本發(fā)明涉及植物保護(hù)或植物病害控制領(lǐng)域，具體來說涉及在植物中預(yù)防和控制真菌疾病，尤其是影響葡萄藤和果樹的真菌疾病。

背景技術(shù)：

控制和預(yù)防真菌疾病是重要的農(nóng)業(yè)挑戰(zhàn)，特別是在葡萄栽培和樹木栽培領(lǐng)域中。存在各種不同類型的真菌疾病，例如白粉病、灰腐病和木質(zhì)部疾病，其包括埃斯卡病(esca)、葡萄座腔菌頂枯病(例如黑枯枝病)、彎孢殼頂枯病、炭疽病和枯枝病。

木質(zhì)部疾病對(duì)葡萄栽培的長(zhǎng)壽性特別有害。造成這些疾病的寄生物或多或少地長(zhǎng)期引起葡萄藤原種的死亡，并且可能需要用幼苗補(bǔ)栽超過10％的葡萄園。

過去10年左右已發(fā)現(xiàn)這些疾病的令人擔(dān)憂的蔓延，其已變成葡萄酒生產(chǎn)工業(yè)的主要擔(dān)憂。事實(shí)上，全世界的葡萄園都已受到影響。在法國(guó)，所有葡萄酒生產(chǎn)地區(qū)都受到影響，并且目前約13％的法國(guó)葡萄園是非生產(chǎn)性的，這主要是由于這些頂枯病。幾項(xiàng)觀察表明所述流行病僅僅處于周期的開始階段：i)亞砷酸鈉這種到目前為止已知用于控制埃斯卡病和黑枯枝病(bda)的唯一有效手段自2001年起禁用，ii)自停用亞砷酸鈉處理后第5年起，死亡率每年提高4％至5％，并且iii)葡萄園中受污染的無癥狀葡萄藤原種的比率高。

事實(shí)上，這種流行病的發(fā)展受到2001年在所有生產(chǎn)葡萄酒的國(guó)家中由于毒性而禁用亞砷酸鈉的促進(jìn)。這一禁令對(duì)于葡萄酒生產(chǎn)商來說更加令人煩惱，因?yàn)榈侥壳盀橹股形刺岢鲇行铱尚械目商孢x方法。這在全世界范圍內(nèi)使生產(chǎn)基地的保護(hù)和長(zhǎng)壽性處于危險(xiǎn)境地。因此，這些木質(zhì)部疾病的效應(yīng)在中期將是巨大的：如果對(duì)地塊進(jìn)行復(fù)原，它們將導(dǎo)致葡萄酒品質(zhì)降低，或者如果最敏感的葡萄品種未被補(bǔ)栽，將導(dǎo)致葡萄酒生產(chǎn)地區(qū)的葡萄酒典型性的喪失。

所述影響葡萄園的木質(zhì)部疾病包括彎孢殼頂枯病、埃斯卡病和某些葡萄座腔菌頂枯病例如黑枯枝病(bda)。這些疾病與能夠破壞木質(zhì)組織的各種不同真菌的存在相關(guān)。與這些疾病相關(guān)的主要的分離到的物種是phaeomoniellachlamydospora、phaeoacremoniumaleophilum、側(cè)彎孢殼(eutypalata)、地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)、沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)、小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)和斯蒂文斯葡萄座腔菌(botryosphaeriastevensii)。其他物種仍在鑒定之中。

這些疾病在木質(zhì)部中表現(xiàn)為形成基于扇區(qū)的和/或中央壞死，在樹干和樹枝上存在褐色條帶或腐爛，以及葉片的變色和干枯，其可能是毀滅性的。

木質(zhì)部疾病也可引起枝條的萎縮和果實(shí)中的癥狀例如成熟延遲、頂枯病或在果實(shí)表面上存在紫黑色斑點(diǎn)。主要病原菌是側(cè)彎孢殼(e.lata)的彎孢殼頂枯病不僅影響葡萄園，而且影響果樹例如李樹、梨樹、蘋果樹、杏樹和櫻桃樹，以及某些森林樹種。

自從由于高毒性而禁用亞砷酸鈉以來，在世界范圍內(nèi)的幾個(gè)國(guó)家中已進(jìn)行了研究，以鑒定其用途的可替選解決方案。因此，已提出了將環(huán)丙唑醇和多菌靈組合使用，用于預(yù)防側(cè)彎孢殼(eutypalata)感染。這種在法國(guó)以名稱銷售的組合，由于其植物毒性而從市場(chǎng)撤回。另一種組合了氟硅唑和多菌靈并被批準(zhǔn)用于埃斯卡病的植物病害控制產(chǎn)品，也在2007年由于其毒性而從市場(chǎng)撤回。其他化學(xué)處理方法描述在bertsch等，plantpathology,2013,62,243–265中。

目前，研究聚焦于發(fā)現(xiàn)使用化學(xué)藥劑的可替選解決方案。例如，由bayer銷售的生物殺真菌劑wp剛剛被批準(zhǔn)用于對(duì)抗葡萄藤的埃斯卡病、黑枯枝病和彎孢殼頂枯病。這種植物用藥物產(chǎn)品是基于使用名為深綠木霉(trichodermaatroviride)菌株i–1237的真菌。這種真菌具有拮抗和復(fù)寄生活性，其將阻止參與這些疾病的主要植物病原菌的發(fā)育。這種生物殺真菌劑必須在剪枝時(shí)通過刷涂或噴灑進(jìn)行施用，僅僅是預(yù)防性的。由于wp的功效是部分的，并且田間驗(yàn)證尚未完全確立，因此推薦與其相伴使用預(yù)防性栽培措施。

也已開發(fā)了用于在苗圃中生產(chǎn)幼苗期間防止木質(zhì)部疾病蔓延的新做法。某些苗圃工作人員將繁殖材料用溫水或在含有苯菌靈、克菌丹或二癸基甲基氯化銨的溶池中處理。這些處理可以降低參與木質(zhì)部疾病的某些病原菌的發(fā)生率。這些方法在保護(hù)葡萄藤幼苗中的功效仍然是有很大爭(zhēng)議的問題。

真菌疾病還影響許多農(nóng)業(yè)上感興趣的其他植物物種，特別是禾本科、十字花科、水果和蔬菜作物，以及源自于這些作物的產(chǎn)品。

因此，目前對(duì)于不妨害環(huán)境的用于在植物中預(yù)防和治療真菌疾病的新的植物用藥劑，仍存在需求。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是式(i)的化合物或其可接受的鹽之一作為植物用藥劑用于在植物中預(yù)防或治療真菌疾病的用途，

其中

-r1、r2、r3和r4獨(dú)立地選自氫，鹵素，優(yōu)選為–cl、–br或–f，–oh，–o(co)ch3，c1–c6烷氧基，c1–c6烷基，–nh2和–cn，

-x和y彼此獨(dú)立地是o、s或nr5，

-m是bi、cu或sb，

-l是h或包含1至40個(gè)碳原子的載體化組成部分，并且

-每個(gè)r5基團(tuán)獨(dú)立地是h或c1–c6烷基，

所述真菌疾病與選自寄生擔(dān)子菌類和寄生子囊菌類的一種或多種植物病原真菌相關(guān)或由所述一種或多種植物病原真菌引起。

在某些實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物的特征在于：

-r1和r3是–h，

-r2和r4獨(dú)立地選自–h、–cl和–f，

-x和y是o，

-m是cu或bi，優(yōu)選為bi，并且

-l是h、c1–c6羥基烷基或–(ch2–ch2–o)n–ch2–ch2–oh，其中n是1至19、優(yōu)選地1至10范圍內(nèi)的整數(shù)。

優(yōu)選的化合物是次水楊酸鉍。

更準(zhǔn)確來說，本發(fā)明的化合物可用于在植物中治療或預(yù)防疾病，優(yōu)選為真菌疾病。所述植物可以是任何類型。它可以是木本或草本植物。所述植物可以選自果樹、葡萄藤、茄科植物、傘形科植物、十字花科植物、谷類植物和其他草本植物。

所述疾病可以發(fā)生在植物的木質(zhì)部或地上部分例如果實(shí)、莖、葉、花、圓錐花序、穗和種子中。

在某些實(shí)施方式中，所述真菌疾病由選自如下的至少一種真菌引起或與所述至少一種真菌相關(guān)：屬于輪枝孢屬(verticillium)、鏈格孢屬(alternaria)、鐮孢菌屬(fusarium)、magnaporthe、念珠菌屬(monilia)、青霉屬(penicillium)、葡萄孢屬(botrytis)、駝孢銹菌屬(hemileia)、尾孢菌屬(cercospora)、球腔菌屬(mycosphaerella)、平臍蠕孢屬(bipolaris)、頂囊殼屬(gaeumannomyces)、彎孢殼屬(eutypa)、phaeomoniella、phaeoacremonium、擬莖點(diǎn)霉屬(phomopsis)、嗜藍(lán)孢孔菌屬(fomitiporia)和韌革菌屬(stereum)的植物病原菌和屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)、尤其是spencermatinsia、新殼梭孢屬(neofusicoccum)、葡萄座腔菌屬(botryosphaeria)、色二孢屬(diplodia)和毛雙孢屬(lasiodiplodia)的植物病原菌。

例如，所述真菌疾病可能由下述植物病原物種之一引起或與下述植物病原物種之一相關(guān)：phaeomoniellachlamydospora，phaeoacremoniumaleophilum，側(cè)彎孢殼(eutypalata)，地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)，斑點(diǎn)嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiapunctata)，斯蒂文斯葡萄座腔菌(botryosphaeriastevensii)，沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)，小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)，粗毛韌革菌(stereumhirsutum)，長(zhǎng)孢輪枝孢(verticilliumlongisporum)，大麗輪枝孢(verticilliumdahliae)，黑白輪枝孢(verticilliumalbo–atrum)，稻瘟菌(magnaporthegrisea)，果產(chǎn)鏈核盤菌(moniliniafructigena)，核果鏈核盤菌(monilinialaxa)，指狀青霉(penicilliumdigitatum)，灰葡萄孢(botrytiscinerea)，胡蘿卜殼針孢(septoriadauci)，蕃茄殼針孢(septorialycopersici)，小麥殼針孢(septoriatritici)，禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)，雪腐鐮孢菌(fusariumnivale)，小麥鏈格孢(alternariatriticina)，互隔鏈格孢(alternariaalternata)，胡蘿卜鏈格孢(alternariadauci)，茄鏈格孢(alternariasolani)，甘藍(lán)鏈格孢(alternariabrassicicola)，蕓苔鏈格孢(alternariabrassicae)，葡萄球座菌(guignardiabidwellii)，botryosphaeriadothidea，灰葡萄孢(botrytiscinerea)，甜菜尾孢菌(cercosporabeticola)，玉蜀黍尾孢菌(cercosporazeae–maydis)，玉米尾孢菌(cercosporazeina)，斐濟(jì)球腔菌(mycosphaerellafijiensis)，稻平臍蠕孢(bipolarisoryzae)，玉蜀黍平臍蠕孢(bipolarismaydis),玉米生平臍蠕孢(bipolariszeicola)，麥根腐平臍蠕孢(bipolarissorokiniana)，禾頂囊殼菌(gaeumannomycesgraminis)，咖啡駝孢銹菌(hemileiavastatrix)和咖啡銹菌(hemileiacoffeicola)。

在某些實(shí)施方式中，所述真菌疾病選自鏈格孢霉病、鐮孢菌病、殼針孢病、輪枝孢病、瘟病(pyriculariosis)、褐腐病(念珠菌)、由柄銹菌目(pucciniales)的寄生真菌引起的銹病、條紋病(cercosporiosis)、長(zhǎng)蠕孢菌病(helminthosporiosis)、全蝕病、果實(shí)的腐爛和霉病、特別是灰腐病、黑腐病、大莖點(diǎn)菌腐病、埃斯卡病、葡萄座腔菌頂枯病、色二孢甘蔗頂枯病、葡萄座腔菌腐爛病、彎孢殼頂枯病、炭疽病和枯枝病。

例如，所述真菌疾病可以選自鏈格孢霉病、鐮孢菌病、殼針孢病、輪枝孢病、瘟病、褐腐病、灰腐病和葡萄座腔菌頂枯病，尤其是黑枯枝病。

在某些實(shí)施方式中，所述真菌疾病選自果實(shí)和/或葉的腐爛或霉病，優(yōu)選地與選自如下的一種或多種病原菌相關(guān)：葡萄孢屬(botrytis)、尤其是灰葡萄孢(botrytiscinerea)和葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)以及寄生性卵菌、尤其是plasmoparaviticola。

在其他實(shí)施方式中，所述疾病是與一種或多種選自如下的病原菌相關(guān)的木質(zhì)部的真菌疾?。簩儆谄咸炎痪?botryosphaeriaceae)的病原菌、屬于彎孢殼屬(eutypa)的病原菌例如側(cè)彎孢殼(eutypalata)、屬于phaeomoniella、phaeoacremonium、嗜藍(lán)孢孔菌屬(formitoporia)、輪枝孢屬(verticillium)、韌革菌屬(stereum)或擬莖點(diǎn)霉屬(phomopsis)的病原菌。例如，所述木質(zhì)部疾病可能與選自如下的病原菌相關(guān)：phaeomoniellachlamydospora、phaeoacremoniumaleophilum、側(cè)彎孢殼(eutypalata)、地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)、斑點(diǎn)嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiapunctata)、斯蒂文斯葡萄座腔菌(botryosphaeriastevensii)、沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)、小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)、粗毛韌革菌(stereumhirsutum)和長(zhǎng)孢輪枝孢(verticilliumlongisporum)。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物被用于治療或預(yù)防選自埃斯卡病、彎孢殼頂枯病、葡萄座腔菌頂枯病、尤其是黑枯枝病、黑腐病、枯枝病、炭疽病和灰腐病的葡萄藤真菌疾病。

在某些實(shí)施方式中，本發(fā)明的化合物可用于：

-預(yù)防或治療修剪傷口的感染，尤其是在果樹和葡萄藤中，

-在苗圃中，尤其是在幼苗、優(yōu)選為葡萄藤幼苗的制備期間，對(duì)繁殖或增殖材料進(jìn)行消毒，或

-預(yù)防或治療作物產(chǎn)品中的腐爛或霉病，尤其是在水果中。

本發(fā)明的另一方面是一種植物用藥物組合物，其優(yōu)選地用于在如上所定義的植物中治療或預(yù)防真菌疾病，所述組合物包含式(i)的化合物和可植物藥用賦形劑。所述組合物可以包含：

-以重量計(jì)0.01％至50％的如上所定義的式(i)的化合物，以及

-以重量計(jì)50％至99.99％的一種或多種可植物藥用賦形劑，

所述重量百分率以與所述組合物的總重量相比來表示。

所述組合物可以包含選自填充劑、稀釋劑、增稠劑、載體和表面活性劑的至少一種賦形劑。

此外，所述組合物可以包含選自其他植物用藥劑、施肥劑或肥料的其他活性劑。

最后，本發(fā)明還涉及一種用于在植物中治療或預(yù)防疾病、優(yōu)選為真菌疾病的方法，所述方法包括將如上所定義的式(i)的化合物或植物用藥物組合物施用到所述植物的至少一部分上。

附圖說明

圖1示出了小新殼梭孢(n.parvum)在含有pad培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿上的菌絲體生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基增補(bǔ)有濃度在0.01至40mm范圍內(nèi)的氧化鉍、次水楊酸鉍、檸檬酸鉍、氧化銅或氧化銻。

結(jié)果對(duì)應(yīng)于與在純pda培養(yǎng)基上生長(zhǎng)真菌的對(duì)照條件(100％生長(zhǎng))相比菌絲體的生長(zhǎng)速率。

圖2示出了灰葡萄孢(b.cinerea)在含有pad培養(yǎng)基的皮氏培養(yǎng)皿上的菌絲體生長(zhǎng)，所述培養(yǎng)基增補(bǔ)有濃度在0.01至40mm范圍內(nèi)的氧化鉍、次水楊酸鉍、檸檬酸鉍、氧化銅或氧化銻。

結(jié)果對(duì)應(yīng)于與在純pda培養(yǎng)基上生長(zhǎng)真菌的對(duì)照條件(100％生長(zhǎng))相比菌絲體的生長(zhǎng)速率。

圖3示出了在用勃艮地小新殼梭孢(n.parvumbourgogne)接種后釀酒葡萄(v.viniferacv.)霞多麗品種的綠色節(jié)間的壞死的發(fā)展，所述綠色節(jié)間已首先用15mm氧化鉍、水楊酸或次水楊酸鉍溶池或水溶池(對(duì)照)處理10分鐘。結(jié)果作為在對(duì)照條件下觀察到的壞死面積(＝100％)的函數(shù)來計(jì)算。

圖4示出了在生長(zhǎng)在增補(bǔ)有10mm水楊酸或次水楊酸鉍的mpm1培養(yǎng)基上的釀酒葡萄霞多麗品種的愈傷組織中，防衛(wèi)基因vvpr1和vveds1(編碼水楊酸途徑的酶)的表達(dá)?；虮磉_(dá)在培養(yǎng)4天后通過rt–qpcr來評(píng)估。

結(jié)果代表了與在生長(zhǎng)在未增補(bǔ)的mpm1培養(yǎng)基上的愈傷組織(對(duì)照)中觀察到的相比，在生長(zhǎng)在增補(bǔ)的培養(yǎng)基上的愈傷組織中所述基因的相對(duì)表達(dá)。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的目的是用于在植物中預(yù)防和治療真菌疾病的新方法。這些方法是基于使用次水楊酸鉍或其衍生物之一。

次水楊酸鉍在人類醫(yī)學(xué)中被用于治療和預(yù)防胃腸障礙。它是所銷售的用于尤其是治療惡心、輕度腹瀉和消化不良的藥物pepto–和的活性成分。它在人類中用于消化問題的最大吸收劑量是500mg/天。

可追溯到1940年代的老的、孤立的研究提到了將次水楊酸鉍用于治療煙草的青霉病(clayton等，journalofagriculturalresearch,1943,66,261，摘要)。青霉病由絲狀微生物引起，其不是真菌而是卵菌。所述卵菌屬于不等鞭毛藻門，并且從系統(tǒng)發(fā)育觀點(diǎn)來看，接近光合生物例如褐藻和硅藻。它們與真菌門沒有共同祖先。

就本發(fā)明人所知，迄今為止從未公開過將次水楊酸鉍作為植物用藥劑或植物病害控制劑用于治療或預(yù)防真菌疾病，特別是由屬于擔(dān)子菌類或子囊菌類的寄生真菌引起的真菌疾病。

令人吃驚的是，本發(fā)明人顯示了次水楊酸鉍能夠顯著抑制幾種植物病原菌的菌絲體生長(zhǎng)，特別是參與葡萄座腔菌頂枯病的小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)和參與水果灰腐病(也被稱為“灰霉病或灰腐病”)的灰葡萄孢(botrytiscinerea)。本發(fā)明人還顯示，氧化鉍和次檸檬酸鉍反過來對(duì)這些植物病原菌具有非常弱的抑制活性。

所述在體外獲得的結(jié)果，在霞多麗葡萄藤品種的木質(zhì)節(jié)間上的壞死模型上得到體內(nèi)驗(yàn)證。將用小新殼梭孢(n.parvum)菌絲體接種的木質(zhì)節(jié)間在15mm次水楊酸鉍溶液中預(yù)備性浸泡10min，可以以非常顯著的方式(≈50％)限制壞死的形成和蔓延并因此限制菌絲體發(fā)展。對(duì)于在15mm水楊酸溶池或15mm氧化鉍溶池中的預(yù)備性浸泡來說，沒有觀察到這種結(jié)果。本發(fā)明人還顯示，次水楊酸鉍能夠誘導(dǎo)植物的某些植物病原菌防衛(wèi)和抗性基因。補(bǔ)充試驗(yàn)顯示，次水楊酸鉍也能夠在體外抑制參與各種不同植物病理例如鏈格孢霉病、鐮孢菌病、小麥的殼針孢病、水果霉病或腐爛病尤其是柑橘霉病或腐爛病、瘟病、褐腐病或輪枝孢病的幾種模式植物病原真菌的菌絲體生長(zhǎng)。值得注意的是，次水楊酸鉍對(duì)植物病原真菌的殺生物效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于本申請(qǐng)人在兩種模式卵菌中能夠觀察到的效果。這種結(jié)果顯示，次水楊酸鉍的殺生物效果特異性針對(duì)植物病原真菌、尤其是寄生擔(dān)子菌類和子囊菌類，并且這不能從以前關(guān)于煙草青霉病的研究預(yù)見到。

本申請(qǐng)中公開的實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明了次水楊酸鉍對(duì)真菌感染的植物藥物性質(zhì)以及它穿透木質(zhì)部的能力。此外，次水楊酸鉍具有對(duì)人類的毒性特別低的優(yōu)點(diǎn)。它也具有低的環(huán)境毒性，正如本申請(qǐng)人通過生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)所顯示的。

因此，次水楊酸鉍特別適合于作為植物用藥劑用于在植物、特別是農(nóng)業(yè)上感興趣的植物中治療和預(yù)防真菌疾病。

因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是次水楊酸鉍或其衍生物之一作為植物用藥劑用于在植物中治療或預(yù)防真菌疾病的用途。

“次水楊酸鉍”被理解為意味著下式的化合物：

在本發(fā)明的意義中，“真菌疾病”意味著由一種或多種植物病原真菌引起或與一種或多種植物病原真菌相關(guān)的疾病。在本發(fā)明的意義中，術(shù)語“真菌疾病”還包括由植物被一種或多種腐生真菌定殖所促進(jìn)的疾病。

另一方面，表述“真菌疾病”不包括由不是真菌的植物病原微生物引起的病癥。尤其是，表述“真菌疾病”不包括由屬于卵菌的一種或多種植物病原菌例如peronosporatabacina、plasmoparaviticola或phytophtorainfestans引起或與其相關(guān)的疾病。換句話說，霜霉病類型的疾病例如煙草青霉病、葡萄藤霜霉病或馬鈴薯晚疫病不包括在本發(fā)明的表述“真菌疾病”中。

在本發(fā)明的意義內(nèi)，真菌疾病包括但不限于埃斯卡病、彎孢殼頂枯病、葡萄座腔菌頂枯病、黑腐病、灰腐病、炭疽病、枯枝病、鏈格孢霉病、鐮孢菌病、殼針孢病、水果霉病或腐爛病尤其是柑橘水果霉病或腐爛病、瘟病、褐腐病或輪枝孢病。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，所述真菌疾病與選自寄生擔(dān)子菌類和寄生子囊菌類的一種或多種植物病原真菌、特別是微小的植物病原真菌相關(guān)或由所述植物病原真菌引起。

所述寄生擔(dān)子菌類包括但不限于嗜藍(lán)孢孔菌屬(formitoporia)、韌革菌屬(stereum)和柄銹菌目(pucciniales)、尤其是駝孢銹菌屬(hemileia)的植物病原真菌。

所述寄生子囊菌類包括但不限于屬于輪枝孢屬(verticillium)、鏈格孢屬(alternaria)、鐮孢菌屬(fusarium)、magnaporthe、念珠菌屬(monilia)、青霉屬(penicillium)、曲霉屬(aspergillus)、葡萄孢屬(botrytis)、彎孢殼屬(eutypa)、phaeomoniella、phaeoacremonium、擬莖點(diǎn)霉屬(phomopsis)、尾孢菌屬(cercospora)、球腔菌屬(mycosphaerella)、平臍蠕孢屬(bipolaris)或?qū)儆谄咸炎痪?botryosphaeriaceae)、尤其是spencermatinsia、新殼梭孢屬(neofusicoccum)、葡萄座腔菌屬(botryosphaeria)、色二孢屬(diplodia)和毛雙孢屬(lasiodiplodia)的植物病原真菌。所述子囊菌類還包括造成白粉病的植物病原真菌。這些植物病原真菌屬于白粉菌科(erysiphaceae)，尤其是白粉菌屬(erysiphe)、叉絲單囊殼屬(podosphaera)、單囊殼屬(sphaerotheca)和鉤絲殼屬(uncinula)，例如erysiphenecator。

例如，屬于寄生子囊菌類或寄生擔(dān)子菌類的一種或多種真菌可以選自鏈格孢屬(alternaria)、鐮孢菌屬(fusarium)、殼針孢屬(septoria)、輪枝孢屬(verticillium)、magnaporthe、念珠菌屬(monilinia)、青霉屬(penicillium)、曲霉屬(aspergillus)、殼針孢屬(septoria)、葡萄孢屬(botrytis)和新殼梭孢屬(neofusicoccum)。

“與疾病相關(guān)、參與或引起疾病的”植物病原真菌意味著本身能夠在所討論的植物中誘導(dǎo)疾病和/或促進(jìn)疾病和/或其癥狀之一的發(fā)展的植物病原真菌。優(yōu)選地，所述植物病原真菌對(duì)動(dòng)物界、特別是哺乳動(dòng)物包括人類不是病原性的。

例如，所述真菌疾病可能與屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的一種或多種微生物相關(guān)或由所述一種或多種微生物引起。

在某些實(shí)施方式中，所述真菌疾病與屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的一種或多種病原菌相關(guān)或由所述一種或多種病原菌引起。在本發(fā)明的意義中，這些疾病包括葡萄座腔菌頂枯病和影響植物的地上部分并涉及葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的一種或多種植物病原菌的疾病，尤其是黑腐病和大莖點(diǎn)菌腐病。

在本發(fā)明的意義中，表述“葡萄座腔菌頂枯病”是指涉及屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的一種或多種植物病原菌并且可以影響植物的木質(zhì)部分的真菌疾病。葡萄座腔菌頂枯病包括木質(zhì)部疾病例如黑枯枝病、色二孢甘蔗頂枯病和葡萄座腔菌腐爛病。

涉及屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的植物病原菌并與葡萄藤有關(guān)的真菌疾病尤其描述在phytopathol.mediterr.,2011,50(supplement),s5–s45中，其內(nèi)容通過參考并入本文。

在本發(fā)明的意義中，“治療疾病”意味著在植物中治療、減弱、減緩或停止疾病或其癥狀之一的進(jìn)展這一事實(shí)。更準(zhǔn)確來說，“治療”意味著停止、減緩、降低、控制或抑制植物被植物病原真菌的感染這一事實(shí)。

“預(yù)防疾病”意味著在植物中阻止或延遲疾病或其癥狀之一的出現(xiàn)這一事實(shí)，在給定作物中減緩、降低或防止疾病傳播這一事實(shí)，根除或降低植物或作物中潛伏的植物病原菌的存在這一事實(shí)，或在給定作物中降低疾病的發(fā)生率或被該疾病污染的風(fēng)險(xiǎn)這一事實(shí)。

在本發(fā)明的意義中，“植物用藥劑或植物病害控制劑”意味著旨在保護(hù)植物和作物產(chǎn)品以對(duì)抗害蟲、特別是微生物或阻止其作用以確保植物產(chǎn)品的保護(hù)的化合物，和/或例如通過促進(jìn)植物生長(zhǎng)或刺激植物防衛(wèi)而對(duì)植物的生命過程發(fā)揮作用(只要它不是營(yíng)養(yǎng)性物質(zhì))的化合物。

在本發(fā)明的意義中，“植物用藥劑或植物病害控制劑”優(yōu)選地意味著適合于農(nóng)業(yè)用途，用于在植物體中治療或預(yù)防疾病、優(yōu)選為寄生微生物引起的疾病的化合物。這種植物用藥劑可能對(duì)參與所述疾病或與所述疾病相關(guān)的微生物的發(fā)育和存活力具有直接影響，和/或誘導(dǎo)或刺激所述植物針對(duì)所述微生物的抗性和防衛(wèi)機(jī)制。

優(yōu)選地，在本發(fā)明的意義中，如下所定義的式(i)的化合物表現(xiàn)出選自抑制真菌活性、殺真菌活性、植物防衛(wèi)刺激活性及其組合的活性。優(yōu)選地，所述式(i)的化合物表現(xiàn)出抑制真菌活性和植物防衛(wèi)刺激活性兩者。

在本發(fā)明的意義中，“真菌抑制劑”意味著能夠阻止、減緩或停止植物病原真菌的發(fā)育和/或生產(chǎn)的化合物。

在本發(fā)明的意義中，“植物”意味著任何類型的多細(xì)胞植物性生物體。優(yōu)選地，所述植物是維管植物，即屬于維管植物的植物。維管植物包括木本植物和草本植物。優(yōu)選地，所述植物是在農(nóng)業(yè)上感興趣的。它可以是例如蔬菜、水果、谷類或葡萄栽培作物。

在某些實(shí)施方式中，所述植物是木本植物。作為木本植物的實(shí)例，可以提到的是果樹例如香蕉樹、杏樹、芒果樹、李樹、桃樹、蘋果樹、梨樹、櫻桃樹、榅桲樹、核桃樹、無花果樹和柑橘樹、森林樹木、觀賞或園藝樹木和灌木例如薔薇、棉花、咖啡和葡萄藤。

在其他實(shí)施方式中，所述植物是草本植物。作為草本植物的實(shí)例，可以提到的是茄科植物例如番茄和馬鈴薯、傘形科植物例如胡蘿卜或歐防風(fēng)、十字花科植物例如油菜籽、禾本科植物例如甘蔗和谷類植物例如玉米、水稻、小麥、大麥、燕麥和黑麥。

更準(zhǔn)確來說，本發(fā)明的一個(gè)目的是式(i)的化合物或其可植物藥用的鹽之一作為植物用藥劑用于在植物中治療或預(yù)防真菌疾病的用途

其中

-r1、r2、r3和r4獨(dú)立地選自氫、鹵素、–oh、–o(co)ch3、c1–c6烷氧基例如–och3、c1–c6烷基，–nh2、–cf3和–cn，

-x和y彼此獨(dú)立地是o、s或nr5，

-m是bi、cu或sb，

-l是h或包含1至40個(gè)碳原子的載體化組成部分，并且

-每個(gè)r5基團(tuán)獨(dú)立地是h或c1–c6烷基，

所述真菌疾病與選自寄生擔(dān)子菌類和寄生子囊菌類的一種或多種植物病原真菌相關(guān)或由所述一種或多種植物病原真菌引起。

c1–c6烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、異丙基、叔丁基、異丁基、仲丁基、環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基和環(huán)己基。符合本發(fā)明的優(yōu)選的烷基是c1–c3基團(tuán)，特別是甲基、乙基、丙基和異丙基。

c1–c6羥基烷基是指被至少一個(gè)羥基取代的c1–c6、優(yōu)選地c1–c3烷基。

c1–c6烷氧基是指r–o–基團(tuán)，其中r是c1–c6、優(yōu)選地c1–c3烷基。鹵素原子包括–f、–br、–cl和–i。符合本發(fā)明的優(yōu)選的鹵素原子是–f和–cl。

“載體化組成部分”意味著促進(jìn)化合物的性質(zhì)、尤其是化合物在水中的溶解性和/或其穿透木質(zhì)部的能力的化學(xué)基團(tuán)。所述載體化組成部分可以包含糖基游離基和/或包含1至40個(gè)碳原子的烴鏈等。這種烴鏈可能被一個(gè)或多個(gè)雜原子、優(yōu)選為–o–或–s–，和/或被一個(gè)或多個(gè)–so2、–so–、–nhc(o)–、–oc(o)–、–nh和–nh–co–nh–類型的基團(tuán)中斷。以另外或可替選的方式，所述烴鏈可能被一個(gè)或多個(gè)基團(tuán)取代，所述基團(tuán)優(yōu)選地選自–or5、–n(r5)2、–cf3和c1–c6烷基、單糖或二糖。在某些實(shí)施方式中，所述載體化組成部分是寡聚或多聚醚類型的組成部分，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚四甲撐二醇。在某些實(shí)施方式中，l包含–(ch2–ch2–o)n–ch2–ch2–oh或由其構(gòu)成，其中n是1至19范圍內(nèi)的整數(shù)。

在某些實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物的特征在于：

-r1、r2、r3和r4獨(dú)立地選自氫，鹵素，優(yōu)選為–cl或–f，–oh，–o(co)ch3，–och3，–nh2，cf3和–cn，

-x和y是o，

-m是bi或cu，并且

-l是h、c1–c6羥基烷基、糖基游離基或寡聚或多聚醚鏈例如–(ch2–ch2–o)n–ch2–ch2–oh，其中n是1至19范圍內(nèi)的整數(shù)。

在特定實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物的特征在于：

-r1和r3是–h，

-r2和r4獨(dú)立地選自–h、–cl、–f、–oh、–o(co)–ch3、–och3、–nh2和–cn。優(yōu)選地，r2和r4選自–h、–cl或–f，

-x和y是o，

-m是bi或cu，優(yōu)選為bi，并且

-l是h、c1–c6羥基烷基、糖基游離基或寡聚或多聚醚鏈例如–(ch2–ch2–o)n–ch2–ch2–oh，其中n是1至19范圍內(nèi)的整數(shù)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物的特征在于：

-r1和r3是–h，

-r2和r4獨(dú)立地選自–h、–cl和–f，

-x和y是o，

-m是cu或bi，優(yōu)選為bi，并且

-l是h、c1–c6羥基烷基或–(ch2–ch2–o)n–ch2–ch2–oh，其中n是1至19、優(yōu)選地1至10范圍內(nèi)的整數(shù)。

符合本發(fā)明的優(yōu)選化合物是式(ia)的化合物：

其中m和l如上所定義。

優(yōu)選地：

-m是bi，并且

-l是h、c1–c6羥基烷基或–(ch2–ch2–o)n–ch2–ch2–oh，其中n是1至19、優(yōu)選地1至10范圍內(nèi)的整數(shù)。

在某些實(shí)施方式中，式(ia)的化合物是其中l(wèi)＝h并且m＝bi或cu的化合物。

所述式(i)的化合物可以通過在timakova等，chemistryforsustainabledevelopment,2009,305–313中說明的化學(xué)合成來制備。

符合本發(fā)明的化合物可用于治療在本說明書中描述的影響植物的任何真菌疾病。

符合本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防木質(zhì)部和根的病癥，但是也可用于治療或預(yù)防在植物的地上部分例如果實(shí)、葉、莖、穗、花和圓錐花序中發(fā)生的疾病。

由在植物的地上部分中發(fā)生的真菌疾病引起的癥狀是不同的，并且包括斑點(diǎn)例如黑色、棕色或發(fā)黃斑點(diǎn)、葉、莖或種子的燒灼或壞死、立枯病、分生孢子器的出現(xiàn)、葉上膿皰的出現(xiàn)、葉頂枯現(xiàn)象、干枯尤其是葉的干枯、葉黃化或褪色、莖上子囊殼的出現(xiàn)或果實(shí)霉病和頂枯病。

作為真菌疾病的實(shí)例，可以提到的是：

-由鏈格孢屬(alternaria)真菌引起的鏈格孢霉病?？梢蕴岬降氖翘鸩?互隔鏈格孢(alternariaalternata))、胡蘿卜(胡蘿卜鏈格孢(alternariadauci))、十字花科植物(甘藍(lán)鏈格孢(alternariabrassicicola)、蕓苔鏈格孢(alternariabrassicae))、茄科植物(茄鏈格孢(alternariasolani))或小麥(小麥鏈格孢(alternariatriticina))的鏈格孢霉病。

-尤其是由鐮孢菌屬(fusarium)的植物病原菌引起的鐮孢菌病，其取決于受影響的植物物種，可能表現(xiàn)為種子和莖的病變和/或棕色染色以及干腐的出現(xiàn)。例如，可以提到的物種是影響小麥的禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)和雪腐鐮孢菌(fusariumnivale)或影響馬鈴薯的接骨木鐮孢菌(fusariumsambucinum)。還可以提到的是甘蔗的鐮孢菌病。

-由球腔菌科(mycosphaerellaceae)、特別是殼針孢屬(septoria)的植物病原菌引起的殼針孢病。例如，可以提到的是胡蘿卜(胡蘿卜殼針孢(septoriadauci))、番茄(蕃茄殼針孢(septorialycopersici))或小麥(小麥殼針孢(septoriatritici))的殼針孢病。

-由輪枝孢屬(verticillium)的植物病原菌、尤其是大麗輪枝孢(verticilliumdahliae)和黑白輪枝孢(verticilliumalbo–atrum)引起的輪枝孢病，并且其可以影響各種不同類型的草本植物例如番茄或茄子。

-主要影響水稻并由稻瘟菌(magnaporthegrisea)引起的瘟病。

-由鏈核盤菌屬(monilinia)的植物病原菌引起并主要影響果樹的褐腐病。例如，可以提到的是主要攻擊仁果類水果的植物病原性果產(chǎn)鏈核盤菌(moniliniafructigena)和主要影響核果的核果鏈核盤菌(monilinialaxa)。

-水果腐爛和霉病，尤其是由指狀青霉(penicilliumdigitatum)、黑曲霉(aspergillusniger)或灰葡萄孢(botrytiscinerea)引起的。

-由不完美的尾孢菌屬(cercospora)或球腔菌屬(mycosphaerella)的真菌引起的條紋病?？梢蕴岬降氖翘鸩说臈l紋病(甜菜尾孢菌(cercosporabeticola))或玉米的條紋病(玉蜀黍尾孢菌(cercosporazeae–maydis)和玉米尾孢菌(cercosporazeina))。黑條紋病是香蕉樹的葉片疾病，其由斐濟(jì)球腔菌(mycosphaerellafijiensis)引起。

-長(zhǎng)蠕孢菌病，尤其是由平臍蠕孢屬(bipolaris)引起并主要影響禾本科植物的。可以提到的是由稻平臍蠕孢(bipolarisoryzae)引起的水稻長(zhǎng)蠕孢菌病、由玉蜀黍平臍蠕孢(bipolarismaydis)和玉米生平臍蠕孢(bipolariszeicola)引起的玉米長(zhǎng)蠕孢菌病、由麥根腐平臍蠕孢(bipolarissorokiniana)引起的谷類長(zhǎng)蠕孢菌病。

-由柄銹菌目(pucciniales)的寄生性真菌引起的銹病。例如，可以提到的是由擔(dān)子菌類真菌咖啡駝孢銹菌(hemileiavastatrix)和咖啡銹菌(hemileiacoffeicola)引起的咖啡銹病。

-全蝕病，其主要影響禾本科和其他禾本植物例如小麥、大麥和黑麥。污染發(fā)生在根部，并且癥狀可以在莖、根(發(fā)黑和壞死)和穗(褪色)上看到。這種病引起立枯。全蝕病主要由禾頂囊殼菌(gaeumannomycesgraminis)引起。

在某些實(shí)施方式中，所述影響地上部分的真菌疾病還可以包括果實(shí)或葉片的腐爛和霉病，例如灰腐病、黑腐病(也被稱為干腐病)和大莖點(diǎn)菌腐病。這些疾病可能涉及各種不同類型的真菌。例如，影響尤其是葡萄藤中的葉片、果實(shí)、漿果和/或花的植物病原真菌包括但不限于葡萄球座菌(guignardiabidwellii)(也被稱為botryosphaeriabidwellii)(黑腐病)、botryosphaeriadothidea(大莖點(diǎn)菌腐病)和灰葡萄孢(botrytiscinerea)(灰腐病)。

在某些實(shí)施方式中，所述真菌疾病可以選自鏈格孢霉病、鐮孢菌病、殼針孢病、輪枝孢病、瘟病、褐腐病、由柄銹菌目的寄生真菌引起的銹病、條紋病、長(zhǎng)蠕孢菌病、全蝕病、果實(shí)的腐爛和霉病尤其是灰腐病、黑腐病和大莖點(diǎn)菌腐病。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述真菌病癥與選自下列的植物病原真菌相關(guān)或由所述植物病原真菌引起：大麗輪枝孢(verticilliumdahliae)，黑白輪枝孢(verticilliumalbo–atrum)，稻瘟菌(magnaporthegrisea)，果產(chǎn)鏈核盤菌(moniliniafructigena)，核果鏈核盤菌(monilinialaxa)，指狀青霉(penicilliumdigitatum)，黑曲霉(aspergillusniger)，灰葡萄孢(botrytiscinerea)，胡蘿卜殼針孢(septoriadauci)，蕃茄殼針孢(septorialycopersici)，小麥殼針孢(septoriatritici)，禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)，雪腐鐮孢菌(fusariumnivale)，小麥鏈格孢(alternariatriticina)，互隔鏈格孢(alternariaalternata)，胡蘿卜鏈格孢(alternariadauci)，茄鏈格孢(alternariasolani)，甘藍(lán)鏈格孢(alternariabrassicicola)，蕓苔鏈格孢(alternariabrassicae)，葡萄球座菌(guignardiabidwellii)，botryosphaeriadothidea，灰葡萄孢(botrytiscinerea)，甜菜尾孢菌(cercosporabeticola)，玉蜀黍尾孢菌(cercosporazeae–maydis)，玉米尾孢菌(cercosporazeina)，斐濟(jì)球腔菌(mycosphaerellafijiensis)，稻平臍蠕孢(bipolarisoryzae)，玉蜀黍平臍蠕孢(bipolarismaydis)，玉米生平臍蠕孢(bipolariszeicola)，麥根腐平臍蠕孢(bipolarissorokiniana)，禾頂囊殼菌(gaeumannomycesgraminis)，咖啡駝孢銹菌(hemileiavastatrix)和咖啡銹菌(hemileiacoffeicola)。

在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物被用于預(yù)防或治療果實(shí)和/或葉的腐爛或霉病，特別是葡萄藤的。在某些實(shí)施方式中，所述疾病與與選自葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)和葡萄孢屬(botrytis)的一種或多種病原菌相關(guān)，尤其是灰葡萄孢(botrytiscinerea)。優(yōu)選地，被治療的植物是農(nóng)業(yè)上感興趣的作物。例如，被治療的植物可以選自葡萄藤、草莓植物、番茄、葵花和果樹。

在涉及植物的地上部分例如葉和果實(shí)的污染的真菌疾病的情形中，本發(fā)明的化合物可以在葉發(fā)育、開花和果實(shí)成熟期間，以例如可噴霧溶液的形式直接給藥到果實(shí)和/或葉上。

根據(jù)特定情況，所述式(i)的化合物可用于預(yù)防或治療作物產(chǎn)品中的腐爛或霉病?！白魑锂a(chǎn)品”意味著采摘或收獲的產(chǎn)品，特別是蔬菜、水果、花或種子。水果包括但不限于葡萄或紅醋栗串、莓類例如黑莓和樹莓、草莓、仁果例如蘋果、柑橘、番茄和梨、核果尤其是櫻桃、桃、油桃、李、杏、鱷梨或芒果。更準(zhǔn)確來說，所述式(i)的化合物可作為防腐劑用于包裝和儲(chǔ)存收獲的產(chǎn)品。通常，可以將本發(fā)明的化合物在包裝之前或期間通過噴灑施用到收獲的產(chǎn)品。

真菌木質(zhì)部疾病包括所謂的“頂枯病”例如埃斯卡病、葡萄座腔菌頂枯病、特別是黑枯枝病、色二孢甘蔗頂枯病或葡萄座腔菌腐爛病、彎孢殼頂枯病、炭疽病和枯枝病。這些疾病與例如屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的一種或多種病原菌相關(guān)。

埃斯卡病、彎孢殼頂枯病和黑枯枝病是影響葡萄藤的主要木質(zhì)部疾病。這些疾病尤其描述在bertsch等，plantpathology,2013,1–23中，其內(nèi)容通過參考并入本文。

木質(zhì)部疾病由各種不同類型的真菌病原菌引起。例如，可以提到的是屬于葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)、尤其是spencermatinsia、新殼梭孢屬(neofusicoccum)、葡萄座腔菌屬(botryosphaeria)、色二孢屬(diplodia)和毛雙孢屬(lasiodiplodia)的病原菌，屬于彎孢殼屬(eutypa)的病原菌例如側(cè)彎孢殼(eutypalata)，或?qū)儆趐haeomoniella、phaeoacremonium、嗜藍(lán)孢孔菌屬(formitoporia)、輪枝孢屬(verticillium)或擬莖點(diǎn)霉屬(phomopsis)的病原菌例如p.viticola。phaeomoniellachlamydospora、phaeoacremoniumaleophilum、側(cè)彎孢殼(eutypalata)、地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)、斑點(diǎn)嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiapunctata)、斯蒂文斯葡萄座腔菌(botryosphaeriastevensii)、沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)、小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)、粗毛韌革菌(stereumhirsutum)和長(zhǎng)孢輪枝孢(verticilliumlongisporum)具體參與葡萄藤木質(zhì)部頂枯病。例如，側(cè)彎孢殼(eutypalata)是彎孢殼頂枯病的主要病原因子。小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)尤其與葡萄座腔菌頂枯病、特別是黑枯枝病相關(guān)。埃斯卡病通常與phaeomoniellachlamydospora、phaeoacremoniumaleophilum和地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)以及側(cè)彎孢殼(eutypalata)相關(guān)。

根據(jù)其他情況，本發(fā)明的一個(gè)目的是式(i)的化合物用于預(yù)防或治療木質(zhì)部疾病的用途，所述木質(zhì)部疾病與選自下列的一種或多種病原菌相關(guān)：phaeomoniellachlamydospora，phaeoacremoniumaleophilum，側(cè)彎孢殼(eutypalata)，斑點(diǎn)嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiapunctata)，斯蒂文斯葡萄座腔菌(botryosphaeriastevensii)，地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)，沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)，小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)，粗毛韌革菌(stereumhirsutum)和長(zhǎng)孢輪枝孢(verticilliumlongisporum)。

更通常地，式(i)的化合物可用于預(yù)防、治療或減緩植物被病原菌的定殖或感染，所述病原菌選自phaeomoniellachlamydospora、phaeoacremoniumaleophilum、側(cè)彎孢殼(eutypalata)、地中海嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiamediterranea)、斑點(diǎn)嗜藍(lán)孢孔菌(fomitiporiapunctata)、斯蒂文斯葡萄座腔菌(botryosphaeriastevensii)、沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)、小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)、粗毛韌革菌(stereumhirsutum)和長(zhǎng)孢輪枝孢(verticilliumlongisporum)。

為了治療或預(yù)防木質(zhì)部疾病，可以將本發(fā)明的化合物給藥到被感染植物、可能被感染的植物或表現(xiàn)出癥狀的植物的部分上，例如樹干、基部、粗枝或分枝部分上?；蛘?，本發(fā)明的化合物也可以施用到葉(例如葉的下側(cè)面上)、花或果實(shí)，特別是在尋求系統(tǒng)給藥時(shí)。

在果樹、葡萄藤或觀賞或園藝植物的情形中，在植物剪枝后可能發(fā)生造成木質(zhì)部疾病的病原因子的污染。植物剪枝可能發(fā)生在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期中，但是也可能發(fā)生在“綠”期中(例如打尖、除葉、除去次生枝條、修剪或疏剪)。因此，在特定實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物可用于預(yù)防或治療修剪傷口的感染，尤其是在葡萄藤作物、果樹作物例如杏樹、芒果樹、李樹、桃樹、蘋果樹、梨樹、櫻桃樹、榅桲樹、胡桃樹、無花果樹和柑橘樹、薔薇叢作物或園藝和觀賞性多年生植物中。在這種實(shí)施方式中，所述式(i)的化合物可以在剪枝時(shí)，以任何類型的組合物的形式，例如以可噴霧溶液形式或糊劑、凝膠、插入物或可以直接刷涂在修剪傷口上或注射到木質(zhì)部中的溶液的形式，給藥到所述植物。

根據(jù)特定情況，所述式(i)的化合物可用于在木本植物中治療或預(yù)防木質(zhì)部壞死或減緩其發(fā)生，所述壞死與葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的病原菌、尤其是小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)相關(guān)。優(yōu)選地，所述木本植物是樹木，例如果樹如橄欖樹、芒果樹或桉樹，灌木例如藍(lán)莓叢，或葡萄藤。正如上面提到的，本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療修剪傷口的壞死。

根據(jù)另一種情況，本發(fā)明的化合物也可以在苗圃中在幼苗制備期間用作消毒劑。特別是，它們可用于在繁殖材料或離開苗圃的幼苗被種植在田間之前對(duì)它們進(jìn)行消毒。

根據(jù)特定情況，本發(fā)明的一個(gè)目的是式(i)的化合物用于預(yù)防或治療葡萄藤的疾病，優(yōu)選為真菌疾病的用途。

在本發(fā)明的意義中，術(shù)語“葡萄藤”包括屬于葡萄屬(vitis)的所有物種，尤其是屬于圓葉葡萄亞屬(muscadinia)的物種例如v.rotundifolia或v.munsoniana，以及屬于真葡萄亞屬(euvitis)的物種，包括美洲種例如v.berlandieri、v.riparia、v.rupestris、v.cinerea或vitislabrusca，亞洲種例如v.amurensis和v.coignetiae，以及歐亞種v.viniferal.，其是在歐洲和全世界栽培最多的物種。

所述葡萄藤真菌疾病可以是木質(zhì)部疾病，例如埃斯卡病、葡萄座腔菌頂枯病例如黑枯枝病、彎孢殼頂枯病、炭疽病和枯枝病，或影響葉或漿果的疾病例如黑腐病、大莖點(diǎn)菌腐病或灰腐病。

優(yōu)選地，它是選自灰腐病、葡萄座腔菌頂枯病尤其是黑枯枝病和埃斯卡病的真菌疾病。更通常地，所述式(i)的化合物可用于預(yù)防或治療葡萄藤的真菌疾病，所述真菌疾病涉及屬于葡萄孢屬(botrytis)或葡萄座腔菌科(botryosphaeriaceae)的病原菌，優(yōu)選為灰葡萄孢(botrytiscinerea)或小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)。

為了治療或預(yù)防影響葡萄藤的地上部分的疾病例如黑腐病、大莖點(diǎn)菌腐病或灰腐病，優(yōu)選地在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)和/或在葉發(fā)育、開花和/或果實(shí)成熟期間治療所述葡萄藤。通常，本發(fā)明的化合物可以以溶液形式施用，例如通過噴灑在葡萄藤上。

為了治療或預(yù)防葡萄藤木質(zhì)部疾病，所述化合物可以在幼苗制備期間或在剪枝時(shí)或準(zhǔn)備剪枝時(shí)使用在苗圃中。

例如，所述式(i)的化合物可用于消毒繁殖或增殖材料，即根狀莖和嫁接物。所述式(i)的化合物也可用于在層積處理之前或之后處理嫁接物-切口?？商孢x地或另外，本發(fā)明的化合物可用于在幼苗被盆栽或種植在田間之前對(duì)其進(jìn)行消毒。作為說明，可以將繁殖材料和幼苗浸泡在含有一種或多種本發(fā)明的化合物的溶池中。通常，它可能是水性或水醇性溶液，具有范圍在0.1mm至1m之間的式(i)的化合物、例如1mm至500mm之間的式(i)的化合物的濃度。

如果需要，它們可以以包含一種或多種本發(fā)明的化合物的溶液的形式噴灑或刷涂。有利情況下，本發(fā)明的化合物可以與現(xiàn)有技術(shù)狀態(tài)中描述的利用熱水或苯菌靈、克菌丹或二癸基甲基氯化銨溶池的處理相組合使用，或替代所述處理。

不用說，本發(fā)明的化合物也可用于以預(yù)防性方式用于處理嫁接物和根狀莖的母藤(mothervine)。

正如上面提到的，本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療修剪傷口的感染，特別是小新殼梭孢(n.parvum)感染。就此而言，它們可以在剪枝之前或之后施用，通常在剛剛剪枝后通過噴灑、刷涂或注射到木質(zhì)部中來施用。

在如上所述的所有用途中，本發(fā)明的優(yōu)選化合物是式(ia)的化合物，特別是次水楊酸鉍。

一般來說，所述式(i)的化合物優(yōu)選地在使用前配制在植物用藥物組合物中。因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是一種植物用藥物組合物，其包含式(i)的化合物和至少一種可植物藥用賦形劑。自不用說，本發(fā)明的植物用藥物組合物旨在并適合用于在植物中治療或預(yù)防疾病，優(yōu)選為真菌疾病。換句話說，所述植物用藥物組合物的特征在于采取草藥制劑形式，并且式(i)的化合物的含量適合于在植物中給藥。自不用說，所述式(i)的化合物作為活性成分存在于符合本發(fā)明的植物用藥物組合物中。

所述植物用藥物組合物可以包含一種或多種式(i)的化合物。優(yōu)選的化合物是式(ia)的化合物，特別是次水楊酸鉍。

所述植物用藥物組合物可以是任何類型。它可以是水性或水醇性溶液、糊劑、凝膠特別是水性凝膠(或水凝膠)、膠、泡沫、油包水或水包油乳液、多重乳液、微乳液或納米乳液、膠束溶液、懸液或膠體。所述植物用藥物組合物也可以是固體，例如采取粉劑或顆粒劑形式，其可以通過“撒粉”直接施用或者在施用之前必須被溶解或分散在適合的溶劑中。

所述植物用藥物組合物也可以以旨在插入到木質(zhì)部中、特別是被病原菌感染的植物的木質(zhì)部分中的插入物或植入物的形式出現(xiàn)。在這種情況下，所述植物用藥物組合物可以以聚合物基質(zhì)的形式出現(xiàn)，允許所述式(i)的化合物在木質(zhì)部中的受控釋放。

本發(fā)明的植物用藥物組合物通常包含以重量計(jì)0.01％至50％的式(i)的化合物和以重量計(jì)50％至99.99％的一種或多種可植物檢疫用賦形劑，所述重量百分率相對(duì)于所述組合物的總重量來表述。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物用藥物組合物通常包含以重量計(jì)0.1％至30％的式1的化合物和以重量計(jì)70％至99.9％的一種或多種賦形劑。

“可植物病害控制用或可植物藥用賦形劑”意味著在其使用濃度下對(duì)植物、環(huán)境和人類沒有顯著毒性的賦形劑?？梢栽谥参镉盟幬锝M合物中使用的賦形劑對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是公知的，并且包括稀釋劑和填充劑、潤(rùn)濕劑、表面活性劑例如離子型、兩親性或非離子型表面活性劑、分散劑、增稠劑、膠凝劑、允許活性劑受控釋放的試劑例如包膠劑或膠束劑如磷脂、觸變添加劑、染料、抗氧化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、成膜劑、載體特別是溶劑例如水和低級(jí)醇類、礦物、植物或動(dòng)物來源的油、樹脂、蠟、松香、乳膠、樹膠例如阿拉伯膠、消泡劑和膠黏劑。

在優(yōu)選實(shí)施方式中，本發(fā)明的組合物包含選自填充劑或稀釋劑、增稠劑、載體和表面活性劑的賦形劑。

作為填充劑或稀釋劑的實(shí)例，可以提到的是例如硅酸鎂或硅酸鋁、高嶺土、滑石、石英、綠坡縷石、蒙脫石、膨潤(rùn)土、硅藻土、二氧化硅、氧化鋁、浮石、白云石、纖維素及其衍生物、淀粉及其衍生物，及其混合物等。

作為載體的實(shí)例，可以提到的是水、醇類特別是丁醇或二醇、有機(jī)溶劑、礦物油例如凡士林和石蠟油、植物油例如菜籽油或葵花油，及其混合物。

表面活性劑可以是離子型或非離子型乳化劑、分散劑或潤(rùn)濕劑，或這些表面活性劑的混合物。其中，可以提到的是例如聚丙烯酸鹽、木素磺酸鹽、苯酚磺酸鹽或萘磺酸鹽，氧化乙烯與脂肪醇、脂肪酸或脂肪胺的縮合聚合物，取代的苯酚(特別是烷基苯酚)，?；撬嵫苌?特別是烷基化衍生物)，醇類或氧化乙烯與苯酚類的縮合聚合物的磷酸酯，脂肪酸與多元醇的酯類，或這些化合物的硫酸鹽、磺酸鹽或磷酸鹽官能化的衍生物。表面活性劑還包含例如烷基聚糖苷，脂肪酸蔗糖甘油酯，乙烯吡咯烷酮-乙酸乙烯酯、乙烯吡咯烷酮-甲基丙烯酸乙酯、甲基乙烯基醚-馬來酸酐的共聚物，或磷脂類。當(dāng)活性成分和/或填充劑在所使用的載體例如水中僅僅微溶或不溶時(shí)，至少一種表面活性劑的存在可能是必需的。

作為適合的增稠劑，可以提到的是水合氧化鋁、氫氧化鎂、膨潤(rùn)土類型的粘土和膠體二氧化硅、白蛋白、酪蛋白、淀粉類材料例如玉米淀粉、植物膠例如阿拉伯膠、黃原膠和黃蓍膠、淀粉衍生物、藻酸鹽、卡拉膠、纖維素醚例如甲基纖維素、羧甲基纖維素、甲基羥基乙基纖維素、羥基乙基纖維素和羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、聚丙烯酸及其混合物。

優(yōu)選地，符合本發(fā)明的植物用藥物組合物包含選自陰離子型或非離子型乳化劑和礦物油或植物油的至少一種賦形劑。

例如，可以使用由itcf(法國(guó)谷物和飼料技術(shù)研究所)(frenchtechnicalinstituteforcerealsandfodder)推薦的一種或多種賦形劑，特別是一種或多種表面活性劑。

本發(fā)明的植物用藥物組合物還可以包含一種或多種其他植物病害控制劑或植物用藥劑。所述其他植物病害控制劑或植物用藥劑可以選自殺蟲劑、殺細(xì)菌劑、真菌劑、殺病毒劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、植物天然防衛(wèi)刺激劑例如誘導(dǎo)因子等。

所述誘導(dǎo)因子可以是化合物例如海帶多糖、寡聚半乳糖醛酸或幾丁質(zhì)。

所述其他殺真菌劑可以選自例如環(huán)酰菌胺、氟吡菌酰胺、肟菌酯、螺環(huán)菌胺、氟環(huán)唑、唑菌胺酯、代森錳鋅、霜脲氰、三乙膦酸鋁、滅菌丹、四氟醚唑、戊唑醇、硫酸銅、百菌清、kiralaxyl、丁苯嗎啉、氰霜唑、唑嘧菌胺、代森聯(lián)、二噻農(nóng)和烯酰嗎啉。

另外或可替選地，本發(fā)明的植物用藥物組合物可以包含選自肥料和施肥劑的一種或多種化合物。

本發(fā)明的植物用藥物組合物可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法來制備，例如通過將式(i)的化合物與一種或多種賦形劑和任選地一種或多種其他植物病害控制劑進(jìn)行混合。

本發(fā)明的植物用藥物組合物的草藥制劑形式和賦形劑取決于所治療的疾病和/或所需的給藥方式。

符合本發(fā)明的給藥方式包括噴灑，撒粉，注射到木質(zhì)部中或木質(zhì)壞死的區(qū)域中，刷涂或鋪展，尤其是在修剪傷口上。它也可以通過浸泡來給藥，例如對(duì)于處理繁殖材料和幼苗來說。給藥方式也可以依靠將插入物導(dǎo)入到木質(zhì)部或木質(zhì)壞死中。如果需要，可以將本發(fā)明的化合物或組合物在用于灌溉植物的水中給藥。

作為說明，符合本發(fā)明的植物用藥物組合物可以是可噴灑溶液，其包含：

-1％至5％的式(i)的化合物，

-1％至10％的表面活性劑例如卵磷脂，

-85％至98％的載體，優(yōu)選為水，

-任選地，1％至20％的成膜劑，優(yōu)選為礦物油、多糖，

-任選地，0.1％至5％的其他植物用藥劑，優(yōu)選為殺真菌劑。

這種溶液優(yōu)選地在施用之前稀釋2至10倍。

本發(fā)明的化合物或組合物的給藥頻率、量和時(shí)間長(zhǎng)度取決于待治療或預(yù)防的真菌疾病以及待治療的植物或作物的類型。

例如，可以估算每次治療所給藥的化合物(i)的量在每公頃作物1g至1kg之間，優(yōu)選為每公頃作物(例如葡萄藤作物)5g至1kg之間。

為了預(yù)防或治療植物的地上部分的疾病例如灰腐病或黑腐病，可以將本發(fā)明的植物用藥物組合物以每月至少一次例如每三周一次、每?jī)芍芤淮位蛎恐芤淮蔚念l率使用在作物例如果園或葡萄園上。所述植物用藥物組合物優(yōu)選地通過噴灑施用到葉和/或果實(shí)。所述治療周期可以在葉發(fā)育期間開始并在收獲果實(shí)或果實(shí)串時(shí)結(jié)束。

為了防止修剪傷口感染，作物可以在剪枝之前、期間和/或之后，優(yōu)選地在剪枝之前和之后進(jìn)行處理。例如，可以在剪枝前48、24或12小時(shí)內(nèi)，甚至在剪枝前1小時(shí)內(nèi)，通過用本發(fā)明的植物用藥物組合物噴灑來處理所述植物(例如葡萄藤或果樹)?？梢栽诩糁?4或48小時(shí)內(nèi)再次處理所述植物，優(yōu)選地通過噴灑或刷涂本發(fā)明的植物用藥物組合物。如有必要，所述處理可以被重復(fù)多次，例如以每?jī)芍芤淮蔚念l率。

也可以在剪枝的同時(shí)施用本發(fā)明的植物用藥物組合物，例如使用可以同時(shí)進(jìn)行剪切和本發(fā)明的植物用藥物組合物的分配這兩者的裝置。在這種實(shí)施方式中，本發(fā)明的植物用藥物組合物有利地采取液體或膠凝溶液的形式。

作為本發(fā)明的其他示例性實(shí)施方式，表現(xiàn)出壞死、例如埃斯卡病、彎孢殼頂枯病或葡萄座腔菌頂枯病典型的壞死的葡萄藤樹干，可以通過向壞死區(qū)域直接施用本發(fā)明的植物用藥物組合物進(jìn)行處理，其中所述組合物可以采取糊劑形式。

根據(jù)另一種情況，本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種在植物中治療或預(yù)防疾病、優(yōu)選為真菌疾病的方法，所述方法包括在所述植物的至少一部分上施用如上所定義的式(i)的化合物或植物用藥物組合物。

不需多說，這種方法可以按照上述條件任一者來實(shí)施。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種對(duì)在幼苗或離開苗圃的幼苗的制備期間使用的增殖材料進(jìn)行消毒的方法，所述方法包括在所述增殖材料或幼苗上施用本發(fā)明的式(i)的化合物或植物用藥物組合物，優(yōu)選地通過浸泡來施用。

最后，本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種在收獲的產(chǎn)品中預(yù)防或治療腐爛或霉病的方法，所述方法包括在所述收獲的產(chǎn)品上施用如上所定義的式(i)的化合物或植物用藥物組合物。

這種施用可以例如在所述收獲的產(chǎn)品包裝之前或期間，通過噴灑來進(jìn)行。

在閱讀了下面的實(shí)施例后，本發(fā)明的其他方面和優(yōu)點(diǎn)將顯而易見，所述實(shí)施例應(yīng)該被當(dāng)作說明性的而絕不是限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例

實(shí)施例1：小新殼梭孢(n.parvum)勃艮地分離株s–116在各種不同的增補(bǔ)培養(yǎng)基上的菌絲體生長(zhǎng)的研究——次水楊酸鉍的殺生物活性的評(píng)估

流程

真菌勃艮地小新殼梭孢(n.parvum)生長(zhǎng)在增補(bǔ)有檸檬酸鉍(c6h7bio4–mm＝398.08g/mol)、氧化鉍(bi2o3–mm＝465.95g/mol)、次水楊酸鉍(c7h5bio4–mm＝362.09g/mol)、氧化銅(cuo–mm＝79.54g/mol–“抗真菌作用”對(duì)照)或氧化銻(o3sb2–mm＝291.5g/mol)的固體馬鈴薯右旋糖瓊脂(pda，20g/l)上。

試驗(yàn)了各種不同濃度的產(chǎn)品：0、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5和10g/l，或取決于所試驗(yàn)的化合物，0至125mm。

將10日齡菌絲體的圓形塞子(直徑為7mm)無菌安放在每個(gè)皮氏培養(yǎng)皿的中央。然后將所述皮氏培養(yǎng)皿在暗處在25℃下溫育，并且每24小時(shí)測(cè)量菌絲體生長(zhǎng)(以mm為單位)，直至不含增補(bǔ)物的對(duì)照培養(yǎng)皿飽和或5天。在該試驗(yàn)期間進(jìn)行三份技術(shù)和生物學(xué)平行試驗(yàn)。

結(jié)果

圖1示出了在“對(duì)照”培養(yǎng)皿上菌絲體飽和的第1天，或4天后的結(jié)果。它們被表示為相對(duì)于對(duì)照(100％)的菌絲體生長(zhǎng)的平均百分率(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

含有氧化鉍、檸檬酸鉍或氧化銻的培養(yǎng)基不顯著抑制所述真菌在所述培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。

作為抑制真菌生長(zhǎng)的陽性對(duì)照的氧化銅具有低劑量抑制效應(yīng)，并且在5mm下開始觀察到所述真菌的ld50。與這種化學(xué)化合物相比，次水楊酸鉍顯著抑制菌絲體生長(zhǎng)，其中當(dāng)它被添加到傳統(tǒng)的真菌培養(yǎng)基時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)抑制ld50始于14mm。

實(shí)施例2：灰葡萄孢(b.cinerea)b0510在各種不同的增補(bǔ)培養(yǎng)基上的菌絲體生長(zhǎng)的研究——次水楊酸鉍的殺生物活性的評(píng)估

流程

這些實(shí)驗(yàn)在與實(shí)施例1中相同的條件下進(jìn)行，并且我們還試驗(yàn)了灰葡萄孢(b.cinerea)培養(yǎng)基中水楊酸(c7h6o3–mm＝138.12g/mol)的影響。應(yīng)該指出，在使用灰葡萄孢(b.cinerea)b0510時(shí)，對(duì)照培養(yǎng)皿的菌絲體飽和發(fā)生在9天后。

結(jié)果

圖2示出了在“對(duì)照”培養(yǎng)皿上菌絲體飽和的第1天，或8天后的結(jié)果。它們被表示為相對(duì)于對(duì)照(100％)的菌絲體生長(zhǎng)的平均百分率(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。

含有氧化鉍、檸檬酸鉍或氧化銻的培養(yǎng)基不顯著抑制所述真菌在所述培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。

作為抑制真菌生長(zhǎng)的陽性對(duì)照的氧化銅具有低劑量抑制效應(yīng)，并且在5mm下開始觀察到所述真菌的ld50。次水楊酸鉍也抑制灰葡萄孢(b.cinerea)的菌絲體發(fā)育，其ld50始于20mm。

實(shí)施例3：在用各種不同的化學(xué)化合物溶池處理后(14dpi)被小新殼梭孢(n.parvum)勃艮地分離株s–116感染的葡萄藤(釀酒葡萄霞多麗栽培種v.viniferal.cv.chardonnay)中壞死的發(fā)生的研究

流程

使用直徑為5mm的鉆頭在釀酒葡萄霞多麗栽培種(v.viniferal.cv.chardonnay)的綠色節(jié)間上鉆孔。然后將每個(gè)鉆孔的節(jié)間在水溶池(陰性對(duì)照)或含有15mm氧化鉍、水楊酸或次水楊酸鉍的溶池中浸泡10分鐘。然后將小新殼梭孢(n.parvum)勃艮地分離株菌絲體或麥芽培養(yǎng)基(對(duì)照)的塞子(直徑為5mm)引入到所述節(jié)間中，然后用封口膜覆蓋。然后將所述節(jié)間在暗處，在25℃和約70％濕度下溫育14天。在接種的這14天后，從所述節(jié)間除去木質(zhì)表層，然后使用軟件計(jì)算壞死面積。

結(jié)果被表示為在所述節(jié)間上觀察到的壞死區(qū)域的平均百分率(±標(biāo)準(zhǔn)偏差)。在該試驗(yàn)期間進(jìn)行三份生物學(xué)平行試驗(yàn)，每份包含每種處理的7份技術(shù)平行試驗(yàn)。使用duncan統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(使用p≤0.05)以便比較所述處理。

結(jié)果

圖3示出了為試驗(yàn)的每種溶池獲得的結(jié)果。值得注意的是，使用15mm水楊酸的處理不顯著抑制接種的節(jié)間上壞死的發(fā)生。氧化鉍處理使壞死面積僅減少5％。另一方面，與對(duì)照樣品相比，用15mm次水楊酸鉍預(yù)處理可以以顯著的方式阻止壞死的發(fā)生，因?yàn)橛^察到壞死病變的表面積減小幾乎50％。

所述節(jié)間的預(yù)處理由以15mm次水楊酸鉍的10分鐘浸泡構(gòu)成，因此實(shí)質(zhì)上并顯著抑制了木質(zhì)部中真菌的生長(zhǎng)，并由此抑制了壞死形成。

實(shí)施例4：次水楊酸鉍對(duì)葡萄藤細(xì)胞簇(釀酒葡萄霞多麗栽培種v.viniferal.cv.chardonnay)的植物毒性的評(píng)估

流程

如mauro等(1986)和bertsch等(2005)中所述，從花藥獲得釀酒葡萄霞多麗栽培種(v.viniferal.cv.chardonnay)的愈傷組織(或未分化的細(xì)胞簇)。

每3周將所有愈傷組織接種在新鮮固體mpm1培養(yǎng)基(perrin等，2004)上，并在暗處，在25±0.5℃和70±10％的相對(duì)濕度下溫育。

對(duì)于本實(shí)驗(yàn)來說，我們用0.5或10mm次水楊酸鉍、氧化鉍或水楊酸增補(bǔ)所述愈傷組織培養(yǎng)基。

本實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。對(duì)于每種條件，使用直徑為10±2mm的15個(gè)黃白色愈傷組織。

通過每天稱重共五天來評(píng)估在每種試驗(yàn)條件下愈傷組織的生長(zhǎng)。將duncan統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)(使用p≤0.05)應(yīng)用于由此獲得的結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。除了稱重之外，我們根據(jù)培養(yǎng)基目測(cè)評(píng)估愈傷組織的外觀和顏色，共2個(gè)月。

結(jié)果

培養(yǎng)5天后的結(jié)果表明，愈傷組織在所試驗(yàn)的各種不同培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)既沒有顯著抑制，也沒有增加。

對(duì)于愈傷組織的外觀和顏色來說，在增補(bǔ)有5和10mm氧化鉍的培養(yǎng)基上沒有變化。在增補(bǔ)有5或10mm次水楊酸鉍或水楊酸的培養(yǎng)基上，我們觀察到在愈傷組織的外周處出現(xiàn)淺灰色變色，但是沒有注意到壞死。在培養(yǎng)2周后，這些愈傷組織表現(xiàn)出正常顏色(黃白色)的細(xì)胞增殖區(qū)，包括來自于在培養(yǎng)5天后具有發(fā)灰顏色的區(qū)域。

在增補(bǔ)mpm1培養(yǎng)基上生長(zhǎng)3周后，將愈傷組織重新接種在新鮮的純mpm1培養(yǎng)基上。它們的外觀、顏色和生長(zhǎng)與對(duì)照相似，在實(shí)驗(yàn)2個(gè)月后都呈現(xiàn)黃白色。因此，次水楊酸鉍的添加在生長(zhǎng)、增殖或壞死外觀方面對(duì)葡萄藤細(xì)胞沒有影響。

實(shí)施例5：次水楊酸鉍和水楊酸在葡萄藤細(xì)胞簇(釀酒葡萄霞多麗栽培種v.viniferal.cv.chardonnay)中誘導(dǎo)植物防衛(wèi)基因

流程

在純mpm1培養(yǎng)基(對(duì)照)或增補(bǔ)有10mm水楊酸或10mm次水楊酸鉍的mpm1培養(yǎng)基上培養(yǎng)4天后，獲取實(shí)施例4的愈傷組織，以便用于如ramirez–suero等(2014)中所述通過qrt–pcr進(jìn)行分子分析。對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)來說，每種條件獲取3個(gè)愈傷組織。

在從這些愈傷組織提取rna并合成它們的cdna后，我們按照在bénard–gellon等(2014)中描述的條件進(jìn)行qrt–pcr分析，以便觀察水楊酸途徑的兩種特定基因的表達(dá)：vvpr1(獲取溫度＝83℃)和vveds1(獲取溫度＝77℃)。對(duì)于每種樣品和所試驗(yàn)的每種基因進(jìn)行3份技術(shù)和生物學(xué)平行試驗(yàn)。將vvact和vvef1–cs基因用作參比基因以歸一化我們的結(jié)果。當(dāng)基因的誘導(dǎo)比率≥4時(shí)，所述基因?qū)⒈灰暈檫^表達(dá)。按照hellemans等(2007)的程序計(jì)算表達(dá)值中位數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)偏差。應(yīng)用duncan檢驗(yàn)(使用p≤0.05，duncan1955)和anova多變量分析(manugistics,inc.,maryland,usa)來比較每種培養(yǎng)基上的基因表達(dá)。

結(jié)果

結(jié)果呈現(xiàn)在圖4中。通過qrt–pcr進(jìn)行的分子分析表明，在增補(bǔ)有10mm水楊酸或次水楊酸鉍的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的愈傷組織過表達(dá)vvpr1和vveds1基因。引人注目的是，這些防衛(wèi)基因表達(dá)的研究顯示，在已與次水楊酸鉍相接觸的細(xì)胞中，該產(chǎn)品誘導(dǎo)水楊酸途徑特征性的基因的過表達(dá)，并且這種基因過表達(dá)比使用水楊酸時(shí)觀察到的更高。

實(shí)施例6：次水楊酸鉍對(duì)8種模型真菌的評(píng)估小組的殺生物活性的評(píng)估

評(píng)估了次水楊酸鉍對(duì)8種其他模型真菌的殺生物活性，這些真菌即：

-互隔鏈格孢(alternariaalternata)：鏈格孢霉病(或早疫病)模型微生物，

-禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)：鐮孢菌病模型微生物，

-小麥殼針孢(septoriatritici)：在小麥中造成殼針孢病的微生物，

-大麗輪枝孢(verticilliumdahliae)：輪枝孢病模型微生物，

-稻瘟菌(magnaporthegrisea)：瘟病模型微生物，

-核果鏈核盤菌(monilinialaxa)：褐腐病模型微生物，

-指狀青霉(penicilliumdigitatum)：造成水果腐爛病、尤其是柑橘腐爛病(綠腐病)的因子，

-黑曲霉(blackaspergilli(aspergillusniger))：造成水果和蔬菜上的黑霉病外觀的微生物。

也在灰葡萄孢(botrytiscinerea)上再次試驗(yàn)了所述化合物的殺生物活性。

所述活性試驗(yàn)在皮氏培養(yǎng)皿上在瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行，例外的是小麥殼針孢(septoriatritici)，對(duì)其使用所謂的“微孔”技術(shù)。在7種濃度即1g/l、3g/l、7g/l、9g/l、10g/l和12.5g/l下評(píng)估次水楊酸鉍的殺生物活性。為此，制備含有50g/ml化合物、1％(v/v)mes(10mm，ph6)和3％(v/v)dmso的水性儲(chǔ)用溶液。

■皮氏培養(yǎng)皿試驗(yàn)

執(zhí)行下述流程：

在固化之前向瓊脂培養(yǎng)基添加所需濃度的次水楊酸鉍。在固化后，將事先浸泡在孢子懸液中的真菌插片或一片碎紙?jiān)跓o菌條件下安放在每個(gè)皮氏培養(yǎng)皿中央。將所述皮氏培養(yǎng)皿在微生物培養(yǎng)箱中在21℃下溫育。進(jìn)行菌絲體生長(zhǎng)(以cm為單位的直徑)直至“對(duì)照”皮氏培養(yǎng)皿飽和。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三份平行試驗(yàn)。為每個(gè)實(shí)驗(yàn)、包括對(duì)照實(shí)驗(yàn)即在不存在次水楊酸鉍下進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)計(jì)算直徑值的平均值。按照下述公式確定表示為給定濃度下化合物的百分率的效能：

100％的效能意味著所述化合物完全抑制菌絲體生長(zhǎng)。

獲得的結(jié)果呈現(xiàn)在下面的表1中：

表1：次水楊酸鉍的效能隨濃度和真菌物種的變化

上表中示出的結(jié)果顯示，在所有試驗(yàn)的植物病原菌中，次水楊酸鉍在9g/l濃度下能夠完全阻斷菌絲體生長(zhǎng)。在互隔鏈格孢(alternariaalternata)和禾谷鐮孢菌(fusariumgraminearum)中，這種抑制效應(yīng)甚至在3g/l濃度下也能觀察到。

■微孔試驗(yàn)

還使用微孔試驗(yàn)，試驗(yàn)了次水楊酸鉍對(duì)小麥殼針孢(septoriatritici)的殺生物活性。執(zhí)行下述流程：

向培養(yǎng)基添加次水楊酸鉍。然后將所述培養(yǎng)基用小麥殼針孢(septoriatritici)孢子的懸液接種。將所述微孔在微生物培養(yǎng)箱中在21℃下溫育。每個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行三次。對(duì)于每個(gè)微孔，確定形成的集落的數(shù)量(cfu)。為每個(gè)實(shí)驗(yàn)和在不存在次水楊酸鉍下進(jìn)行的對(duì)照實(shí)驗(yàn)計(jì)算cfu值的平均值。按照下述公式確定在給定濃度下化合物的效能百分率：

100％的效能意味著所述化合物完全抑制集落形成(即沒有集落形成)。

結(jié)果呈現(xiàn)在下面的表2中：

表2：在小麥殼針孢(septoriatritici)中次水楊酸鉍的效能隨濃度的變化

因此注意到，次水楊酸鉍一旦以5g/l的濃度存在于培養(yǎng)基中，即可完全抑制小麥殼針孢(septoriatritici)集落的形成。

實(shí)施例7：次水楊酸鉍對(duì)造成霉病的兩種卵菌微生物的潛在殺生物活性的評(píng)估

相對(duì)古老的研究提到了次水楊酸鉍對(duì)造成霉病的病原性卵菌具有殺生物活性。

因此在兩種模型卵菌即plasmoporaviticola和phytophtorainfestans上試驗(yàn)了次水楊酸鉍。本研究在植物圓盤上進(jìn)行。使用裝備有5個(gè)噴嘴的噴灑臺(tái)，通過在所有植物圓盤上噴灑來施加次水楊酸鹽水性溶液(濃度為1g/l至12.5g/l)。施用體積為200l/ha。噴灑被重復(fù)一次。每個(gè)實(shí)驗(yàn)在20個(gè)葉片圓盤上進(jìn)行兩份平行試驗(yàn)。在溫育期(通常為8天)后，在雙目放大鏡下進(jìn)行卵菌定殖和孢子形成的評(píng)估。將被卵菌定殖的葉片圓盤的表面積和孢子形成的強(qiáng)度在0至10的量表上評(píng)級(jí)。計(jì)算在10個(gè)圓盤上的平均損壞并將其用于獲得與未處理的圓盤相比方法的效能。在所使用的計(jì)算中使用的公式是：(藥劑d的效能)＝{[(t–d)/t]*100}，其中t是在10個(gè)對(duì)照?qǐng)A盤上的平均攻擊等級(jí)，并且d是在用藥劑d處理的圓盤上觀察到的平均攻擊等級(jí)。次水楊酸鉍的效能值的百分率如下(表3)：

從這些結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，對(duì)于造成霉病的卵菌來說，次水楊酸鉍的殺生物活性非常低，事實(shí)上可忽略。因此，次水楊酸鉍的殺生物作用特異性針對(duì)植物病原真菌。

在實(shí)驗(yàn)部分中引用的參考文獻(xiàn)：

benard–gellonm,farines,goddardml,schmittm,stempiene,pensecf,laloueh,mazet–kiefferf,fontainef,larignonp,chongj,tarnusc,bertschc(2014)，來自于參與葡萄藤葡萄座腔菌頂枯病的沙雷氏色二孢(diplodiaseriata)和小新殼梭孢(neofusicoccumparvum)的細(xì)胞外蛋白的毒性(toxicityofextracellularproteinsfromdiplodiaseriataandneofusicoccumparvuminvolvedingrapevinebotryosphaeriadieback)，protoplasmadoi:10.1007/s00709–014–0716–y.

bertschc,kiefferf,maillotp,farines,butterling,merdinoglud,walterb(2005)，釀酒葡萄霞多麗栽培種96的遺傳嵌合性通過器官發(fā)生而不是體細(xì)胞胚胎發(fā)生得以維持(geneticchimerismofvitisviniferacv.chardonnay96ismaintainedthroughorganogenesisbutnotsomaticembryogenesis)，bmcplantbiology5:20.

hellemansj,mortierg,depaepea,spelemanf,vandesompelej(2007)，用于實(shí)時(shí)定量pcr數(shù)據(jù)的管理和自動(dòng)分析的qbase相對(duì)定量構(gòu)架和軟件(qbaserelativequantificationframeworkandsoftwareformanagementandautomatedanalysisofreal–timequantitativepcrdata)，genomebiol8(2):r19.

maurom,nefc,fallotj(1986)，從釀酒葡萄cabernet–sauvignon栽培種的另一種培養(yǎng)物刺激體細(xì)胞胚胎發(fā)生和植株再生(stimulationofsomaticembryogenesisandplantregenerationfromanothercultureofvitisviniferacv.cabernet–sauvignon)，plantcellreports5:377–380.

perrinm,gertzc,massonje(2004)，來自于世界范圍內(nèi)生長(zhǎng)的19種葡萄藤基因型的花藥細(xì)絲的可再生的胚胎發(fā)生愈傷組織的高效率(highefficiencyofregenerableembryogeniccallusfromantherfilamentsof19–grapevinegenotypesgrownworldwide)，plantscience167:1343–1349.

ramirez–suerom,bénard–gellonm,chongj,laloueh,stempiene,abou–mansoure,fontainef,larignonp,mazet–kiefferf,farines,bertschc(2014)，由與葡萄座腔菌頂枯病相關(guān)的真菌產(chǎn)生的細(xì)胞外化合物在釀酒葡萄霞多麗栽培種細(xì)胞中誘導(dǎo)差異防衛(wèi)基因表達(dá)模式和壞死(extracellularcompoundsproducedbyfungiassociatedwithbotryosphaeriadiebackinducedifferentialdefencegeneexpressionpatternsandnecrosisinvitisviniferacv.chardonnaycells)，protoplasma.doi:10.1007/s00709–014–0643–y.

bertschc,ramírez–suerom,magnin–robertm,larignonp,chongj,abou–mansoure,spagnoloa,clémentc,fontainef(2013)，葡萄藤樹干?。簭?fù)雜且仍然未被良好理解(grapevinetrunkdiseases:complexandstillpoorlyunderstood)，plantpathology62:243–265.

andolfia,mugnail,luquej,suricog,cimminoa,evidentea(2011)，由與葡萄藤樹干病相關(guān)的真菌產(chǎn)生的植物毒素(phytotoxinsproducedbyfungiassociatedwithgrapevinetrunkdiseases)，toxins3:1569–1605.

jr(2011)，感染葡萄藤的葡萄座腔菌科物種的狀態(tài)(thestatusofbotryosphaeriaceaespeciesinfectinggrapevines)，phytopathol.mediterr.50s5–s45.