真菌的”意指物質(zhì)提高真菌死亡率或抑制其生長速率的能力。

術語“真菌(fungus)”或“真菌(fungi)”包括多種不含葉綠素的有核產(chǎn)孢子的生物體。真菌的實例包括酵母、霉菌、霉(mildew)、銹菌類(rusts)和蕈類(mushrooms)。

本發(fā)明的組合物包含至少一種本文所公開的特定殺真菌劑。

本文中由其通用名指定的活性化合物是已知的，并且記載于，例如，“農(nóng)藥手冊(pesticidemanual)”中或因特網(wǎng)(例如：http://www.alanwood.net/pesticides)上。

在一些實施方案中，殺真菌劑選自雙苯三唑醇、聯(lián)苯吡菌胺、糠菌唑、多菌靈、氯環(huán)丙酰胺、苯氟磺胺、咪唑菌酮、環(huán)酰菌胺、三苯基乙酸錫、毒菌錫、氟吡菌胺、氟吡菌酰胺、氟嘧菌酯、氟喹唑、乙磷酸、異菌脲、異丙菌胺、異噻菌胺、苯氧菌胺、呋酰胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙氯靈丙氯靈、霜霉威、丙森鋅、丙硫菌唑、嘧霉胺、螺環(huán)菌胺、戊唑醇、甲苯磺菌胺、三唑酮、三唑醇、咪唑嗪、肟菌酯、n-[5-氯-2-(三氟甲基)芐基]-n-環(huán)丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺以及2,6-二甲基-1h,5h-[1,4]二硫己烷[2,3-c:5,6-c']聯(lián)吡咯-1,3,5,7(2h,6h)-四酮。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，殺真菌劑選自多菌靈、氟喹唑、異噻菌胺、戊菌隆、戊苯吡菌胺、丙硫菌唑、戊唑醇和肟菌酯。

在另一個實施方案中，殺真菌劑為n-(5-氯-2-異丙基芐基)-n-環(huán)丙基-3-(二氟甲基)-5-氟-1-甲基-1h-吡唑-4-甲酰胺。

本發(fā)明的組合物

根據(jù)本發(fā)明，所述組合物包含協(xié)同有效量的a)表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及b)至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，所述融合蛋白包含：(i)至少一種選自以下的植物生長刺激蛋白或肽：產(chǎn)生或活化植物生長刺激化合物中所涉及的酶，降解或修飾細菌、真菌或植物養(yǎng)分來源的酶，以及保護植物免受病原體侵襲的蛋白或肽，和(ii)將所述融合蛋白定位至芽孢桿菌屬細胞孢子外壁的靶向序列。

本發(fā)明的“協(xié)同有效量”代表表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種如本文所述的特定殺真菌劑的組合的量，相比于單獨的表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞或這種殺真菌劑，所述組合更有效地對抗昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體。本發(fā)明的“協(xié)同有效量”還代表表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種如本文所公開的特定殺真菌劑的組合的量，相比于單獨的表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞或所述殺真菌劑，所述組合更有效地增強植物生長和/或促進植物健康。

本發(fā)明包括本文所提及的各殺真菌劑與重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的每一種組合。

其他添加劑

本發(fā)明的一個方面提供了如上所述的組合物，其還包含至少一種選自以下的助劑：填充劑、溶劑、自發(fā)促進劑、載體、乳化劑、分散劑、防霜劑、增稠劑和佐劑。那些組合物被稱為制劑。

因此，在本發(fā)明的一個方面，提供這些制劑以及由其制備的施用形式作為包含本發(fā)明化合物的作物保護劑和/或殺蟲劑(如浸液、滴液和噴霧液劑)。施用形式可包含其他作物保護劑和/或殺蟲劑；和/或增強活性的佐劑如滲透劑，其實例為植物油(如油菜籽油、葵花籽油)、礦物油(如液體石蠟)、植物脂肪酸烷基酯(如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯)或烷醇烷氧基化物；和/或鋪展劑如烷基硅氧烷和/或鹽類，其實例為有機或無機銨鹽或鏻鹽(實例為硫酸銨或磷酸氫二銨)；和/或保持促進劑，如二辛基磺基琥珀酸鹽或羥丙基瓜爾膠聚合物；和/或保濕劑如丙三醇；和/或肥料如銨肥、鉀肥或磷肥。

典型制劑的實例包括水溶性液劑(sl)、乳化濃縮劑(ec)、水乳劑(ew)、懸浮濃縮劑(sc、se、fs、od)、水分散性顆粒劑(wg)、顆粒劑(gr)和膠囊濃縮劑(cs)；制劑的這些及其他可能類型例如由國際作物生命(croplifeinternational)組織在以下文獻中描述：《農(nóng)藥說明書》、《聯(lián)合國糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織農(nóng)藥說明書開發(fā)與使用手冊》、《聯(lián)合國糧農(nóng)組織植物生產(chǎn)與保護文件-173》(由聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織關于農(nóng)藥手冊的聯(lián)合會議制訂，2004，isbn：9251048576)。除本發(fā)明的一種或多種活性化合物以外，所述制劑可包含活性農(nóng)用化學化合物。

所述制劑或施用形式優(yōu)選包含助劑，如填充劑、溶劑、自發(fā)促進劑、載體、乳化劑、分散劑、防霜劑、殺生物劑、增稠劑和/或其他助劑，如佐劑。在本文中，佐劑是增強制劑的生物效應的組分，而該組分本身不具有生物效應。佐劑的實例為促進保持、擴散、對葉子表面的附著或滲透的試劑。

這些制劑通過已知方法制備，例如通過將活性化合物與助劑混合而制備，所述助劑例如為填充劑、溶劑和/或固體載體和/或其他助劑，例如表面活性劑。所述制劑在合適的設備中制備或者在施用前或施用過程中制備。

適各用作助劑的是這樣的物質(zhì)，它們適合賦予活性化合物的制劑或由這些制劑制備的施用形式(例如，可用的作物保護劑，如噴霧液劑或拌種劑)以特定性質(zhì)，例如某些物理、技術和/或生物學性質(zhì)。

合適的填充劑為，例如，水、極性和非極性有機化學液體，例如芳族烴和非芳族烴(如石蠟、烷基苯、烷基萘、氯苯)，醇和多元醇(如果合適，其還可被取代、醚化和/或酯化)，酮(如丙酮、環(huán)己酮)，酯(包括脂肪和油)和(聚)醚，未取代的和取代的胺、酰胺、內(nèi)酰胺(如n-烷基吡咯烷酮)和內(nèi)酯，砜和亞砜(如二甲基亞砜)。

如果所使用的填充劑是水，則還可使用例如有機溶劑作為助溶劑?；旧希线m的液體溶劑為：芳族化合物，如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯代芳族烴和氯代脂族烴，如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；脂族烴，如環(huán)己烷或石蠟，例如石油餾分；礦物油和植物油；醇類，如丁醇或乙二醇及其醚和酯；酮類，如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮或環(huán)己酮；強極性溶劑，如二甲基甲酰胺和二甲亞砜；以及水。

原則上，可以使用所有合適的溶劑。合適的溶劑為，例如，芳族烴，如二甲苯、甲苯或烷基萘；氯代芳族烴或氯代脂族烴，如氯苯、氯乙烯或二氯甲烷；例如脂族烴，如環(huán)己烷，例如石蠟、石油餾分；礦物油和植物油；醇類，例如甲醇、乙醇、異丙醇、丁醇或乙二醇及其醚和酯；酮類，如丙酮、甲基乙基酮、甲基異丁基酮或環(huán)己酮；例如強極性溶劑，如二甲亞砜；以及水。

原則上，可使用所有合適的載體。合適的載體特別是：例如，銨鹽和磨碎的天然礦物，如高嶺土、粘土、滑石、白堊、石英、綠坡縷石、蒙脫石或硅藻土；以及磨碎的合成礦物，如細碎的二氧化硅、氧化鋁和天然或合成硅酸鹽、樹脂、蠟和/或固體肥料。同樣還可使用這些載體的混合物。適合用于顆粒劑的載體包括以下載體：例如，壓碎并分級的天然礦物，如方解石、大理石、浮石、海泡石、白云石；以及無機和有機粉的合成顆粒；以及有機材料的顆粒，如鋸屑、紙、椰殼、玉米穗軸和煙草莖。

還可使用液化的氣態(tài)填充劑或溶劑。特別合適的是那些在標準溫度和標準壓力下為氣態(tài)的填充劑或載體，實例為氣溶膠噴射劑，如鹵化烴，以及丁烷、丙烷、氮氣和二氧化碳。

具有離子或非離子性質(zhì)的乳化劑和/或發(fā)泡劑、分散劑或潤濕劑、或這些表面活性物質(zhì)的混合物的實例為：聚丙烯酸鹽；木素磺酸鹽；苯酚磺酸或萘磺酸鹽；環(huán)氧乙烷與脂肪醇或與脂肪酸或與脂肪胺或與取代的酚類(優(yōu)選烷基酚或芳基酚)的縮聚物；磺基丁二酸酯鹽；牛磺酸衍生物(優(yōu)選?；撬嵬榛?；聚乙氧基化醇或酚的磷酸酯；多元醇的脂肪酸酯；以及含硫酸鹽、磺酸鹽和磷酸鹽的化合物的衍生物，實例為烷基芳基聚乙二醇醚、烷基磺酸鹽、烷基硫酸鹽、芳基磺酸鹽、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物、木質(zhì)素-亞硫酸鹽廢液和甲基纖維素。如果所述活性化合物之一和/或所述惰性載體之一不溶于水，并且如果施用在水中進行，則表面活性物質(zhì)的存在是有利的。

可存在于所述制劑和由其衍生的施用形式中的其他助劑包括著色劑，如無機顏料(實例為氧化鐵、氧化鈦、普魯士藍)，和有機染料(如茜素染料、偶氮染料和金屬酞菁染料)；以及營養(yǎng)素和痕量營養(yǎng)素(如鐵鹽、錳鹽、硼鹽、銅鹽、鈷鹽、鉬鹽和鋅鹽)。

還可存在提高化學和/或物理穩(wěn)定性的穩(wěn)定劑，如低溫穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑、光穩(wěn)定劑或其他試劑。此外，可存在發(fā)泡劑或消泡劑。

此外，所述制劑和由其衍生的施用形式還可包含，作為附加助劑的粘著劑，如羧甲基纖維素，粉末、顆粒或膠乳形式的天然和合成聚合物(如阿拉伯樹膠、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯)，以及天然磷脂(如腦磷脂和卵磷脂，和合成磷脂)。其他可能的助劑包括礦物油和植物油。

所述制劑和由其衍生的施用形式中還可存在其他助劑。這些添加劑的實例包括香料、保護性膠體、粘合劑(binder)、粘結劑(adhesive)、增稠劑、觸變物質(zhì)、滲透劑、保持促進劑、穩(wěn)定劑、螯合劑、絡合劑、保濕劑和鋪展劑。一般而言，活性化合物可與通常用于制劑目的的任何固體或液體添加劑結合。

合適的保持促進劑包括降低動力學表面張力的所有那些物質(zhì)，如磺基丁二酸二辛酯；或增加粘彈性的所有那些物質(zhì)，如羥丙基瓜爾膠聚合物。

在本發(fā)明的上下文中，合適的滲透劑為通常用于增強活性農(nóng)用化學化合物向植物內(nèi)滲透的所有那些物質(zhì)。在本上下文中，滲透劑被定義為，其能夠從(通常是水性的)施用液體和/或從噴霧涂層滲透植物的角質(zhì)層并由此提高活性化合物在角質(zhì)層中的遷移的物質(zhì)。可使用文獻(bauretal.，1997，pesticidescience51，131-152)中記載的方法來測定這種特性。實例包括醇烷氧基化物，如椰子脂肪乙氧基化物(10)或異十三烷基乙氧基化物(12)；脂肪酸酯，如油菜籽油甲酯或大豆油甲酯；脂肪胺烷氧基化物，如牛油胺乙氧基化物(15)；或銨鹽和/或鏻鹽，如硫酸銨或磷酸氫二銨。

以所述制劑的重量計，其優(yōu)選包含0.0001重量％至98重量％的活性化合物，或特別優(yōu)選0.01重量％至95重量％的活性化合物，更優(yōu)選0.5重量％至90重量％的活性化合物?；钚曰衔锏暮勘欢x為重組產(chǎn)孢子外壁的外芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的總和。

由所述制劑制備的施用形式(作物保護產(chǎn)品)的活性化合物含量可在寬的范圍內(nèi)變化。以所述施用形式的重量計，其活性化合物濃度通?？蔀?.0001重量％至95重量％的活性化合物，優(yōu)選為0.0001重量％至1重量％。施用以適合于施用形式的常規(guī)方式進行。

此外，在本發(fā)明的一方面，提供了包含在空間上分開放置的協(xié)同有效量的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的試劑盒。

在本發(fā)明的其他實施方案中，上述試劑盒還包含至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑。所述殺真菌劑和/或殺蟲劑可存在于在空間上分隔的試劑盒的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞組分中或試劑盒的殺真菌劑組分中，或同時存在于在這兩種組分中。優(yōu)選地，所述殺真菌劑和殺蟲劑存在于基于重組蠟樣芽孢桿菌家族成員的生物防治劑組分中。

此外，本發(fā)明的試劑盒還可包含至少一種選自以下的助劑：如下所述的填充劑、溶劑、自發(fā)促進劑、載體、乳化劑、分散劑、防霜劑、增稠劑和佐劑。所述至少一種助劑可存在于在空間上分隔的試劑盒的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞組分中或試劑盒的殺真菌劑組分中，或同時存在于在這兩種組分中。

在本發(fā)明的另一方面，如上所述的組合物用于降低由昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體引起的植物和植物部位的整體損害以及采收的果實或蔬菜的損失。

此外，在本發(fā)明的另一方面，如上所述的組合物提高了整體植物健康。

術語“植物健康”通常包括與害蟲防治無關的多種植物改進。例如，可提及的有利特性是改進的作物特征，其包括：出苗、作物產(chǎn)量、蛋白含量、油含量、淀粉含量、更發(fā)達的根系、改進的根部生長、改進的根部大小維持、改進的根部效率、改進的耐脅迫性(例如，抗干旱、熱、鹽、uv、水、寒冷)、乙烯減少(減少產(chǎn)生和/或抑制接收)、分蘗增加、植物高度增加、更大的葉片、基底部死葉更少、更強的分蘗、更綠的葉顏色、色素含量、光合作用活性、所需輸入(如肥料或水)更少、所需種子更少、更高產(chǎn)的分蘗、開花更早、谷物成熟早、植物倒伏更少、芽生長增加、植物活力增強、植物直立性增加以及發(fā)芽更早更好。

對于本發(fā)明的用途，改進的植物健康優(yōu)選是指包括以下的改進的植物特征：作物產(chǎn)量、更發(fā)達的根系(改進的根部生長)、改進的根部大小維持、改進的根部效率、分蘗增加、植物高度增加、更大的葉片、基底部死葉更少、更強的分蘗、更綠的葉顏色、光合作用活性、更高產(chǎn)的的分蘗、植物活力增強以及植物直立性增加。

對于本發(fā)明，改進的植物健康特別優(yōu)選指選自如下的改進的植物特性：作物產(chǎn)量、更發(fā)達的根系、更發(fā)達的根部生長、改進的根部大小維持、改進的根部效率、分蘗增加以及植物高度增加。

本發(fā)明的組合物對如本文所定義的植物健康的作用可通過比較在同一環(huán)境條件下生長的植物而測定，其中所述植物的一部分用本發(fā)明的組合物處理，所述植物的另一部分不用本發(fā)明的組合物處理。相反，所述其他部分完全不經(jīng)處理，或用安慰劑處理(即沒有施用本發(fā)明的組合物，如沒有施用所有活性成分(即，無如本文所述的基于重組蠟樣芽孢桿菌家族成員的生物防治劑和無如本文所述的殺真菌劑)，或沒有施用如本文所述的基于重組蠟樣芽孢桿菌家族成員的生物防治劑，或沒有施用如本文所述的殺真菌劑。

本發(fā)明的組合物可以任何所需的方式施用，如以種子包衣、土壤浸液和/或直接施用于犁溝中、和/或以葉面噴霧的形式，并且可在出苗前、出苗后或出苗前后都施用。換言之，所述組合物可被施用于種子、植物或采收的果實和蔬菜，或植物正生長于其中或需要在其中生長的土壤(植物的生長地點)。

降低植物和植物部位的整體損害通常得到更健康的植物和/或使植物活力和產(chǎn)量提高。

優(yōu)選地，本發(fā)明的組合物用于處理傳統(tǒng)植物或轉(zhuǎn)基團植物或其種子。

本發(fā)明還涉及使用上述包含表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的任何組合物來刺激植物生長的方法。刺激植物生長的方法包括向植物、植物部位、植物周圍的地點或?qū)⒁N植植物的地點(例如，土壤或其他生長介質(zhì))施用組合物，所述組合物包含協(xié)同有效量的表達融合蛋白的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞，以及至少一種本文所公開的其他特定殺菌劑，所述融合蛋白包含：(i)至少一種植物生長刺激蛋白或肽，和(ii)靶向序列、孢子外壁蛋白或孢子外壁蛋白片段。

在本發(fā)明的另一方面，提供了一種降低由昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體引起的植物和植物部位的整體損害以及降低采收的果實或蔬菜的損失的方法，其包括同時或依次地施用協(xié)同有效量的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的步驟。

在本發(fā)明的另一實施方案中，除了重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和本文所公開的特定殺真菌劑之外，所述組合物還包含至少一種殺蟲劑和/或至少一種殺真菌劑。在一個實施方案中，所述至少一種殺蟲劑是合成殺蟲劑。

本發(fā)明的方法包括以下施用方法，即可將之前提及的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑配制成具有農(nóng)業(yè)上可接受的保質(zhì)期的單一、穩(wěn)定的組合物(所謂的“獨配制劑”)，或在使用之前或使用時進行組合(所謂的“組合制劑”)。

如果沒有另外提及，表述“組合”代表以如下形式存在的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑的各種組合：以獨配制劑形式、單一“預混”形式、以由獨配制劑組成的組合噴霧混合物(如“桶混”)形式，以及特別是以依次的方式(即在合理的短時期如幾小時或幾天，例如2小時至7天內(nèi)相繼地)施用時，單一活性成分的組合使用。施用本發(fā)明組合物的順序不是實施本發(fā)明的關鍵。因此，術語“組合”還涵蓋例如在同時或依次地向植物、其周圍環(huán)境、生境或者儲存空間施用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑之后，所述重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或殺蟲劑存在于在待處理的植物之上或之中或其周圍環(huán)境、生境或者儲存空間中。

如果以依次的方式施用或使用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑，則優(yōu)選按照以下方法處理植物或植物部位(包括種子和由種子萌發(fā)的植物)、采收的果實和蔬菜：首先，將至少一種本文所公開的特定殺真菌劑以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑施用于植物或植物部位；其次，將重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞施用于同一植物或植物部位。通過這種施用方式，采收時植物上殺蟲劑/殺真菌劑的殘留量盡可能地低。在(作物)生長周期內(nèi)的第一次施用和第二次施用之間的時間段可以改變并且取決于所要達到的效果。例如，進行第一次施用以防止植物或植物部位被昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體侵染(特別是在處理種子的情況下)，或?qū)估ハx、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的侵染(特別是在處理植物和植物部位的情況下)；進行第二次施用以防止或防治昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的侵染和/或促進植物生長。在本發(fā)明的上下文中，防治意指重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞并不能夠完全消滅害蟲或植物病原性真菌，但是能夠使侵染保持在可接受的水平上。

本發(fā)明還提供了通過多重施用而增強本發(fā)明組合物的殺死、抑制、預防和/或抵抗活性的方法。在一些其他的實施方案中，在任何需要的發(fā)育階段中或在任何預定的害蟲壓力下，以約1小時、約5小時、約10小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約1周、約10天、約2周、約3周、約1個月或更長時間的間隔，將本發(fā)明的組合物施用于植物和/或植物部位兩次。在一些實施方案中，在任何需要的發(fā)育階段中或在任何預定的害蟲壓力下，以約1小時、約5小時、約10小時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約1周、約10天、約2周、約3周、約1個月或更長時間的間隔，將本發(fā)明的組合物施用于植物和/或植物部位多于兩次(例如3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次)。如果需要，各施用之間的間隔可不同。本領域技術人員將能夠根據(jù)植物種類、植物害蟲種類和其他因素決定施用的次數(shù)和間隔長度。

通過按照前述步驟，在經(jīng)處理的植物、植物部位和采收的果實和蔬菜上可以實現(xiàn)至少一種殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑的非常低水平的殘留。

如果沒有另外提及，用本發(fā)明組合物對植物或植物部位(包括種子和由種子萌發(fā)的植物)、采收的果實和蔬菜的處理直接進行或作用于其周圍環(huán)境、生境或儲存空間，所述處理使用常規(guī)的處理方法(例如浸漬、噴霧、霧化、灌溉、蒸發(fā)、撒粉、彌霧(fogging)、撒播、發(fā)泡、涂抹(painting)、涂布(spreading-on)、澆水(浸濕)、滴灌)。還可以獨配制劑或組合制劑的形式以超低容量法施用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞、至少一種本文所公開的特定殺真菌劑以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑，或?qū)⒈景l(fā)明組合物以組合物或獨配制劑的形式注入到土壤中(犁溝中)。

術語“待處理的植物”涵蓋植物的每個部位，包括其根系和分別在待處理的植物的主莖或樹干附近至少10cm、20cm、30cm的半徑內(nèi)或在所述待處理植物的根系至少10cm、20cm、30cm附近的物質(zhì)(例如土壤或營養(yǎng)基質(zhì))。

任選在至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑的存在下，與至少一種本文所公開的特定殺真菌劑組合使用或施用的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的量取決于最終制劑以及待處理的植物、植物部位、種子、采收的果實或蔬菜的大小或種類。通常，根據(jù)本發(fā)明待施用或使用的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞以其獨配制劑或與至少一種本文所公開的特定殺真菌劑和任選的其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑的組合制劑的約1％至約80％(w/w)、優(yōu)選約1％至約60％(w/w)、更優(yōu)選約10％至約50％(w/w)存在。

同樣，任選在至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑的存在下，與重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞組合使用或施用的至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的量取決于最終制劑以及待處理的植物、植物部位、種子、采收的果實或蔬菜的大小或種類。通常，根據(jù)本發(fā)明待施用或使用的特定殺菌劑以其獨配制劑或與重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑的組合制劑的約1％至約80％(w/w)、優(yōu)選1％至約60％(w/w)、更優(yōu)選約10％至約50％(w/w)存在。

重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的施用可以葉面噴霧劑、土壤處理劑和/或種子處理劑/拌種劑的形式進行。當用作葉面處理劑時，在一個實施方案中，每英畝施用約1/16至約5加侖的全發(fā)酵液。當用作土壤處理劑時，在一個實施方案中，每英畝施用約1至約5加侖的全發(fā)酵液。當用于種子處理時，每英畝施用約1/32至約1/4加侖的全發(fā)酵液。對于種子處理，最終用途制劑包含至少1×10⁴、至少1×10⁵、至少1×10⁶、1×10⁷、至少1×10⁸、至少1×10⁹、至少1×10¹⁰個菌落形成單位/克。

以協(xié)同重量比使用或施用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑以及(如果優(yōu)選存在的話)其他殺真菌劑和/或殺蟲劑。技術人員能夠通過常規(guī)方法找到用于本發(fā)明的協(xié)同重量比。技術人員應理解，這些比例是指組合制劑內(nèi)的比例，以及當兩種組分以單一制劑的形式施用至待處理植物時，本文所述的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的計算比例。由于重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種特定殺真菌劑分別在單一制劑中的體積和量是技術人員已知的，因此，技術人員可通過簡單的數(shù)學計算出該比例。

所述比例可基于如下進行計算：在將本發(fā)明組合的所述組分施用于植物或植物部位的時間點時的所述至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的量，以及在將本發(fā)明組合的所述組分施用于植物或植物部位之前不久(例如，48h、24h、12h、6h、2h、1h)或該時間點時的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的量。

可將重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑同時或在不同時間施用于植物或植物部位，只要在一次或多次施用后兩種組分存在于植物上或植物內(nèi)即可。在重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和本文所公開的特定殺真菌劑在不同時間施用，且本文所公開的特定殺真菌劑在重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞之前施用的情況下，技術人員可通過本領域已知的化學分析測定在施用重組產(chǎn)外孢壁芽孢桿菌屬細胞的時間點或該時間點之前不久，殺真菌劑在植物上/內(nèi)的濃度。反之亦然，當首先將重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞施用于植物時，可使用本領域已知的測試在施用殺真菌劑的時間點或該時間點之前不久測定重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的濃度。

特別地，在一個實施方案中，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的協(xié)同重量比在1:1000至1000:1的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1:500至500:1的范圍內(nèi)，更優(yōu)選在1:300至500:1的范圍內(nèi)。尤其優(yōu)選的比例為20:1至1:20，如10:1、5:1或2:1。必須注意的是，這些比例范圍是指基于重組蠟樣芽胞桿菌家族成員的生物防治劑(待與至少一種本文所公開的特定殺真菌劑或至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的制劑組合)。例如，比例100:1意指100重量份的基于重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬的生物防治劑的孢子制劑與1重量份的本文所公開的特定殺真菌劑組合(作為獨配制劑、組合制劑或通過單獨施用于植物從而在植物上形成結合物)。在該實施方案的一方面，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞的孢子制品為干燥的孢子制品，其含有至少約1×10⁴cfu/g、至少約1×10⁵cfu/g、至少約1×10⁶cfu/g、至少約1×10⁷cfu/g、至少約1×10⁸cfu/g、至少約1×10⁹cfu/g、至少約1×10¹⁰cfu/g或至少約1×10¹¹cfu/g。

在另一個實施方案中，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的協(xié)同重量比在1:100至20,000:1的范圍內(nèi)，優(yōu)選在1:50至10,000:1的范圍內(nèi)或甚至在1:50至1000:1的范圍內(nèi)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞在分散后的濃度為至少50g/ha，如50-7500g/ha、50-2500g/ha、50-1500g/ha；至少250g/ha(公頃)，至少500g/ha或至少800g/ha。

根據(jù)本發(fā)明施用或使用的組合物的施用率可變化。技術人員能夠通過常規(guī)實驗找到合適的施用率。

在本發(fā)明的另一方面，提供了用如上所述的組合物處理的種子。

通過處理植物的種子來防治昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體是長期已知的并且是持續(xù)改進的主題。然而，種子處理涉及一系列不能總是以令人滿意的方式解決的問題。因此，需要開發(fā)用于保護種子和發(fā)芽植物的方法，所述方法不需要或至少顯著降低在植物的儲存過程中、播種后或出苗后額外遞送作物保護組合物的需要。此外，需要優(yōu)化所使用的活性成分的量，從而為種子和發(fā)芽植物提供最可能的保護以使其免受昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的攻擊，而所使用的活性成分不會損害植物本身。特別地，處理種子的方法還應考慮抵抗害蟲或耐受害蟲的轉(zhuǎn)基因植物固有的殺蟲或殺線蟲特性，以實現(xiàn)用最少量的作物保護組合物獲得對種子和發(fā)芽植物的最佳保護。

因此，本發(fā)明還特別涉及一種通過用協(xié)同有效量的如上所定義的重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑處理種子來保護種子和發(fā)芽植物免受害蟲攻擊的方法。本發(fā)明的用于保護種子和發(fā)芽植物免受害蟲攻擊的方法涵蓋這樣一種方法，其中用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑，在一次操作中同時處理種子。其還涵蓋這樣一種方法，其中用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑，在不同時間處理種子。

本發(fā)明還涉及本發(fā)明的組合物用于處理種子以保護種子和所得植物免受昆蟲、螨蟲、線蟲和/或植物病原體的侵襲的用途。

本發(fā)明還涉及已同時用重組產(chǎn)孢子外壁的芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑處理的種子。本發(fā)明還涉及已用重組產(chǎn)孢子外壁芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑在不同時間處理的種子。在已用重組產(chǎn)孢子外壁芽孢桿菌屬細胞和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑，以及任選的至少一種其他殺真菌劑和/或至少一種殺蟲劑在不同時間處理的種子的情況下，本發(fā)明組合物中的各活性成分可存在于種子上的不同層中。

此外，本發(fā)明涉及這樣的種子，其在用本發(fā)明的組合物處理之后，經(jīng)過薄膜包衣過程以防止灰塵對種子的磨損。

本發(fā)明的優(yōu)勢之一在于，由于本發(fā)明組合物的特定的系統(tǒng)特性，用這些組合物處理種子不僅為種子本身還為源自該種子的植物(在其出苗后)提供保護以免受昆蟲、螨蟲、線蟲/或植物病原體的侵襲。這樣，可不必在播種時或其后不久對作物直接進行處理。

另一個優(yōu)勢可見于事實：通過用本發(fā)明的組合物處理種子，可促進經(jīng)處理的種子的發(fā)芽和出苗。

同樣被認為有利的是，本發(fā)明的組合物還可特別地用于轉(zhuǎn)基因種子。

還應說明，本發(fā)明的組合物可與信號傳導技術試劑組合使用，其結果是，例如，改進了與共生體的集群(colonization)，增強了例如根瘤菌、菌根和/或植物內(nèi)生細菌，和/或優(yōu)化了固氮作用。

本發(fā)明的組合物適于保護在農(nóng)業(yè)、溫室、林業(yè)或園藝中使用的任何植物品種的種子。更具體地，所述種子為谷物(例如，小麥、大麥、黑麥、燕麥和粟)、玉米、棉花、大豆、稻、馬鈴薯、向日葵、咖啡豆、煙草、加拿大油菜(canola)、油菜、甜菜(例如，糖用甜菜和飼用甜菜)、花生、蔬菜(例如番茄、黃瓜、豆、十字花科蔬菜、洋蔥和萵苣)、果實植物、草坪和觀賞植物的種子。特別重要的是處理谷物(如小麥、大麥、黑麥和燕麥)、玉米、大豆、棉花、加拿大油菜、油菜和稻的種子。

如上已提及，用本發(fā)明的組合物處理轉(zhuǎn)基因種子是特別重要的。在此所述的種子為通常包含至少一種異源基因的植物的種子，所述異源基因控制具有(特別是)殺蟲和/或殺線蟲特性的多肽的表達。轉(zhuǎn)基因種子中的這些異源基因可源自微生物如芽孢桿菌屬、根瘤菌屬(rhizobium)、假單孢菌屬(pseudomonas)、沙雷氏菌屬(serratia)、木霉屬(trichoderma)、棒狀桿菌屬(clavibacter)、球囊霉屬(glomus)或者膠霉屬(gliocladium)。本發(fā)明特別適于處理包含至少一種源自芽孢桿菌屬種(bacillussp)的異源基因的轉(zhuǎn)基因種子。特別優(yōu)選地，所述異源基因源自蘇云金芽孢桿菌。

為了本發(fā)明的目的，將本發(fā)明的組合物單獨或以適合的制劑形式施用于種子。優(yōu)選在足夠穩(wěn)定以在處理過程中不發(fā)生損傷的狀態(tài)下處理種子。一般而言，可在采收和播種之間的任何時間點處理種子。通常，使用已從植物中分離并且已除去穗軸、外殼、莖、莢、毛或果肉的種子。因此，例如，可以使用已采收、清理且干燥至含水量小于15重量％的種子?；蛘撸部墒褂迷诟稍锖笥美缢幚砣缓笤俑稍锏姆N子。

一般而言，當處理種子時，必須確保施用于種子的本發(fā)明組合物的量和/或其他添加劑的量經(jīng)過選擇以使種子的發(fā)芽不受到不利影響，和/或由該種子萌發(fā)的植物不受到損傷。特別是在特定施用率下可表現(xiàn)出植物毒性作用的活性成分的情況下。

本發(fā)明的組合物可直接施用，換言之，不包含其他組分且不經(jīng)稀釋。通常，優(yōu)選以合適的制劑形式將組合物施用于種子。用于處理種子的合適的制劑和方法是技術人員已知的并且記載于例如以下文獻中：美國專利no.4,272,417a、no.4,245,432a、no.4,808,430a、no.5,876,739a；美國專利公開no.2003/0176428a1；wo2002/080675a1；wo2002/028186a2。

根據(jù)本發(fā)明可使用的結合物可以轉(zhuǎn)化成常規(guī)拌種制劑，如溶液劑、乳劑、懸浮劑、粉劑、泡沫劑、漿劑或其他種子包衣組合物，以及ulv制劑。

這些制劑可用已知方式通過將組合物與常規(guī)佐劑混合而制備，所述常規(guī)佐劑為，例如，常規(guī)填充劑以及溶劑或稀釋劑、著色劑、潤濕劑、分散劑、乳化劑、消泡劑、防腐劑、二次增稠劑、粘著劑、赤霉素以及水。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的著色劑包括常規(guī)用于此目的的所有著色劑。在本文中，不僅可以使用具有低水溶性的顏料，也可以使用水溶性的染料。實例包括已知的名稱為羅丹明b、c.i.顏料紅112和c.i.溶劑紅1的著色劑。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的潤濕劑包括促進潤濕且常規(guī)用于活性農(nóng)用化學成分的制劑的所有物質(zhì)。優(yōu)選使用烷基萘磺酸鹽，如二異丙基萘磺酸鹽或二異丁基萘磺酸鹽。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的分散劑和/或乳化劑包括常規(guī)用于活性農(nóng)用化學成分的制劑的所有非離子、陰離子和陽離子分散劑。優(yōu)選使用非離子或陰離子分散劑，或非離子或陰離子分散劑的混合物。合適的非離子分散劑特別為環(huán)氧乙烷-環(huán)氧丙烷嵌段聚合物、烷基酚聚乙二醇醚以及三苯乙烯基酚聚乙二醇醚，及其磷酸化或硫酸化衍生物。合適的陰離子分散劑特別為木素磺酸鹽、聚丙烯酸鹽和芳基磺酸鹽-甲醛縮合物。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的消泡劑包括常規(guī)用于活性農(nóng)用化學成分的制劑的所有泡沫抑制劑?？蓛?yōu)選使用有機硅消泡劑和硬脂酸鎂。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的防腐劑包括在農(nóng)用化學組合物中可用于此目的的所有物質(zhì)。實例包括雙氯酚和芐醇半縮甲醛。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的二次增稠劑包括在農(nóng)用化學組合物中可用于此目的的所有物質(zhì)。優(yōu)選考慮的那些二次增稠劑包括纖維素衍生物、丙烯酸衍生物、黃原膠、改性粘土以及高度分散的二氧化硅。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的粘著劑包括可用于拌種產(chǎn)品中的所有常規(guī)粘合劑?？蓛?yōu)選提及聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和甲基纖維素。

可存在于可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑中的赤霉素優(yōu)選包括赤霉素a1、a3(＝赤霉酸)、a4和a7；特別優(yōu)選使用赤霉酸。赤霉素是已知的(參見r.wegler“chemiederpflanzenschutz-und”，第2卷，springerverlag，1970，第401-412頁)。

可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑可以直接地或在先用水稀釋后用于處理各種不同種類的任何種子。因此，所述濃縮劑或可通過用水稀釋而由其獲得的制劑可用于對以下植物的種子進行拌種：谷物如小麥、大麥、黑麥、燕麥和黑小麥，以及玉米、稻、油菜、豌豆、豆、棉花、向日葵和甜菜，或各種不同蔬菜中任一種的種子?？筛鶕?jù)本發(fā)明使用的拌種制劑或其稀釋制劑也可用于轉(zhuǎn)基因植物的拌種。在這種情況下，在與通過表達形成的物質(zhì)的相互作用中還可產(chǎn)生額外的協(xié)同效應。

對于用可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑或通過加入水而由其制得的制劑處理種子而言，合適的混合設備包括通?？捎糜诎璺N的所有的這種設備。更具體地，進行拌種的過程是：將種子置于混合器內(nèi)，加入特定所需量的拌種制劑(以其本身或預先用水稀釋后)，并進行混合直到制劑均勻地分布在種子上。隨后可進行干燥操作。

可根據(jù)本發(fā)明使用的拌種制劑的施用率可在相對寬的范圍內(nèi)變化。施用率由制劑中的基于重組蠟樣芽孢桿菌家族成員的生物防治劑和至少一種本文所公開的特定殺真菌劑的具體含量和種子決定。在組合物的情況下，施用率通常為0.001至50g/kg種子，優(yōu)選為0.01至15g/kg種子。

此外，本發(fā)明的組合物優(yōu)選具有潛在的殺微生物活性并可在作物保護和材料保護中用于防治不想要的微生物，如真菌和細菌。

本發(fā)明還涉及一種用于防治不想要的微生物的方法，其特征在于，將本發(fā)明的組合物施用于植物病原性真菌、植物病原性細菌和/或其生境。

殺真菌劑可在作物保護中用于防治植物病原性真菌。所述殺真菌劑的特征在于，在對抗廣譜的植物病原性真菌方面有突出的功效，所述植物病原性真菌包括土壤傳播的病原體，其特別是根腫菌綱(plasmodiophoromycetes)、卵菌綱(peronosporomycetes(同義詞，卵菌綱(oomycetes))、壺菌綱(chytridiomycetes)、接合菌綱(zygomycetes)、子囊菌綱(ascomycetes)、擔子菌綱(basidiomycetes)和半知菌綱(deuteromycetes)(同義詞：不完全真菌綱(fungiimperfecti))的成員。一些殺真菌劑具有全身性活性并可在作物保護中用作葉子殺真菌劑、拌種殺真菌劑或土壤殺真菌劑。此外，它們適于對抗尤其是侵襲植物的木質(zhì)或根部的真菌。

殺細菌劑可在作物保護中用于防治假單孢菌科(pseudomonadaceae)、根瘤菌科(rhizobiaceae)、腸桿菌科(enterobacteriaceae)、棒狀桿菌科(corynebacteriaceae)和鏈霉菌科(streptomycetaceae)。

可根據(jù)本發(fā)明處理的真菌性病害的病原體的非限制性實例包括：

由白粉病病原體引起的病害，例如布氏白粉菌屬(blumeria)菌種，例如禾本科布氏白粉菌(blumeriagraminis)；叉絲單囊殼屬(podosphaera)菌種，例如白叉絲單囊殼(podosphaeraleucotricha)；單囊殼屬(sphaerotheca)菌種，例如鳳仙花單囊殼(sphaerothecafuliginea)；鉤絲殼屬(uncinula)菌種，例如葡萄鉤絲殼(uncinulanecator)；

由銹病病原體引起的病害，例如膠銹菌屬(gymnosporangium)菌種，例如褐色膠銹菌(gymnosporangiumsabinae)；駝孢銹屬(hemileia)菌種，例如咖啡駝孢銹菌(hemileiavastatrix)；層銹菌屬(phakopsora)菌種，例如豆薯層銹菌(phakopsorapachyrhizi)和山馬蝗層銹菌(phakopsorameibomiae)；柄銹菌屬(puccinia)菌種，例如隱匿柄銹菌(pucciniarecondita)、小麥葉銹病菌(p.triticina)、小麥桿銹菌(p.graminis)或小麥條銹菌(p.striiformis)；單胞銹菌屬(uromyces)菌種，例如疣頂單胞銹菌(uromycesappendiculatus)；

由卵菌綱(oomycete)病原體引起的病害，例如，白銹屬(albugo)菌種，例如白銹菌(albugocandida)；盤霜霉屬(bremia)菌種，例如萵苣盤霜霉(bremialactucae)；霜霉屬(peronospora)菌種，例如豌豆霜霉(peronosporapisi)或十字花科霜霉(peronosporabrassicae)；疫霉屬(phytophthora)菌種，例如致病疫霉(phytophthorainfestans)；軸霜霉屬(plasmopara)菌種，例如葡萄生軸霜霉(plasmoparaviticola)；假霜霉屬(pseudoperonospora)菌種，例如草假霜霉(pseudoperonosporahumuli)或古巴假霜霉(pseudoperonosporacubensis)；腐霉屬(pythium)菌種，例如終極腐霉(pythiumultimum)；

由下述病原體引起的葉斑枯病(leafblotch)和葉萎蔫病(leafwilt)病害：例如，鏈格孢屬(alternaria)菌種，例如早疫病鏈格孢(alternariasolani)；尾孢屬(cercospora)菌種，例如菾菜生尾孢(cercosporabeticola)；枝孢(cladiosporium)屬，例如黃瓜枝孢(cladiosporiumcucumerinum)；旋孢腔菌屬(cochliobolus)菌種，例如禾旋孢腔菌(cochliobolussativus)(分生孢子形式：德氏霉屬(drechslera)，同義詞：長蠕孢屬(helminthosporium))、宮部旋孢霉(cochliobolusmiyabeanus)；炭疽菌屬(colletotrichum)菌種，例如菜豆炭疽菌(colletotrichumlindemuthanium)；銹斑病菌屬(cycloconium)菌種，例如孔雀斑病(cycloconiumoleaginum)；間座殼屬(diaporthe)菌種，例如柑桔間座殼(diaporthecitri)；痂囊腔菌屬(elsinoe)菌種，例如柑桔痂囊腔菌(elsinoefawcettii)；盤長孢屬(gloeosporium)菌種，例如悅色盤長孢(gloeosporiumlaeticolor)；小叢殼(glomerella)屬，例如圍小叢殼(glomerellacingulata)；球座菌屬(guignardia)菌種，例如葡萄球座菌(guignardiabidwelli)；小球腔菌屬(leptosphaeria)菌種，例如斑污小球腔菌(leptosphaeriamaculans)；大毀殼屬(magnaporthe)菌種，例如灰色大毀殼(magnaporthegrisea)；微座孢屬(microdochium)菌種，例如雪霉微座孢(microdochiumnivale)；球腔菌屬(mycosphaerella)菌種，例如禾生球腔菌(mycosphaerellagraminicola)、落花生球腔菌(m.arachidicola)和斐濟球腔菌(m.fijiensis)；殼針孢屬(phaeosphaeria)菌種，例如穎枯殼針孢(phaeosphaerianodorum)；核腔菌屬(pyrenophora)菌種，例如圓核腔菌(pyrenophorateres)、偃麥草核腔菌(pyrenophoratriticirepentis)；柱隔孢屬(ramularia)菌種，例如辛加柱隔孢(ramulariacollo-cygni)、白斑柱隔孢(ramulariaareola)；喙孢屬(rhynchosporium)菌種，例如黑麥喙孢(rhynchosporiumsecalis)；針孢屬(septoria)菌種，例如芹菜小殼針孢(septoriaapii)、番茄殼針孢(septorialycopersii)；核瑚菌屬(typhula)菌種，例如肉孢核瑚菌(typhulaincarnata)；黑星菌屬(venturia)菌種，例如蘋果黑星病菌(venturiainaequalis)；

由下述病原體引起的根和莖病害：例如，伏革菌屬(corticium)菌種，例如禾伏革菌(corticiumgraminearum)；鐮孢屬(fusarium)菌種，例如尖鐮孢(fusariumoxysporum)；頂囊殼屬(gaeumannomyces)菌種，例如禾頂囊殼(gaeumannomycesgraminis)；絲核菌屬(rhizoctonia)菌種，例如立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)；由例如稻帚枝桿孢(sarocladiumoryzae)引起的帚枝桿孢屬(sarocladium)病害；由例如稻腐小核菌(sclerotiumoryzae)引起的小核菌屬(sclerotium)病害；塔普斯屬(tapesia)菌種，例如塔普斯梭狀芽孢桿菌(tapesiaacuformis)；根串珠霉屬(thielaviopsis)菌種，例如根串珠霉(thielaviopsisbasicola)；

由下述病原體引起的肉穗花序或散穗花序病害(包括玉米穗軸)：例如，鏈格孢屬(alternaria)菌種，例如鏈格孢屬(alternariaspp.)；曲霉屬(aspergillus)菌種，例如黃曲霉(aspergillusflavus)；枝孢屬(cladosporium)菌種，例如芽枝狀枝孢(cladosporiumcladosporioides)；麥角菌屬(claviceps)菌種，例如麥角菌(clavicepspurpurea)；鐮孢屬(fusarium)菌種，例如黃色鐮孢(fusariumculmorum)；赤霉屬(gibberella)菌種，例如玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)；小畫線殼屬(monographella)菌種，例如雪腐小畫線殼(monographellanivalis)；殼針孢屬(septoria)菌種，例如狗牙根殼針孢(septorianodorum)；

由黑粉菌引起的病害，例如，軸黑粉菌屬(sphacelotheca)菌種，例如絲孢堆黑粉菌(sphacelothecareiliana)；腥黑粉菌屬(tilletia)菌種，例如小麥網(wǎng)腥黑粉菌(tilletiacaries)、小麥矮腥黑粉菌(t.controversa)；條黑粉菌屬(urocystis)菌種，例如隱條黑粉菌(urocystisocculta)；黑粉菌屬(ustilago)菌種，例如裸黑粉菌(ustilagonuda)、小麥散黑粉菌(u.nudatritici)；

由例如下列病原體導致的果實腐爛?。呵箤?aspergillus)菌種，例如黃曲霉(aspergillusflavus)；葡萄孢屬(botrytis)菌種，例如灰葡萄孢(botrytiscinerea)；青霉屬(penicillium)菌種，例如擴展青霉(penicilliumexpansum)和產(chǎn)紫青霉(p.purpurogenum)；核盤菌屬(sclerotinia)菌種，例如核盤菌(sclerotiniasclerotiorum)；輪枝菌屬(verticilium)菌種，例如黑白輪枝菌(verticiliumalboatrum)；

由例如下述病原體引起的種子腐爛和土壤傳播的腐爛、發(fā)霉、萎蔫、腐爛和立枯?。豪?，鏈格孢屬(alternaria)菌種，例如蕓薹鏈格孢(alternariabrassicicola)；絲囊霉屬(aphanomyces)菌種，例如根腐絲囊霉(aphanomyceseuteiches)；殼二孢屬(ascochyta)菌種，例如兵豆殼二孢(ascochytalentis)；曲霉屬菌種，例如黃曲霉(aspergillusflavus)；枝孢屬(cladosporium)菌種，例如草本枝孢(cladosporiumherbarum)；旋孢腔菌屬(cochliobolus)菌種，例如禾旋孢腔菌(cochliobolussativus)(分生孢子形式：德氏霉屬，平臍蠕孢屬(bipolaris)又名：長蠕孢菌(helminthosporium))；炭疽菌屬(colletotrichum)菌種，例如毛核炭疽菌(colletotrichumcoccodes)；鐮孢屬(fusarium)菌種，例如黃色鐮孢(fusariumculmorum)；赤霉屬(gibberella)菌種，例如玉蜀黍赤霉(gibberellazeae)；殼球孢屬(macrophomina)菌種，例如菜豆殼球孢(macrophominaphaseolina)；小畫線殼屬(monographella)菌種，例如雪腐小畫線殼(monographellanivalis)；青霉屬(penicillium)菌種，例如擴展青霉(penicilliumexpansum)；莖點霉屬(phoma)菌種，例如黑脛莖點霉(phomalingam)；擬莖點霉屬(phomopsisspecies)菌種，例如大豆擬莖點霉(phomopsissojae)；疫霉屬(phytophthora)菌種，例如惡疫霉(phytophthoracactorum)；核腔菌屬(pyrenophora)菌種，例如麥類核腔菌(pyrenophoragraminea)；梨孢屬(pyricularia)菌種，例如稻梨孢(pyriculariaoryzae)；腐霉屬(pythium)菌種，例如終極腐霉(pythiumultimum)；絲核菌屬(rhizoctonia)菌種，例如立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)；根霉菌屬(rhizopus)菌種，例如稻根霉菌(rhizopusoryzae)；小核菌屬(sclerotium)菌種，例如齊整小核菌(sclerotiumrolfsii)；殼針孢屬(septoria)菌種，例如穎枯殼針孢(septorianodorum)；核瑚菌屬(typhula)菌種，例如肉孢核瑚菌(typhulaincarnata)；輪枝孢菌屬(verticillium)菌種，例如大麗花輪枝孢(verticilliumdahliae)；

由例如叢赤殼屬(nectria)菌種(例如干癌叢赤殼菌(nectriagalligena))引起的癌性病害、菌癭和從枝病(witches’broom)；

由例如鏈核盤菌屬(monilinia)菌種(例如核果鏈核盤菌(monilinialaxa))引起的萎縮病害；

由下述病原體引起的葉皰病和卷葉?。豪缤鈸鷮?exobasidium)菌種，例如壞損外擔菌(exobasidiumvexans)；外囊菌屬(taphrina)菌種，例如畸形外囊菌(taphrinadeformans)；

由下述病原體引起的木本植物退化病害：例如由根霉格孢菌(phaeomoniellachlamydospora)、雞腿蘑絲孢(phaeoacremoniumaleophilum)和地中海孢孔菌(fomitiporiamediterranea)引起的依科病(esca)；例如由葡萄頂枯菌(eutypalata)引起的葡萄頂枯病(eutypadyeback)；例如由孢靈芝(ganodermaboninense)引起的靈芝病害；例如由木硬孔菌(rigidoporuslignosus)引起的硬孔菌病害；

由下述病原體引起的花和種子的病害：例如，葡萄孢屬(botrytis)菌種，例如灰葡萄孢(botrytiscinerea)；

由下述病原體引起的植物塊莖的病害：例如，絲核菌屬(rhizoctonia)菌種，例如立枯絲核菌(rhizoctoniasolani)；長蠕孢菌屬(helminthosporium)菌種，例如茄病長蠕孢(helminthosporiumsolani)；

由下述病原體引起的根腫病：例如，根腫菌屬(plasmodiophora)菌種，例如甘藍根腫菌(plamodiophorabrassicae)；

由下述細菌病原體引起的病害：例如，黃單胞菌屬(xanthomonas)菌種，例如稻黃單胞菌白葉枯變種(xanthomonascampestrispv.oryzae)；假單胞菌屬(pseudomonas)菌種，例如丁香假單胞菌黃瓜致病變種(pseudomonassyringaepv.lachrymans)；歐文氏菌屬(erwinia)菌種，例如噬淀粉歐文氏菌(erwiniaamylovora)。

優(yōu)選防治下列大豆病害：

由下述病原體所致的葉、莖、莢和種子的真菌類病害：例如，輪紋葉斑病(alternarialeafspot)(alternariaspec.atranstenuissima)、炭疽病(anthracnose)(colletotrichumgloeosporoidesdematiumvar.truncatum)、褐斑病(brownspot)(大豆殼針孢(septoriaglycines))、桃葉穿孔病和葉枯病(菊池尾孢(cercosporakikuchii))、笄霉葉枯病(漏斗笄霉(choanephorainfundibuliferatrispora(同義詞)))、葉斑病(dactuliophoraleafspot)(dactuliophoraglycines)、大豆霜霉病(downymildew)(東北霜霉(peronosporamanshurica))、內(nèi)臍蠕孢枯萎病(drechsleraglycini)、蛙眼病(frogeyeleafspot)(大豆尾孢(cercosporasojina))、菜豆葉斑病(leptosphaerulinaleafspot)(三葉草小光殼(leptosphaerulinatrifolii))、葉點霉葉斑病(phyllosticaleafspot)(大豆生葉點霉(phyllostictasojaecola))、莢和莖枯萎病(大豆擬莖點霉(phomopsissojae))、白粉病(microsphaeradiffusa)、棘殼孢葉斑病(pyrenochaetaleafspot)(pyrenochaetaglycines)、絲核菌地上部分(rhizoctoniaaerial)、葉枯病和立枯病(foliageandwebblight)(立枯絲核菌(rhizoctoniasolani))、銹病(豆薯層銹菌(phakopsorapachyrhizi))、山馬蝗層銹菌(phakopsorameibomiae))、黑星病(scab)(大豆痂圓孢(sphacelomaglycines))；匍柄霉葉枯病(匍柄霉(stemphyliumbotryosum))；靶斑病(targetspot)(山扁豆生棒孢(corynesporacassiicola))。

由下述病原體引起的位于根部和莖基部的真菌類病害：例如，黑色根腐病(blackrootrot)(野百合麗赤殼菌(calonectriacrotalariae))、炭腐病(菜豆生殼球孢(macrophominaphaseolina))、鐮孢枯萎病或萎蔫、根腐以及莢和根頸腐爛病(尖鐮孢(fusariumoxysporum)、直喙鐮孢(fusariumorthoceras)、半裸鐮孢(fusariumsemitectum)、木賊鐮孢(fusariumequiseti))、mycoleptodiscus根腐病(mycoleptodiscusterrestris)、新赤殼屬病(neocosmospora)(侵菅新赤殼(neocosmopsporavasinfecta))、莢和莖疫病(podandstemblight)(菜豆間座殼(diaporthephaseolorum))、莖潰瘍(大豆北方莖潰瘍病菌(diaporthephaseolorumvar.caulivora))、疫霉腐病(大雄疫霉(phytophthoramegasperma))、褐莖腐病(大豆莖褐腐病菌(phialophoragregata))、腐霉病(pythiumrot)(瓜果腐霉(pythiumaphanidermatum))、畸雌腐霉(pythiumirregulare)、德巴利腐霉(pythiumdebaryanum)、群結腐霉(pythiummyriotylum)、終極腐霉(pythiumultimum))、絲核菌根腐病、莖腐(stemdecay)和立枯病(立枯絲核菌(rhizoctoniasolani))、核盤菌莖腐病(sclerotiniastemdecay)(核盤菌(sclerotiniasclerotiorum))、核盤菌白絹病(sclerotiniasouthernblight)(sclerotiniarolfsii)、根串珠霉根腐病(thielaviopsisrootrot)(根串珠霉(thielaviopsisbasicola))。

本發(fā)明的組合物可用于治療性地或保護性/預防性地防治植物病原性真菌。因此，本發(fā)明還涉及通過使用本發(fā)明的組合物——其施用至種子、植物或植物部分、果實或植物生長于其中的土壤——防治植物病原性真菌的治療性和保護性方法。

所述組合物在防治植物病害所需的濃度下被植物良好地耐受，這一事實允許處理植物的地上部位、繁殖材料和種子，以及土壤。

根據(jù)本發(fā)明，可處理所有植物和植物部分。植物是指所有植物和植物種群，例如需要和不需要的野生植物、栽培種和植物變種(不論是否受植物品種或植物育種者權利的保護)。栽培種和植物變種可以是通過傳統(tǒng)的繁殖和育種方法(其可由一種或多種生物技術方法如通過使用雙單倍體、原生質(zhì)體融合、隨機和定點突變、分子或遺傳標記物輔助或補充)或通過生物工程與基因工程方法獲得的植物。植物部分是指植物的所有地上和地下部分和植物器官如芽、葉、花和根，可列舉的實例為葉、針葉、莖、干、花、子實體、果實和種子，以及根、塊莖和根莖。作物以及無性繁殖和有性繁殖物，例如插枝、球莖、根莖、分檗和種子也屬于植物部分。

當本發(fā)明的組合物具有良好的植物耐受性、具有有利的溫血動物毒性，以及良好的環(huán)境相容性時，適用于保護植物和植物器官，提高采收產(chǎn)量，改善采收材料的質(zhì)量。它們可被優(yōu)選用作作物保護組合物。它們對通常敏感和抗性物種以及全部或一些發(fā)育階段具有活性。

可依照本發(fā)明處理的植物包括以下主要作物植物：玉米、大豆、紫花苜蓿、棉花、向日葵、蕓苔油籽如甘藍型油菜(如加拿大油菜、油菜籽)、蕓苔(brassicarapa)、芥菜型油菜(b.juncea)(如(田野)芥菜)和伊索比亞芥菜(brassicacarinata)、棕櫚科屬種(arecaceaesp.)(例如油棕、椰子)、稻、小麥、甜菜、甘蔗、燕麥、黑麥、大麥、粟和高粱、黑小麥、亞麻、堅果、葡萄和藤本植物以及來自多種植物分類群的果實和蔬菜，例如薔薇科屬種(rosaceaesp.)(例如仁果，如蘋果和梨；以及核果，如杏、櫻桃、扁桃、李子和桃；和漿果，如草莓、樹莓、黑茶藨子和紅茶藨子以及醋栗)、茶藨子科屬種(ribesioidaesp.)、胡桃科屬種(juglandaceaesp.)、樺木科屬種(betulaceaesp.)、漆樹科屬種(anacardiaceaesp.)、殼斗科屬種(fagaceaesp.)、?？茖俜N(moraceaesp.)、木犀科屬種(oleaceaesp.)(如橄欖樹)、獼猴桃科屬種(actinidaceaesp.)、樟科屬種(lauraceaesp.)(例如鱷梨、肉桂、樟腦)、芭蕉科屬種(musaceaesp.)(例如香蕉樹和香蕉種植園)、茜草科屬種(rubiaceaesp.)(例如咖啡)、山茶科屬種(theaceaesp.)(例如茶樹)、梧桐科屬種(sterculiceaesp.)、蕓香科屬種(rutaceaesp.)(例如檸檬、橙子、柑橘和葡萄柚)、茄科屬種(solanaceaesp.)(例如番茄、馬鈴薯、胡椒、辣椒、茄子和煙草)、百合科屬種(liliaceaesp.)、菊科屬種(compositiaesp.)(例如萵苣、洋薊和菊苣--包括根菊苣、苦苣或普通菊苣)、傘形科屬種(umbelliferaesp.)(例如胡蘿卜、西芹、芹菜和塊根芹)、葫蘆科屬種(cucurbitaceaesp.)(例如黃瓜--包括小黃瓜、南瓜、西瓜、葫蘆類和甜瓜類)、蔥科屬種(alliaceaesp.)(例如韭蔥類和洋蔥類)、十字花科屬種(cruciferaesp.)(例如白球甘藍、紅球甘藍、椰菜、花椰菜、抱子甘藍、小白菜、球莖甘藍、蘿卜、辣根、水芹和大白菜)、豆科屬種(leguminosaesp.)(例如花生、豌豆類、扁豆類和豆類--如菜豆(commonbeans)和蠶豆(broadbeans))、藜科屬種(chenopodiaceaesp.)(例如瑞士甜菜(swisschard)、飼用甜菜、菠菜、甜菜根)、亞麻科屬種(linaceaesp.)(如大麻)、大麻科屬種(cannabeaceasp.)(例如大麻)、錦葵科屬種(malvaceaesp.)(例如黃秋葵、可可)、罌粟科屬種(papaveraceae)(例如罌粟)、天門冬科(asparagaceae)(例如蘆筍)；園藝和森林中的有用植物和觀賞植物，如草皮、草地、草坪和甜葉菊(steviarebaudiana)；以及所述植物各自的轉(zhuǎn)基因品種。

根據(jù)植物種或植物栽培種、其位置和生長條件(土壤、氣候、生長期、營養(yǎng)(diet))，使用或施用本發(fā)明的組合物，本發(fā)明的處理還可產(chǎn)生超加性(“協(xié)同”)效應。因此，例如通過在本發(fā)明的處理中使用或施用本發(fā)明的組合物可獲得如下超過實際預期的效果：降低施用率和/或拓寬活性譜和/或提高活性、改善植物生長，增強對高溫或低溫的耐受性、增強對干旱或水或土壤鹽含量的耐受性、提高開花品質(zhì)、使采收更簡易、加速成熟、提高采收量、使果實更大、使植物更高、使葉色更綠、使開花更早、提高采收產(chǎn)品的品質(zhì)和/或提高其營養(yǎng)價值、提高果實內(nèi)的糖濃度、改善采收產(chǎn)品的貯存穩(wěn)定性和/或其加工性。

在本發(fā)明的處理中，本發(fā)明的組合物在一定的施用率下還可對植物具有強化作用。植物抵抗不想要的植物致病性真菌和/或微生物和/或病毒攻擊的防御體系被調(diào)動起來。在本文中，植物強化(抗性誘導)物質(zhì)應理解為意指能夠以這樣一種方式刺激植物防御體系的那些物質(zhì)或物質(zhì)的組合，即當隨后用不想要的植物致病性真菌和/或微生物和/或病毒接種時，經(jīng)處理的植物對這些植物致病性真菌和/或微生物和/或病毒表現(xiàn)出很大程度的抗性。因此，通過在本發(fā)明的處理中使用或利用本發(fā)明的組合物，可在處理后的一定時期內(nèi)保護植物免受上述病原體的攻擊。產(chǎn)生保護作用的時間段通常為在用活性化合物處理植物之后的1至10天，優(yōu)選1至7天。

還優(yōu)選根據(jù)本發(fā)明進行處理的植物和植物栽培種對一種或多種生物脅迫具有抗性，即所述植物對動物和微生物有害物(例如對線蟲、昆蟲、螨蟲、植物病原性真菌、細菌、病毒和/或類病毒)表現(xiàn)出更好的防御。

還可根據(jù)本發(fā)明進行處理的植物和植物栽培種是對一種或多種非生物脅迫具有抗性的那些植物，即已經(jīng)在脅迫耐受性方面表現(xiàn)出提高的植物健康的植物。非生物脅迫條件可包括，例如干旱、低溫暴露、熱暴露、滲透脅迫、水澇、增加的土壤含鹽量、增加的礦物質(zhì)暴露、臭氧暴露、強光暴露、有限的氮營養(yǎng)素利用度、有限的磷營養(yǎng)素利用度、避蔭。優(yōu)選地，用本發(fā)明的組合物對這些植物和栽培種的處理還提高了植物整體健康(參見上文)。

還可根據(jù)本發(fā)明進行處理的植物和植物栽培種是以增強的產(chǎn)量特性為特征的那些植物，即在此特性方面表現(xiàn)出提高的植物健康的植物。所述植物中提高的產(chǎn)量可以是以下因素的結果：例如，改進的植物生理機能、生長和發(fā)育，如水利用效率、水保持效率；改善的氮利用；增強的碳同化作用；改善的光合作用；提高的發(fā)芽率和加速的成熟。

產(chǎn)量還可受到改進的植物結構(plantarchitecture)的影響(在脅迫和非脅迫條件下)，包括但不限于，提早開花、對雜種制種的開花控制、幼苗活力、植物大小、節(jié)間數(shù)和節(jié)間距、根部生長、種子大小、果實大小、莢果大小、莢果數(shù)或穗數(shù)、每個莢果或穗的種子數(shù)、種子質(zhì)量、提高的種子飽滿度、減少的種子散布、減少的莢開裂以及抗倒伏性。其他產(chǎn)量特征包括種子組成，如碳水化合物含量、蛋白質(zhì)含量、油含量和組成、營養(yǎng)價值、抗營養(yǎng)化合物的減少、改善的加工性和更好的儲存穩(wěn)定性。優(yōu)選地，用本發(fā)明的組合物對這些植物和栽培種進行處理還提高了植物的整體健康(參見上文)。

可根據(jù)本發(fā)明進行處理的植物為已表達出雜種優(yōu)勢或雜種活力特征的雜種植物，所述特征通常導致更高的產(chǎn)量、活力、健康度以及對生物和非生物脅迫因素的抗性。這類植物通常由一種自交雄性不育親本系(母本)與另一種自交雄性能育親本系(父本)雜交而制得。雜種種子通常從雄性不育植株中采收并售給種植者。雄性不育植株有時(例如在玉米中)可通過去雄(即，機械地除去雄性繁殖器官(或雄花))制得，但是，更通常地，雄性不育是由植物基因組中的遺傳決定子導致的。在這種情況下，尤其是當種子是待從雜種植物上采收的所需產(chǎn)品時，確保雜種植物中的雄性能育性的完全恢復通常是有用的。這可通過確保父本具有適當?shù)挠曰謴突騺韺崿F(xiàn)，該基因能夠恢復含有造成雄性不育的遺傳決定子的雜種植物的雄性能育性。雄性不育的遺傳決定子可位于細胞質(zhì)中。細胞質(zhì)雄性不育(cms)的實例例如在蕓苔屬種中有描述。然而，雄性不育的遺傳決定子也可位于細胞核基因組中。雄性不育植物也可通過植物生物技術方法如基因工程而獲得。一種獲得雄性不育植物的特別有用的方法記載于wo89/10396中，其中，例如核糖核酸酶(如芽孢桿菌rna酶)在雄蕊的絨氈層細胞中選擇性地表達。隨后可以通過在絨氈層細胞中表達核糖核酸酶抑制因子如芽孢桿菌rna酶抑制因子來恢復能育性。

可根據(jù)本發(fā)明進行處理的植物或植物栽培種(通過植物生物技術方法如基因工程而獲得)是除草劑耐受性植物，即對一種或多種給定除草劑具有耐受性的植物。這類植物可通過遺傳轉(zhuǎn)化或通過選擇含有賦予所述除草劑耐受性的突變的植物而獲得。

實施例

實施例1：用于多種活性成分的結合物的功效的公式

當活性成分結合物的活性超過活性成分單獨施用時的活性的總和時，存在活性成分的協(xié)同效應。給定的兩種活性成分的結合物的預期活性可如下計算(參見colby,s.r.，“calculatingsynergisticandantagonisticresponsesofherbicidecombinations，”weeds1967，15，20-22)：

如果

x為以mppm(或g/ha)的施用率施用活性成分a時的功效，

y為以nppm(或g/ha)的施用率施用活性成分b時的功效，

e為分別以m和nppm(或g/ha)的施用率施用活性成分a和b時的功效，

那么

如果實際的活性超過計算值，則所述結合物的活性具有超加性，即存在協(xié)同效應。在這種情況下，實際觀察到的功效一定大于由上述公式計算的預期功效(e)值。

例如，所述公式和分析可用于植物生長促進的評估。在施用于植物后數(shù)天評估這樣的測定。100％意指相當于未經(jīng)處理的對照植物的重量的植物重量。在這種情況下，功效意指與未經(jīng)處理的對照的重量相比，額外的植物重量％。例如，與未經(jīng)處理的對照植物相比，產(chǎn)生植物重量為120％的處理的功效為20％。如果結合物的植物生長促進作用(即，對于用結合物處理的植物的植物重量％，所觀察到的功效)超過計算值，則結合物的活性是超加性的，即存在協(xié)同效應。

所述公式和分析還可用于在病害防治測定中評估協(xié)同作用。功效的程度以％表示。0％意指相當于對照的功效，而100％的功效意指未觀察到病害。

如果實際的殺蟲或殺真菌活性超過計算值，則所述結合物的活性具有超加性，即存在協(xié)同效應。在這種情況下，實際觀察到的功效一定大于由上述公式計算的預期功效(e)值。

證實協(xié)同效應的另一種方式是tammes法(參見“isoboles，agraphicrepresentationofsynergisminpesticides”neth.j.plantpath.，1964，70，73-80)。

實施例2：使用肟菌酯和重組蘇云金芽孢桿菌細胞促進植物生長

進行實驗以分析肟菌酯與表達內(nèi)切葡聚糖酶的重組蘇云金芽孢桿菌細胞(“bee”)的發(fā)酵產(chǎn)物的結合物的功效。在25-28℃和50％濕度的植物生長室中，使玉米種子在輕型架(lightracks)上的小型三英寸方盆中的合成介質(zhì)和沙子的無菌混合物中生長約14天。在每盆中種植兩粒種子。在種植時，每個盆中的生長介質(zhì)都用下述處理劑浸透。14天后，測量植株的整個植株生物量。在下表中，utc是指未經(jīng)處理的對照?！坝嬎阒怠笔侵甘褂蒙鲜鯿olby方程計算的預期效果，“功效”是指所觀察到的實際效果。

將含有肟菌酯作為其活性成分(22％肟菌酯)的產(chǎn)品在50ml水中稀釋，并將稀釋的溶液用于浸透生長介質(zhì)。以下所示的施用率是指施用于生長介質(zhì)的活性成分(即肟菌酯)的量。

如下生成在其孢子外壁上表達內(nèi)切葡聚糖酶的重組蠟樣芽孢桿菌家族成員(蘇云金芽孢桿菌bt013a)(bee)。為了產(chǎn)生用于在蠟樣芽孢桿菌家族成員中表達融合蛋白的質(zhì)粒，產(chǎn)生pcr片段，所述pcr片段編碼bcla啟動子(seqidno:85)、甲硫氨酸起始密碼子和bcla(seqidno:1)的氨基酸20-35，接著是六個丙氨酸接頭序列——其在框中融合至蘇云金芽孢桿菌bt013a內(nèi)切葡聚糖酶(seqidno:107)。將這些pcr片段用xhoi消化并連接到psuper質(zhì)粒的sali位點以產(chǎn)生質(zhì)粒psuper-bcla20-35-內(nèi)切葡聚糖酶。psuper質(zhì)粒通過將puc57質(zhì)粒(含有氨芐青霉素抗性盒)與來自芽孢桿菌屬的pbc16-1質(zhì)粒(含有四環(huán)素抗性)融合而產(chǎn)生。這種5.5kbp質(zhì)?？梢栽诖竽c桿菌和芽孢桿菌屬種中復制。將psuper-bcla20-35-磷脂酶質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到dam甲基化酶陰性大腸桿菌菌株中并在其中增殖，最后轉(zhuǎn)化到蘇云金芽孢桿菌bt013a中。

為了獲得bee的全發(fā)酵液培養(yǎng)物，用bee接種含有腦心浸液培養(yǎng)基(bhi)的15ml錐形瓶，并使其在約30℃下生長7-8小時，振動器設定為300rpm。第二天，將取自各燒瓶的250μl等分試樣接種到含有50ml基于酵母提取物的培養(yǎng)基的250ml燒瓶中，并使其在約30℃下生長。孵育約2天后，當孢子形成完成至少95％時，收集培養(yǎng)液并計算菌落形成單位。將發(fā)酵液在50ml水中稀釋至5％，并將以下菌落形成單位施用于每個盆。

實驗結果示于下表3中。

表3

當將肟菌酯與bee組合時，結果顯示出超加性的植物產(chǎn)量效果。

實施例3：使用異噻菌胺和重組蘇云金芽孢桿菌細胞促進植物生長

在20℃和70％濕度的溫室中，使玉米種子在壤質(zhì)砂土中生長約11天。處理后約11天，將土壤以上的幼苗切斷并測定鮮重。

以約50μg/種子施用表達由seqidno:107編碼的內(nèi)切葡聚糖酶或由seqidno:108編碼的磷脂酶c并且如上所述制備的重組蘇云金芽孢桿菌細胞。還以約250μg/種子施用異噻菌胺。

可預期，用與異噻菌胺組合的重組蘇云金芽孢桿菌處理的玉米植物具有超過基于用兩種活性成分單獨處理的玉米植物的芽重％的計算值的芽重％，即觀察到協(xié)同效應。

序列表

<110>拜耳作物科學有限合伙公司

<120>包含重組芽孢桿菌屬（bacillus）細胞和殺真菌劑的組合物

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<213>炭疽芽孢桿菌

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<213>韋氏芽孢桿菌

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pro

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pro

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<213>炭疽芽孢桿菌

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pro

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<213>蠟樣芽孢桿菌

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ser

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<213>蕈狀芽孢桿菌

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<213>炭疽芽孢桿菌

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<213>炭疽芽孢桿菌

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metsercysasncysasngluasphishishishisaspcysaspphe

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phecysalaileglncysleuargaspvalthrile

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<211>182

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<213>炭疽芽孢桿菌

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<213>炭疽芽孢桿菌

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leuleuleuproserthrglyproasnproasnilethrvalproval

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