本發(fā)明涉及一種制備農(nóng)化組合物的方法，其包括以下步驟：通過使固體水不溶性農(nóng)藥和疏水蛋白接觸而制備預(yù)混物，以及通過研磨預(yù)混物而制備粗懸浮液。此外，本發(fā)明涉及一種包含固體水不溶性農(nóng)藥和疏水蛋白的農(nóng)化組合物，其中組合物可通過所述方法獲得。此外，本發(fā)明涉及疏水蛋白在降低固體水不溶性農(nóng)藥的毒性中的用途。另外的主題是防治植物病原真菌和/或不希望的植物生長(zhǎng)和/或不希望的昆蟲或螨蟲侵襲和/或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的方法，其中使組合物作用于相應(yīng)有害物、其環(huán)境或待保護(hù)以防相應(yīng)有害物的作物植物，作用于土壤和/或作用于不希望的植物和/或作用于作物植物和/或作用于其環(huán)境；一種降低固體水不溶性農(nóng)藥的毒性的方法，其包括使水不溶性農(nóng)藥與疏水蛋白接觸的步驟；以及包含所述懸浮液的種子。
例如為了處理農(nóng)化組合物的農(nóng)民，開發(fā)了各種方法以降低農(nóng)藥的毒性。建議減少暴露時(shí)間，使用安全手套或安全眼鏡。可使配制劑中的農(nóng)藥濃度降低，或可使農(nóng)藥包封在聚(甲基)丙烯酸酯或聚脲膠囊中。
本發(fā)明的目的是找到降低農(nóng)化組合物中的農(nóng)藥的毒性的方法。
該目的通過一種制備農(nóng)化組合物的方法而實(shí)現(xiàn)，所述方法包括以下步驟：
a)通過使固體水不溶性農(nóng)藥和疏水蛋白接觸而制備預(yù)混物，和
b)通過研磨預(yù)混物而制備粗懸浮液。
本申請(qǐng)?jiān)谄浞秶鷥?nèi)還包括實(shí)施方案的組合，優(yōu)選實(shí)施方案的組合，以及優(yōu)選形式的組合，各自與優(yōu)選程度無關(guān)。
在步驟a)中，接觸可以通過混合(例如通過攪拌、振蕩、傾入)農(nóng)藥、疏水蛋白以及任選地水和分散劑而進(jìn)行。步驟a)中的組分可以以任何順序混合。通常，疏水蛋白最后且正好在農(nóng)藥后加入。步驟a)中的接觸可在-20至100℃，優(yōu)選5-80℃，特別是10-50℃的溫度下進(jìn)行。
優(yōu)選地，步驟a)包括通過使農(nóng)藥、疏水蛋白和水接觸而制備預(yù)混物。
在另一優(yōu)選形式中，步驟a)包括通過使農(nóng)藥、疏水蛋白和分散劑接觸而制備預(yù)混物。
更優(yōu)選步驟a)包括通過使農(nóng)藥、疏水蛋白、水和分散劑接觸而制備預(yù)混物。
預(yù)混物或粗懸浮液可包含至少100g/l，優(yōu)選至少200g/l，更優(yōu)選至少300g/l的農(nóng)藥。預(yù)混物可以包含至多999g/l，優(yōu)選至多950g/l，特別是至多900g/l的農(nóng)藥。
預(yù)混物或粗懸浮液可以包含至少0.1g/l，優(yōu)選至少0.5g/l的疏水蛋白。預(yù)混物可以包含至多50g/l，優(yōu)選至多20g/l，特別是至多10g/l的疏水蛋白。
預(yù)混物或粗懸浮液可以包含至少10重量％，優(yōu)選至少20重量％，特別是至少30重量％的水。預(yù)混物可以包含至多90重量％，優(yōu)選至多70重量％，特別是至多60重量％的水。
預(yù)混物或粗懸浮液可以包含至少1g/l，優(yōu)選至少5g/l，特別是至少10g/l的分散劑。預(yù)混物可以包含至多250g/l，優(yōu)選至多100g/l，特別是至多50g/l的分散劑。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)混物包含至少100g/l的至少一種農(nóng)藥，至少1g/l的疏水蛋白，至少20％的水和至少5g/l的分散劑。
在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)混物包含至少300g/l的至少一種農(nóng)藥，至少1g/l的疏水蛋白，至少20％的水和至少5g/l的分散劑。
同樣在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)混物包含至多900g/l的至少一種農(nóng)藥，至多20g/l的疏水蛋白，至多90重量％的水和至多100g/l的分散劑。
同樣在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，預(yù)混物包含至多900g/l的至少一種農(nóng)藥，至多20g/l的疏水蛋白，至多90重量％的水和至多50g/l的分散劑。
在步驟b)中，可以在典型的研磨裝置中進(jìn)行研磨，例如球磨機(jī)、珠磨機(jī)、棒磨機(jī)、半自動(dòng)磨機(jī)和自動(dòng)磨機(jī)、卵石球磨機(jī)、研磨輥磨機(jī)、石磨、塔式粉碎機(jī)、錘磨機(jī)、行星式磨機(jī)、立軸沖擊磨、膠體磨、錐形磨、盤磨機(jī)、輪碾機(jī)、噴磨機(jī)、粒磨機(jī)、攪拌磨機(jī)、三輥磨機(jī)、振動(dòng)磨機(jī)、wiley磨機(jī)或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似碾磨和研磨裝置。
農(nóng)藥可以以顆粒形式存在于預(yù)混物中。預(yù)混物中農(nóng)藥的粒度可以大于100μm，優(yōu)選大于50μm，最優(yōu)選為50-100μm。
農(nóng)藥可以以顆粒形式存在于粗懸浮液中。粗懸浮液中農(nóng)藥的粒度可以小于100μm，優(yōu)選小于50μm，更優(yōu)選小于10μm，尤其優(yōu)選小于5μm。特別地，農(nóng)藥的粒度小于3μm。在此，農(nóng)藥顆粒通常具有粒度分布，并且以上給出的值是指隨機(jī)d50值，其為本技術(shù)人員已知的典型表征單位。
粒徑分布可以通過包含顆粒的含水懸浮液的激光衍射測(cè)定。在該測(cè)量方法中，樣品制備，例如稀釋到測(cè)量濃度將尤其取決于懸浮液樣品中的活性物質(zhì)的細(xì)度和濃度以及所用裝置(例如malvernmastersizer)上。程序應(yīng)為所述體系開發(fā)，并且對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的。
術(shù)語農(nóng)藥是指至少一種選自殺真菌劑、殺蟲劑、殺線蟲劑、除草劑、安全劑、生物農(nóng)藥和/或生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的活性物質(zhì)。優(yōu)選的農(nóng)藥為殺真菌劑、殺蟲劑、除草劑和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑。尤其優(yōu)選農(nóng)藥為殺蟲劑。也可使用兩種或更多種上述類別的農(nóng)藥的混合物。該類農(nóng)藥是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，它們例如可參見pesticidemanual，第16版(2013)，thebritishcropprotectioncouncil，london。合適的殺蟲劑為選自如下類別的殺蟲劑：氨基甲酸酯類、有機(jī)磷酸酯類、有機(jī)氯殺蟲劑、苯基吡唑類、擬除蟲菊酯類、新煙堿類、斯皮諾素類(spinosins)、阿維菌素類(avermectins)、米爾霉素類(milbemycins)、保幼激素類似物、烷基鹵、有機(jī)錫化合物、沙蠶毒素類似物、苯甲酰脲類、二?；骂?、meti殺螨劑以及諸如如下的殺蟲劑：氯化苦(chloropicrin)、拒嗪酮(pymetrozin)、氟啶蟲酰胺(flonicamid)、四螨嗪(clofentezin)、噻螨酮(hexythiazox)、特苯
優(yōu)選地，農(nóng)藥選自殺真菌劑，更優(yōu)選選自帶有鹵素原子的殺真菌劑。尤其優(yōu)選地，農(nóng)藥選自百菌清(chlorothalonil)和氟唑菌酰胺(fluxapyroxad)。在一個(gè)實(shí)施方案中，農(nóng)藥是百菌清。在另一實(shí)施方案中，農(nóng)藥是氟唑菌酰胺。
農(nóng)藥可以包含至少一種水不溶性農(nóng)藥。在20℃下，水不溶性農(nóng)藥在水中可具有至多10g/l，優(yōu)選至多1g/l，特別是至多0.5g/l的溶解度。
農(nóng)藥如水不溶性農(nóng)藥通常具有30℃以上，優(yōu)選50℃以上，特別是70℃以上的熔點(diǎn)。
合適的農(nóng)藥通常是多鹵化農(nóng)藥。
農(nóng)藥通常帶有至少2個(gè)共價(jià)連接的鹵素原子，優(yōu)選氯或氟，更優(yōu)選氯。
優(yōu)選地，農(nóng)藥帶有至少3個(gè)共價(jià)連接的鹵素原子，優(yōu)選氯或氟，更優(yōu)選氯。
更優(yōu)選地，農(nóng)藥帶有至少4個(gè)共價(jià)連接的鹵素原子，優(yōu)選氯或氟，更優(yōu)選氯。
本發(fā)明的疏水蛋白可以由通式(i)描述：
xn-c1-x1-50-c2-x0-5-c3-x1-100-c4-x1-100-c5-x1-50-c6-x0-5-c7-x1-50-c8-xm(i)其中x表示任意20種天然存在的氨基酸(phe、leu、ser、tyr、cys、trp、pro、his、gln、arg、ilemet、thr、asn、lys、val、ala、asp、glu、gly)，并且其中所指定的指數(shù)表示氨基酸數(shù)。在此，指數(shù)n和m表示0-500，優(yōu)選15-300的數(shù)，c表示半胱氨酸，并且至少一個(gè)多肽序列xm或xn表示具有至少20個(gè)氨基酸的肽序列，其并非天然連接到疏水蛋白。在此，疏水蛋白導(dǎo)致涂覆玻璃表面后接觸角偏移至少20°。
本發(fā)明的半胱氨酸c1-c8可以以還原或氧化形式存在或者形成二硫鍵。尤其優(yōu)選的是分子內(nèi)形成二硫鍵，特別是那些具有1個(gè)，優(yōu)選2個(gè)，更優(yōu)選3個(gè)，尤其優(yōu)選4個(gè)選自以下組的分子內(nèi)二硫鍵的那些：c1與c2；c3與c4；c5與c6；c7與c8。
在cys用于位置x的情況下，通式中不同半胱氨酸位置的所指定數(shù)相應(yīng)地變化。
優(yōu)選的多肽是通式(ii)的那些，
xn-c1-x3-25-c2-x0-2-c3-x5-50-c4-x2-35-c5-x2-15-c6-x0-2-c7-x3-35-c8-xm(ii)其中x表示任意20種天然存在的氨基酸(phe、leu、ser、tyr、cys、trp、pro、his、gln、arg、ilemet、thr、asn、lys、val、ala、asp、glu、gly)，并且其中所指定的指數(shù)表示氨基酸數(shù)。在此，指數(shù)n和m表示2-300的數(shù)，c表示半胱氨酸，并且多肽序列xm或xn中的至少一個(gè)表示具有至少35個(gè)氨基酸的肽序列，其并非天然連接到疏水蛋白。在此，疏水蛋白導(dǎo)致涂覆玻璃表面后接觸角偏移至少20°。
尤其優(yōu)選的多肽是通式(iii)的那些，
xn-c1-x5-9-c2-c3-x11-39-c4-x2-23-c5-x5-9-c6-c7-x6-18-c8-xm(iii)
其中x表示任意20種天然存在的氨基酸(phe、leu、ser、tyr、cys、trp、pro、his、gln、arg、ilemet、thr、asn、lys、val、ala、asp、glu、gly)，并且其中所指定的指數(shù)表示氨基酸數(shù)。在此，指數(shù)n和m表示0-200的數(shù)，c表示半胱氨酸，并且多肽序列xm或xn中的至少一個(gè)表示具有至少40個(gè)氨基酸的肽序列，其并非天然連接到疏水蛋白。在此，疏水蛋白導(dǎo)致涂覆玻璃表面后接觸角偏移至少20°。
特別優(yōu)選式(i)、(ii)或(iii)的多肽，其中各式包含至少一種選自dewa、roda、hypa、hypb、sc3、basf1、basf2及其部分和衍生物；優(yōu)選dewa、roda、basf1、basf2及其衍生物；最優(yōu)選選自dewa、roda及其衍生物的疏水蛋白。在一個(gè)實(shí)施方案中，疏水蛋白是dewa或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，疏水蛋白是roda或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，疏水蛋白是hypa或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，疏水蛋白是hypb或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，疏水蛋白是sc3或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，疏水蛋白是basf1或其衍生物。在另一實(shí)施方案中，疏水蛋白是basf2或其衍生物。所述疏水蛋白的序列公開在wo2006/082251，seqidno1-14中。
本發(fā)明的蛋白質(zhì)至少在一個(gè)位置xn或xm處帶有至少20個(gè)，優(yōu)選35個(gè)，尤其優(yōu)選50個(gè)，特別是100個(gè)氨基酸(以下稱為融合配對(duì))的聚合物序列，其并非天然連接到疏水蛋白。因此，應(yīng)指出蛋白質(zhì)由疏水蛋白部分和融合配對(duì)組成，并且因此不是天然存在的。
融合配對(duì)結(jié)構(gòu)部分可以選自多種蛋白質(zhì)。還可以將幾種融合配對(duì)連接到疏水蛋白，例如在疏水蛋白結(jié)構(gòu)部分的氨基末端(xn)和羧基末端(xm)處。兩種融合配對(duì)也可連接到本發(fā)明的蛋白質(zhì)的一個(gè)位置(xn或xm)。
優(yōu)選的融合配對(duì)是多肽，其天然存在于微生物中，特別是在大腸桿菌或枯草芽孢桿菌中。該融合配對(duì)的實(shí)例是序列yaad、yaae和硫氧還蛋白，它們?cè)趙o2006/082251，seqidno15-18中公開。在一個(gè)實(shí)施方案中，融合配對(duì)是yaad。在另一實(shí)施方案中，融合配對(duì)是yaae。在另一實(shí)施方案中，融合配對(duì)是硫氧還蛋白。
合適的融合配對(duì)也是所述序列的片段或衍生物，其僅包含這些序列的一部分，優(yōu)選70-99％，更優(yōu)選80-98％，或者其中單個(gè)氨基酸或核苷酸被改變的序列。實(shí)例將是在序列yaad和yaae的c末端處的其他氨基酸，特別是兩個(gè)氨基酸，優(yōu)選氨基酸arg和ser。此外，可以將其他氨基酸插入yaae的序列，例如根據(jù)wo2006/131564，seqidno17-18的氨基酸no2(gly)。
疏水蛋白的制備可以通過肽合成的化學(xué)方法，例如通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的固相合成而實(shí)現(xiàn)。
然而，尤其優(yōu)選涉及基因修飾生物或細(xì)胞系作為生產(chǎn)體系的方法，其中將融合配對(duì)和疏水蛋白部分編碼的基因序列在表達(dá)構(gòu)建體中組合。然后在將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移進(jìn)入所述生產(chǎn)體系中作為組合的基因序列的基因表達(dá)產(chǎn)物后，在生產(chǎn)體系中產(chǎn)生所需的蛋白質(zhì)。
合適的基因表達(dá)構(gòu)建體在文獻(xiàn)(例如wo2006/082251)中是已知的，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員容易設(shè)計(jì)的。相應(yīng)的多肽構(gòu)建體可以作為基因構(gòu)建體的結(jié)果在兩個(gè)末端帶有另外的氨基酸，以及融合蛋白和疏水蛋白之間的另外的氨基酸。
疏水蛋白分子的可能修飾可涉及糖基化、乙?；蚧瘜W(xué)交聯(lián)(例如用戊二醛)。
本發(fā)明的疏水蛋白的一個(gè)特征是表面特征的改變，如果這些表面用蛋白質(zhì)涂覆的話。這個(gè)變化可以在實(shí)驗(yàn)上通過測(cè)量表面用蛋白質(zhì)涂覆前后的水滴的接觸角以及計(jì)算兩個(gè)值之間的差異而測(cè)定。
通過以下程序描述用于測(cè)量接觸角的實(shí)驗(yàn)條件：
疏水蛋白或疏水蛋白融合蛋白的涂覆性能優(yōu)選在玻璃或特氟隆(作為用于疏水和親水表面的模型)上而測(cè)量。
如果它們?cè)诓Ａ线M(jìn)行，則將玻璃片在80℃下在1-100μg/ml疏水蛋白的50mm乙酸鈉ph4和0.1％tween20的溶液中溫育過夜，然后用h2odd沖洗，在80℃下在1％sds中溫育10分鐘，并用h2odd洗滌。
如果使它們?cè)谔胤∩线M(jìn)行，則將特氟隆片在80℃下在1-100μg/ml疏水蛋白的10mmtrisph8的溶液中培養(yǎng)過夜，然后用h2odd沖洗，在80℃下在1％sds中培養(yǎng)10分鐘，并用h2odd洗滌。
然后將樣品風(fēng)干，并在dataphysicscontactanglesystemoca15+,softwaresca20.2.0(2002年11月)上測(cè)量5μl水滴的接觸角。根據(jù)制造商的說明進(jìn)行測(cè)量。
在這些條件下，本發(fā)明的蛋白質(zhì)將接觸角增加至少20°，優(yōu)選25°，尤其是30°。
合適的生產(chǎn)體系可以是原核生物(包括古細(xì)菌)或真核生物，優(yōu)選包括嗜鹽桿菌(halobacteria)和甲烷球菌(methanococcae)的細(xì)菌、真菌、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、尤其優(yōu)選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、米曲霉(aspergillusoryzea)、構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、畢赤酵母(pichiapastoris)、假單胞菌屬(pseudomonasspec.)、乳桿菌屬(lactobacillus)、多形漢遜酵母(hansenulapolymorpha)、里氏木霉(trichodermareesei)或sf9細(xì)胞(以及相似的細(xì)胞系)。
優(yōu)選的生產(chǎn)體系是基因修飾生物或細(xì)胞系，優(yōu)選大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和sf9細(xì)胞，尤其優(yōu)選大腸桿菌。
取決于根據(jù)本發(fā)明使用的生產(chǎn)體系，它們以本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方式生長(zhǎng)或培養(yǎng)。微生物通常在包含碳源(通常以糖的形式)、氮源(通常以有機(jī)氮源的形式如酵母提取物或鹽如硫酸銨、痕量元素如鐵-、錳-、鎂鹽)和任選的維生素的液體介質(zhì)中生長(zhǎng)。它們通常在0-100℃，優(yōu)選10-60℃的溫度下在補(bǔ)充氧氣進(jìn)氣下生長(zhǎng)。在此，營(yíng)養(yǎng)液的ph可以保持在不同的值，即可以在發(fā)酵過程中調(diào)節(jié)或不調(diào)節(jié)。發(fā)酵可以作為間歇方法，作為半間歇方法或連續(xù)進(jìn)行。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可在發(fā)酵開始時(shí)提供；它可以半連續(xù)或連續(xù)加入。根據(jù)本發(fā)明，蛋白質(zhì)可以與生物體分離或用作用于所述目的的粗提取物。
疏水蛋白的產(chǎn)生可以通過培養(yǎng)產(chǎn)生多肽的微生物，任選地誘導(dǎo)多肽的表達(dá)并由液體培養(yǎng)物分離而蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)。
可以培養(yǎng)和發(fā)酵基因修飾生物體或細(xì)胞系。細(xì)菌可以例如在tb-或lb-介質(zhì)中或在20-40℃的溫度和6-9的ph下生長(zhǎng)。合適的培養(yǎng)條件可以在t.maniatis，effritsch和j.sambrook，molecularcloning：alaboratorymanual，coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，ny(1989)中找到。
如果多肽不分泌至介質(zhì)中，則細(xì)胞被破壞，并且產(chǎn)物通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法從溶菌產(chǎn)物中分離。細(xì)胞可能被高頻超聲，被高壓(例如在french-press中)，通過osmolysis，通過使用洗滌劑、裂解酶或有機(jī)溶劑，通過均化或通過上述所列方法的組合而破壞。因此，蛋白質(zhì)是以天然形式還是作為包涵體產(chǎn)生無關(guān)緊要。目標(biāo)蛋白質(zhì)連同其他可溶性蛋白質(zhì)一起從細(xì)胞中釋放出來。
多肽的純化可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法而實(shí)現(xiàn)。在第一步中，產(chǎn)物可以例如通過在離心機(jī)中沉降，通過過濾或通過分級(jí)沉降而由細(xì)胞碎片分離。如果目標(biāo)蛋白質(zhì)作為包涵體產(chǎn)生，則這尤其適用。在這種情況下，它們可以通過選擇性地在分離器或噴嘴分離器中離心分離而由細(xì)胞碎片分離。蛋白質(zhì)復(fù)性后(例如通過wo2008/019964中描述的方法)，蛋白質(zhì)的純化可以通過已知的色譜方法如通過凝膠過濾、離子交換色譜和疏水相互作用色譜以及采用所有其他常用方法如超濾、結(jié)晶、鹽析、透析或天然凝膠電泳而實(shí)現(xiàn)。合適的方法描述于cooper，f.g.，biochemischearbeitsmethoden，verlagwaterdegruyter，berlin，newyork或scopesr.，proteinpurification，springerverlag，newyork，heidelberg，berlin中。
此后，蛋白質(zhì)的配制劑可以通過干燥蛋白質(zhì)溶液，例如通過冷凍干燥、噴霧干燥、噴霧造粒或水分蒸發(fā)以及使用蛋白質(zhì)作為粉末或顆粒而制備。
作為實(shí)例，如wo2008/019964所述，可以實(shí)現(xiàn)噴霧干燥和噴霧造粒。
將載體體系或寡核苷酸用于分離重組蛋白可能是有利的，其延伸了用于融合蛋白的改變多肽編碼的特定核苷酸序列的cdna，這有助于分離。適當(dāng)?shù)男揎検抢缈杀豢贵w識(shí)別為抗原的所謂的標(biāo)記物如六組氨酸標(biāo)記(his6)或表位(描述于harlowe.和laned.，1988，antibodies：alaboratorymanual.coldspringharbor(n.y.)press中)。
其他合適的標(biāo)記物是例如ha標(biāo)記物、鈣調(diào)蛋白-bd、gst、mbd、甲殼素-gd、鏈霉親和素-bd-avi標(biāo)記物、flag標(biāo)記物、t7等。這些標(biāo)記物可用于將蛋白質(zhì)錨定到固體表面，例如可以插入色譜柱中的聚合物基質(zhì)或微量滴定板或任何其他表面。相應(yīng)的純化方案可由商業(yè)親和標(biāo)記物供應(yīng)商獲得。
在一個(gè)實(shí)施方案中，標(biāo)記物是his6標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是ha標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是鈣調(diào)蛋白bd標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是gst標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是mbd標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是甲殼素-bd標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是鏈霉親和素-bd-avi標(biāo)記物。在另一實(shí)施方案中，標(biāo)記物是flag標(biāo)記物。
本發(fā)明的疏水蛋白蛋白質(zhì)具有其作為融合蛋白的形式和其分離形式的疏水蛋白所希望的特征。因此，它們可以直接或在融合配對(duì)作為“純”疏水蛋白斷裂和分離之后應(yīng)用。
如果意欲分離融合配對(duì)，則將合適的斷裂位點(diǎn)(蛋白酶的特異性識(shí)別位點(diǎn))引入到疏水蛋白蛋白質(zhì)和融合配對(duì)之間的融合蛋白中。合適的斷裂位點(diǎn)優(yōu)選是在由生物信息學(xué)工具可以容易地確定的疏水蛋白結(jié)構(gòu)部分和融合蛋白部分都不出現(xiàn)的那些。尤其合適的是例如在蛋氨酸上的brcn斷裂，或借助因子xa-、腸激酶、凝血酶、tev斷裂(煙草蝕紋病毒蛋白酶)的蛋白酶介導(dǎo)的斷裂。
本發(fā)明還涉及包含固體水不溶性農(nóng)藥和疏水蛋白的農(nóng)化組合物，其中組合物可通過本發(fā)明的方法獲得(優(yōu)選通過本發(fā)明的方法獲得)。在一種形式中，包含農(nóng)藥和疏水蛋白的農(nóng)化組合物可通過包括以下步驟的方法獲得：a)通過使農(nóng)藥與疏水蛋白接觸而制備預(yù)混物，和b)通過研磨預(yù)混物而制備粗懸浮液。
農(nóng)化組合物可以以各種配制劑類型，例如懸浮液(如sc、od、fs、zc)、可濕性粉末或粉劑(如wp、sp、ws、dp、ds)、顆粒(如wg、sg、gr、fg、gg、mg)存在。這些和其他組合物類型在“catalogueofpesticideformulationtypesandinternationalcodingsystem”，technicalmonographno.2，第6版，2008年5月，croplifeinternational，croplifeinternational中定義。
在一種形式中，農(nóng)化組合物是含水懸浮液。懸浮液包含農(nóng)藥顆粒形式的農(nóng)藥，其通常懸浮在連續(xù)水相中。農(nóng)藥顆粒可以以20℃下是固體的結(jié)晶或無定形顆粒的形式存在。
懸浮液濃縮物形式的農(nóng)化組合物可包含0.1-50g/l的疏水蛋白，優(yōu)選0.1-10g/l，更優(yōu)選0.5-10g/l的疏水蛋白，特別是1-10g/l的疏水蛋白。
在本發(fā)明的一種形式中，懸浮液形式的農(nóng)化組合物可以包含至少100g/l的農(nóng)藥，0.1-10g/l的疏水蛋白，和至少1g/l的分散劑。
優(yōu)選地，懸浮液濃縮物形式的農(nóng)化組合物可以包含至少100g/l的農(nóng)藥，0.5-10g/l的疏水蛋白和至少5g/l的分散劑。
更優(yōu)選地，懸浮液濃縮物形式的農(nóng)化組合物可以包含至少200g/l的農(nóng)藥，0.5-5g/l的疏水蛋白，和至少10g/l的分散劑。
懸浮液濃縮物形式的農(nóng)化組合物可以包含至多900g/l的農(nóng)藥，至多10g/l的疏水蛋白，和至多100g/l的分散劑。
優(yōu)選地，懸浮液濃縮物形式的農(nóng)化組合物可以包含至多900g/l的農(nóng)藥，至多10g/l的疏水蛋白，和至多50g/l的分散劑。
除了農(nóng)藥顆粒形式的農(nóng)藥之外，懸浮液還可以包含另外的農(nóng)藥，其中另外的農(nóng)藥溶解在懸浮液的水相中。
農(nóng)化組合物優(yōu)選為含水懸浮液，這意指懸浮液包含水?；趹腋∫旱目傊亓浚瑧腋∫嚎砂辽?5重量％，優(yōu)選至少30重量％，尤其優(yōu)選至少40重量％的水?；趹腋∫旱目傊亓?，懸浮液可以包含20-85重量％，優(yōu)選30-75重量％，特別優(yōu)選35-70重量％的水。
在另一形式中，農(nóng)化組合物是固體配制劑類型，例如可濕性粉末或粉劑(如wp、sp、ws、dp、ds)或顆粒(如wg、sg、gr、fg、gg、mg)。固體配制劑類型可以通過本發(fā)明方法而制備，該方法除了步驟a)和b)之外還包括步驟c)干燥粗懸浮液。該干燥可以通過常規(guī)方法，例如通過施加高溫和/或真空而蒸發(fā)任何液體如水來實(shí)現(xiàn)。
在另一形式中，農(nóng)化組合物是選自水分散性顆?；蛩苄灶w粒的固體配制劑類型，其可以包含50-80重量％的農(nóng)藥和至多100重量％的分散劑和潤(rùn)濕劑(例如木質(zhì)素磺酸鈉和醇乙氧基化物)。
在另一形式中，農(nóng)化組合物是選自水分散性粉末和水溶性粉末的固體配制劑類型，其可以包含50-80重量％的農(nóng)藥，1-5重量％的分散劑(例如木質(zhì)素磺酸鈉)，1-3重量％的潤(rùn)濕劑(例如醇乙氧基化物)和至多100重量％的固體載體如硅膠。
農(nóng)化組合物可包含用于農(nóng)化配制劑的輔助劑。合適輔助劑的實(shí)例為固體載體或填料，表面活性劑，分散劑，乳化劑，潤(rùn)濕劑，助劑，加溶劑，滲透促進(jìn)劑，保護(hù)性膠體，粘附劑，增稠劑，保濕劑，驅(qū)除劑，引誘劑，進(jìn)食刺激劑，相容劑，殺菌劑，防凍劑，消泡劑，著色劑，增粘劑和粘合劑。
合適的固體載體或填料為礦土，例如硅酸鹽、硅膠、滑石、高嶺土、石灰石、石灰、白堊、粘土、白云石、硅藻土、膨潤(rùn)土、硫酸鈣、硫酸鎂、氧化鎂；多糖粉末，例如纖維素、淀粉；肥料，例如硫酸銨、磷酸銨、硝酸銨、脲類；植物來源的產(chǎn)品，例如谷粉、樹皮粉、木粉、堅(jiān)果殼粉，及其混合物。
合適的分散劑為表面活性化合物，如陰離子、陽(yáng)離子、非離子和兩性表面活性劑，嵌段聚合物，聚電解質(zhì)，及其混合物。該類表面活性劑可用作乳化劑、加溶劑、潤(rùn)濕劑、滲透促進(jìn)劑、保護(hù)性膠體或助劑。表面活性劑的實(shí)例列于mccutcheon’s，第1卷：emulsifiers&detergents，mccutcheon’sdirectories，glenrock，usa，2008(國(guó)際版或北美版)中。
合適的陰離子表面活性劑為磺酸、硫酸、磷酸、羧酸的堿金屬、堿土金屬或銨鹽及其混合物。磺酸鹽的實(shí)例為烷基芳基磺酸鹽、二苯基磺酸鹽、α-烯烴磺酸鹽、木素磺酸鹽、脂肪酸和油的磺酸鹽、乙氧基化烷基酚的磺酸鹽、烷氧基化芳基酚的磺酸鹽、縮合萘的磺酸鹽、十二烷基-和十三烷基苯的磺酸鹽、萘和烷基萘的磺酸鹽、磺基琥珀酸鹽或磺基琥珀酰胺酸鹽。硫酸鹽的實(shí)例為脂肪酸和油的硫酸鹽、乙氧基化烷基酚的硫酸鹽、醇的硫酸酯鹽、乙氧基化醇的硫酸酯鹽或脂肪酸酯的硫酸鹽。磷酸鹽的實(shí)例是磷酸酯鹽。羧酸鹽的實(shí)例是烷基羧酸鹽以及羧化醇或烷基酚乙氧基化物。
懸浮液優(yōu)選包含陰離子表面活性劑。優(yōu)選的陰離子表面活性劑為磺酸鹽，其中更優(yōu)選縮合萘的磺酸鹽。懸浮液可包含0.1-12重量％，優(yōu)選0.5-7重量％，尤其是1-4重量％的陰離子表面活性劑(例如磺酸鹽)。
合適的非離子表面活性劑為烷氧基化物，n-取代的脂肪酸酰胺，胺氧化物，酯，糖基表面活性劑，聚合物表面活性劑及其混合物。烷氧基化物的實(shí)例為諸如已經(jīng)被1-50當(dāng)量烷氧基化的醇、烷基酚、胺、酰胺、芳基酚、脂肪酸或脂肪酸酯的化合物。可將氧化乙烯和/或氧化丙烯用于烷氧基化，優(yōu)選氧化乙烯。n-取代的脂肪酸酰胺的實(shí)例是脂肪酸葡糖酰胺或脂肪酸鏈烷醇酰胺。酯的實(shí)例為脂肪酸酯，甘油酯或甘油單酯。糖基表面活性劑的實(shí)例為脫水山梨醇、乙氧基化脫水山梨醇、蔗糖和葡萄糖酯或烷基聚葡糖苷。聚合物表面活性劑的實(shí)例為乙烯基吡咯烷酮、乙烯醇或乙酸乙烯酯的均聚物或共聚物。
合適的陽(yáng)離子表面活性劑為季型表面活性劑，例如具有1或2個(gè)疏水性基團(tuán)的季銨化合物，或長(zhǎng)鏈伯胺的鹽。合適的兩性表面活性劑為烷基甜菜堿和咪唑啉類。合適的嵌段聚合物為包含聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的嵌段的a-b或a-b-a型嵌段聚合物，或包含鏈烷醇、聚氧化乙烯和聚氧化丙烯的a-b-c型嵌段聚合物。
合適的助劑是它們自身具有可忽略的或甚至沒有農(nóng)藥活性，并且改進(jìn)了化合物i在目標(biāo)上的生物學(xué)性能的化合物。實(shí)例是表面活性劑、礦物油或植物油以及其他輔助劑。另外的實(shí)例列于knowles，adjuvantsandadditives，agrowreportsds256，t&finformauk，2006，第5章。
合適的增稠劑為多糖(例如黃原膠、羧甲基纖維素)、無機(jī)粘土(有機(jī)改性或未改性的)、聚羧酸鹽和硅酸鹽。
合適的殺菌劑為拌棉醇(bronopol)和異噻唑啉酮衍生物如烷基異噻唑啉酮和苯并異噻唑啉酮。
合適的防凍劑為乙二醇、丙二醇、尿素和甘油。
合適的消泡劑為聚硅氧烷、長(zhǎng)鏈醇和脂肪酸鹽。
合適的著色劑(例如著紅色、藍(lán)色或綠色)為低水溶性顏料和水溶性染料。實(shí)例為無機(jī)著色劑(例如氧化鐵、氧化鈦、六氰合鐵酸鐵)和有機(jī)著色劑(例如茜素著色劑、偶氮著色劑和酞菁著色劑)。
合適的增粘劑或粘合劑為聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚丙烯酸酯、生物蠟或合成蠟以及纖維素醚。
該農(nóng)化組合物可用于處理植物繁殖材料，尤其是種子。所述組合物在稀釋2-10倍后在即用制劑中給出0.01-60重量％，優(yōu)選0.1-40重量％的活性物質(zhì)濃度。施用可在播種之前或期間進(jìn)行。農(nóng)化組合物在植物繁殖材料，尤其是種子上的施用或處理方法包括繁殖材料的拌種、包衣、造粒、撒粉、浸泡和犁溝內(nèi)施用方法。優(yōu)選通過不誘發(fā)萌發(fā)的方法，例如通過拌種、造粒、包衣和撒粉將農(nóng)化組合物施用于植物繁殖材料上。
當(dāng)用于植物保護(hù)中時(shí)，活性物質(zhì)的施用量取決于所需的效果類型為0.001-2kg/ha，優(yōu)選為0.005-2kg/ha，更優(yōu)選為0.05-0.9kg/ha，特別為0.1-0.75kg/ha。在植物繁殖材料如種子例如通過撒粉、包衣或浸透種子的處理中，通常要求活性物質(zhì)的量為0.1-1000g/100kg，優(yōu)選為1-1000g/100kg，更優(yōu)選為1-100g/100kg，最優(yōu)選為5-100g/100kg植物繁殖材料(優(yōu)選種子)。當(dāng)用于保護(hù)材料或儲(chǔ)存產(chǎn)品中時(shí)，活性物質(zhì)的施用量取決于施用區(qū)域的類型和所需的效果。在材料保護(hù)中常用的施用量為0.001g-2kg，優(yōu)選為0.005g-1kg活性物質(zhì)/立方米被處理材料。
可向懸浮液中作為預(yù)混物加入或者合適的話在緊臨使用前加入(桶混合)各種類型的油、潤(rùn)濕劑、助劑、肥料或微量營(yíng)養(yǎng)素和其他農(nóng)藥(例如除草劑、殺蟲劑、殺真菌劑、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑、安全劑)。這些試劑可以以1:100-100:1，優(yōu)選1:10-10:1的重量比與本發(fā)明的懸浮液混合。
用戶通常從預(yù)劑量裝置、背包式噴霧器、噴霧罐、噴霧飛機(jī)或灌溉系統(tǒng)施用農(nóng)化組合物或由農(nóng)化組合物制備的桶混物。通常將該農(nóng)化組合物用水、緩沖劑和/或其他助劑配制至所需的施用濃度，由此得到即用噴霧液或農(nóng)化組合物。每公頃農(nóng)業(yè)利用區(qū)通常施用20-2000升，優(yōu)選50-400升即用噴霧液。
此外，本發(fā)明涉及一種防治植物病原性真菌和/或不希望的植物生長(zhǎng)和/或不希望的昆蟲或螨蟲侵襲和/或調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的方法，其中使農(nóng)化組合物作用于相應(yīng)有害物、其環(huán)境或待保護(hù)以防相應(yīng)有害物的作物植物、土壤和/或不希望的植物和/或作物植物和/或其環(huán)境。
合適作物植物的實(shí)例為禾谷類，例如小麥、黑麥、大麥、小黑麥、燕麥或稻；甜菜，例如糖用甜菜或飼用甜菜；仁果、核果和漿果，例如蘋果、梨、李、桃、杏仁、櫻桃、草莓、懸鉤子、醋栗或鵝莓；豆科植物，例如菜豆、扁豆、豌豆、苜蓿或大豆；油料作物，例如油菜籽油菜、芥菜、橄欖、向日葵、椰子、可可豆、蓖麻豆、油棕、花生或大豆；葫蘆科植物，例如南瓜/西葫蘆、黃瓜或甜瓜；纖維作物，例如棉花、亞麻、大麻或黃麻；柑桔類水果，例如橙、檸檬、葡萄柚或橘；蔬菜植物，例如菠菜、萵苣、蘆筍、卷心菜、胡蘿卜、洋蔥、西紅柿、土豆、南瓜/西葫蘆或柿子椒；月桂類植物，例如鱷梨、肉桂或樟腦；能源作物和工業(yè)原料作物，例如玉米、大豆、小麥、油菜籽油菜、甘蔗或油棕；玉米；煙草；堅(jiān)果；咖啡；茶；香蕉；葡萄酒(食用葡萄和釀酒用葡萄)；啤酒花；禾草，例如草坪；甜葉菊(steviarebaudania)；橡膠植物和森林植物，例如花卉、灌木、落葉樹和針葉樹；以及繁殖材料，例如種子以及這些植物的收獲產(chǎn)物。
術(shù)語作物植物還包括已通過育種、誘變或重組方法修飾的那些植物，包括市場(chǎng)銷售或開發(fā)方法中的生物技術(shù)農(nóng)業(yè)產(chǎn)品。基因修飾植物是其遺傳物質(zhì)以無法在自然條件下由雜交、誘變或自然重組(即遺傳物質(zhì)的重組)產(chǎn)生的方式修飾的植物。此處，通常將一個(gè)或多個(gè)基因整合到所述植物的遺傳物質(zhì)中以改善所述植物的性能。這類重組修飾還包括蛋白質(zhì)、寡肽或多肽的翻譯后修飾，例如通過糖基化或粘結(jié)聚合物如異戊二烯化、乙?；蚍鼗瘹埢騪eg殘基。
本發(fā)明還涉及包含農(nóng)化組合物的種子。
本發(fā)明還涉及疏水蛋白在降低固體水不溶性農(nóng)藥的毒性(優(yōu)選吸入毒理學(xué))中的用途和施用方法。
組合物的毒性可以根據(jù)化學(xué)品檢驗(yàn)的oecd指南第403號(hào)和相應(yīng)的指導(dǎo)文件gd39測(cè)試，二者均為針對(duì)急性吸入毒性的評(píng)估。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于農(nóng)化組合物具有降低毒性，尤其是降低的吸入毒性；其他優(yōu)點(diǎn)是減少用于組合物的表面活性劑及其增強(qiáng)的儲(chǔ)存穩(wěn)定性。
下面的實(shí)施例說明本發(fā)明，而不加以任何限制。
實(shí)施例
消泡劑：硅消泡劑。
潤(rùn)濕劑：羥基苯磺酸、甲醛、苯酚和脲的聚合物。
離子表面活性劑a：烷基萘磺酸甲醛縮合物的鈉鹽。
非離子表面活性劑a：三苯乙烯基苯基乙氧基化磷酸酯的三乙胺鹽，ph(5％，水溶液)7.5，沸點(diǎn)大于100℃。
殺菌劑：2-甲基-4-異噻唑啉-3-酮和1,2-苯并異噻唑啉-3-酮的含水混合物。疏水蛋白a：噴霧造粒的yaad-疏水蛋白dewa-his6蛋白質(zhì)。根據(jù)wo2006/131564，實(shí)施例1、2、7和8進(jìn)行無性繁殖、發(fā)酵和純化。
實(shí)施例1：氟唑菌酰胺和百菌清懸浮液濃縮物的制備
通過混合水、助劑a、離子表面活性劑a、潤(rùn)濕劑、農(nóng)藥、疏水蛋白a和消泡劑而制備氟唑菌酰胺和百菌清懸浮液濃縮物。使用珠磨機(jī)將該混合物濕磨至2μm的粒度。
加入并混合丙二醇、殺菌劑、黃原膠和水，得到ph7.5-8.5的均勻懸浮液。組分的最終濃度在表1中給出。
表1
實(shí)施例2：急性吸入毒性評(píng)估
根據(jù)實(shí)施例1制備兩種懸浮液濃縮物，其中在它們中的一個(gè)中省略了疏水蛋白a的混合物。隨后將其根據(jù)以下的化學(xué)品檢驗(yàn)oecd指南第403號(hào)(2009年9月7日采用的版本)和相應(yīng)的指導(dǎo)文件gd39(生效日期：2009年7月21日)測(cè)定急性吸入毒性。根據(jù)指南67/548/ewg(修訂版，2009年1月20日生效)，該研究的結(jié)果得到不含疏水蛋白a的懸浮液濃縮物的分類為t/t+，而疏水蛋白a混合物形式的懸浮液濃縮物分類為xn。
因此，加入疏水蛋白a明顯降低農(nóng)化組合物的毒性。