本發(fā)明涉及一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，具體涉及一種通過(guò)單色光進(jìn)行光培養(yǎng)提高蟬花孢梗束質(zhì)量的人工培養(yǎng)方法。
背景技術(shù)：
：中藥蟬花為蟬棒束孢isariacicadaemiquel(蟬擬青霉paecilomycescicadae(miquel)samson)寄生在蟬若蟲(chóng)上形成的菌蟲(chóng)復(fù)合體，是我國(guó)傳統(tǒng)著名的中藥材之一，其藥用比冬蟲(chóng)夏草早800年。蟬花屬藥食兼用真菌，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和特定的功效。蟬花可產(chǎn)生多種在醫(yī)療和保健上有重要作用的生理活性物質(zhì)，包括核苷類(lèi)、環(huán)肽類(lèi)、多糖類(lèi)、醇類(lèi)、甾醇類(lèi)及有機(jī)酸等，在調(diào)節(jié)免疫、改善腎功能、調(diào)節(jié)脂類(lèi)代謝、抗腫瘤、抗疲勞、鎮(zhèn)痛、催眠、降壓降血糖等方面作用明顯。天然蟬花資源十分有限，再加上野生蟬花因?yàn)楫a(chǎn)地不同、采收時(shí)間不一、易被雜菌污染霉變及含重金屬等問(wèn)題，其品質(zhì)受到質(zhì)疑。人工培育的蟬花不含重金屬，無(wú)污染，以及營(yíng)養(yǎng)成分穩(wěn)定，因此，越來(lái)越受到人們的重視。目前，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了蟬花的工廠化栽培。人工培育蟬花，是將蟬棒束孢經(jīng)過(guò)斜面種子、搖瓶培養(yǎng)和液體深層發(fā)酵獲得的液體種子接種到固體基質(zhì)上先進(jìn)行暗培養(yǎng)，之后見(jiàn)光培養(yǎng)，最終得到分叉多枝的孢梗束，經(jīng)采收干燥即可作食藥用原料。原料的外觀性狀及活性成分含量對(duì)于消費(fèi)者的感官和品質(zhì)認(rèn)同至關(guān)重要，而不同的光質(zhì)對(duì)于孢梗束顏色和有效活性成分的含量有顯著影響。目前，人工培養(yǎng)蟬花在光培養(yǎng)階段所使用的光源多為白色復(fù)合光，不利于孢梗束外觀性狀和質(zhì)量的控制。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法通過(guò)單色光進(jìn)行光培養(yǎng)，提高蟬花孢梗束的外觀和內(nèi)在質(zhì)量。本發(fā)明的目的是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：一種蟬花的人工培養(yǎng)方法，該方法包括如下步驟：步驟1，將蟬花菌種進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；步驟2，將步驟1擴(kuò)大培養(yǎng)得到的菌種進(jìn)行固體培養(yǎng)；步驟3，對(duì)孢梗束進(jìn)行采收；其中，步驟2固體培養(yǎng)包括暗培養(yǎng)和光培養(yǎng)階段，所述光培養(yǎng)階段采用綠光進(jìn)行照射。進(jìn)一步，所述光照強(qiáng)度為50-200lx；更進(jìn)一步，光照強(qiáng)度為100-200lx。進(jìn)一步，步驟1所述擴(kuò)大培養(yǎng)包括斜面培養(yǎng)和液體培養(yǎng)；更進(jìn)一步，所述液體培養(yǎng)包括搖瓶培養(yǎng)、種子罐培養(yǎng)和發(fā)酵罐培養(yǎng)中的任意一種或幾種。進(jìn)一步，步驟1擴(kuò)大培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為20～25℃。進(jìn)一步，步驟2固體培養(yǎng)的接種量為5％～15％；更進(jìn)一步，接種量為7％～12％。進(jìn)一步，步驟2固體培養(yǎng)過(guò)程分為光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)，暗培養(yǎng)階段培養(yǎng)溫度20-24℃，相對(duì)濕度為70-85％；光培養(yǎng)階段培養(yǎng)溫度為20-22℃，相對(duì)濕度為70-85％。進(jìn)一步，步驟3對(duì)孢梗束進(jìn)行采收后還包括步驟4對(duì)孢梗束進(jìn)行干燥；更進(jìn)一步，所述干燥方法為先將孢梗束濕度降至35～45％，再進(jìn)行干燥；更進(jìn)一步，干燥溫度低于60℃。本發(fā)明所述綠光為波長(zhǎng)為577-492nm的光。本發(fā)明斜面培養(yǎng)、液體培養(yǎng)和固體培養(yǎng)所采用的培養(yǎng)基均為本領(lǐng)域常規(guī)培養(yǎng)基；所用液體培養(yǎng)基可以是馬鈴薯-蔗糖-瓊脂培養(yǎng)基(psa)、馬鈴薯-葡萄糖-瓊脂培養(yǎng)基(pda)、馬鈴薯-葡萄糖-水培養(yǎng)基(psb)、酵母浸出粉-復(fù)合氨基酸-蔗糖培養(yǎng)基(saay)、酵母浸出粉-白砂糖-大豆水解蛋白培養(yǎng)基，麩皮煮汁-白砂糖培養(yǎng)基中的任意一種或幾種。所述固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基可以是谷物培養(yǎng)基、農(nóng)作物秸桿培養(yǎng)基、農(nóng)作物皮殼培養(yǎng) 基、經(jīng)濟(jì)林木樹(shù)枝培養(yǎng)基等。所述谷物培養(yǎng)基選自以小麥、玉米、大米、小米、黃豆粉、蕎麥、大麥、燕麥、糙米、粳米中的任意一種或幾種為主要原料的培養(yǎng)基；所述農(nóng)作物秸稈培養(yǎng)基選自以麥稈、玉米桿、棉桿、豆桿、芝麻桿中的任意一種或幾種為主要原料的培養(yǎng)基；所述農(nóng)作物皮殼培養(yǎng)基選自以麩皮、大豆皮、棉籽殼中的任意一種或幾種為主要原料的培養(yǎng)基。更進(jìn)一步，所述固體培養(yǎng)基優(yōu)選谷物培養(yǎng)基。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明在蟬花光培養(yǎng)階段采用綠光(單色光)進(jìn)行照射，相對(duì)于復(fù)合光而言能顯著提高孢梗束產(chǎn)量；且并不影響有效成分含量。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例1～2所用蟬花菌種保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)cgmcc3453(該菌種已在申請(qǐng)?zhí)枮?01110120603.1的發(fā)明專(zhuān)利中公開(kāi)，為已知菌種)。實(shí)施例3所用菌種為自制菌種，制備過(guò)程見(jiàn)實(shí)施例12；本發(fā)明研究表明蟬花菌種類(lèi)型并不構(gòu)成影響本發(fā)明效果的因素，本發(fā)明方法對(duì)不同蟬花菌種均能夠?qū)崿F(xiàn)效果。實(shí)施例1蟬花菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)斜面培養(yǎng)：將蟬花菌種接種于斜面試管中，再將接種菌種的斜面試管放入22℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)時(shí)間為7天，待菌絲長(zhǎng)滿(mǎn)試管；搖瓶培養(yǎng)：在500m1三角瓶中裝入200m1液體培養(yǎng)基，在0.11mpa壓力下高壓滅菌30分鐘，待冷卻至室溫，將1支斜面試管的菌種接種到500m1三角瓶培養(yǎng)基上，并置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱，溫度22±1℃，150轉(zhuǎn)/分鐘條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為3天；種子罐培養(yǎng)：在50l氣升式發(fā)酵罐中裝入20l液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)基溫度大于95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養(yǎng)基重量的0.03％,在0.11mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，并保壓30-45分鐘；滅菌后，冷卻至20℃時(shí)，將4瓶上述培養(yǎng)好的500m1搖瓶菌種接入培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5v/vmin，保壓4.903-7.0845×104pa，經(jīng)3天通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后即可，終培養(yǎng)體積為20l；發(fā)酵罐培養(yǎng)：在500l氣升式發(fā)酵罐中裝入200l液體培養(yǎng)基，培養(yǎng) 基溫度大于95℃，加入食用消泡劑，加入量為培養(yǎng)基重量的0.03％,在0.11mpa壓力下，通入蒸汽加熱到121℃，并保壓30-45分鐘；滅菌后，冷卻至20℃時(shí)，將上述培養(yǎng)好的200l種子罐種子全部接入培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為22±1℃，通氣量為1：0.5v/vmin，保壓4.903-7.0845×104pa，經(jīng)3天通氣培養(yǎng)，達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后即可。終培養(yǎng)體積為200l。斜面試管培養(yǎng)基：200g土豆煮汁，20g蔗糖，20g瓊脂，余補(bǔ)水至1000ml，ph值為6.5；搖瓶、種子罐及發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基：10g酵母浸出粉，5g復(fù)合氨基酸，35g白砂糖，余量補(bǔ)水至1000ml，ph值為6.5。實(shí)施例2蟬花菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程和培養(yǎng)條件基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于：斜面試管培養(yǎng)基為：10g酵母浸出粉，40g葡萄糖，10g蛋白胨，20g瓊脂，余量補(bǔ)水至1000ml，ph值6.0；搖瓶、種子罐及發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基：40g麩皮煮汁，30g白砂糖，余補(bǔ)水至1000毫升，ph值為6.5。實(shí)施例3蟬花菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程和培養(yǎng)條件基本同實(shí)施例1，區(qū)別在于：斜面試管培養(yǎng)基為：40g麥芽糖，10g蛋白胨，20g瓊脂，余量補(bǔ)水至1000ml；搖瓶、種子罐及發(fā)酵罐中的液體培養(yǎng)基：30g酵母浸出粉，30g白砂糖，5g大豆水解蛋白，余量補(bǔ)水至1000毫升，ph值為6.5。實(shí)施例4蟬花菌種的固體培養(yǎng)固體培養(yǎng)基的制備：將小麥清洗控水后，加入適量的水，其重量比為小麥：水為1：1.4，混合均勻；拌勻后裝入培養(yǎng)容器中，培養(yǎng)基厚度控制在4cm。將裝好培養(yǎng)基的培養(yǎng)容器放置滅菌鍋內(nèi)，121℃下滅菌30-50min；滅菌后，培養(yǎng)容器移置緩沖室內(nèi)，自然冷卻至24℃以下移置接種室內(nèi)。接種：接種前培養(yǎng)容器先在超凈工作臺(tái)或百級(jí)層流罩內(nèi)(下)用紫外光照射0.5h；每個(gè)培養(yǎng)容器按10％的接種量接種實(shí)施例1～3任一得到的 菌種，接種后的容器放入培養(yǎng)室培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：暗培養(yǎng)階段培養(yǎng)溫度為22-24℃，空氣相對(duì)濕度70-85％；待菌絲體長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)基時(shí)轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)，光源采用綠色單色光，光照強(qiáng)度100lx，培養(yǎng)室溫度為20-22℃，相對(duì)空氣濕度70％～85％。培養(yǎng)室要適時(shí)通風(fēng)換氣，保持發(fā)菌室空氣新鮮；至孢梗束成熟，尚未大量產(chǎn)生孢子(約23～26天)。實(shí)施例5蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程基本同實(shí)施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為大米和水按1:1.3的比例混合而成；光照強(qiáng)度50lx。實(shí)施例6蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程基本同實(shí)施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為小米和水按1:1.3的比例混合而成；光照強(qiáng)度200lx。實(shí)施例7蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程基本同實(shí)施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為大麥和水按1:1.3的比例混合而成。實(shí)施例8蟬花菌種的固體培養(yǎng)培養(yǎng)過(guò)程基本同實(shí)施例4，區(qū)別在于固體培養(yǎng)基為糙米和水按1:1.5的比例混合而成；光照強(qiáng)度200lx。實(shí)施例9采收及干燥對(duì)實(shí)施例4～8任一培養(yǎng)的孢梗束進(jìn)行采收；采收后的孢梗束在相對(duì)濕度40％的除濕間除濕40h-50h，進(jìn)入烘干室準(zhǔn)備烘干。烘箱設(shè)置溫度60℃，干燥時(shí)間8h-10h。實(shí)施例10采收及干燥對(duì)實(shí)施例4～8任一培養(yǎng)的孢梗束進(jìn)行采收；采收后的孢梗束在相對(duì)濕度45％的除濕間除濕40h-50h，進(jìn)入烘干室準(zhǔn)備烘干。烘箱設(shè)置溫度55℃，干燥時(shí)間8h-10h。實(shí)施例11采收及干燥對(duì)實(shí)施例4～8任一培養(yǎng)的孢梗束進(jìn)行采收；采收后的孢梗束在相對(duì)濕度30％的除濕間除濕40h-50h，進(jìn)入烘干室準(zhǔn)備烘干。烘箱設(shè)置溫度 60℃，干燥時(shí)間8h-10h。實(shí)施例12在我國(guó)長(zhǎng)江以南的亞熱帶和熱帶地區(qū)低洼地帶，7月，按照一般中藥材的方法采集。在超鏡工作臺(tái)上，在無(wú)菌條件下，將采來(lái)的新鮮蟲(chóng)草用無(wú)菌水沖洗干凈，置于已滅菌的直徑為15cm的培養(yǎng)皿中，蟲(chóng)草的內(nèi)菌核部分(蟲(chóng)體)用打濕的脫脂棉包裹，以保濕。蟲(chóng)草的子實(shí)體下方放置一滅菌的載玻片，蟲(chóng)草菌核部分用小玻片墊起，以使可孕部分不要直接接觸載玻片，其距離約0.5cm左右。然后將培養(yǎng)皿放置于20℃±0.5℃的光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待蟬花孢子彈射于載玻片上時(shí)，在孢子周?chē)渭觿側(cè)芑膒da培養(yǎng)基少許，移出玻片，置于另一滅菌的培養(yǎng)皿中保濕培養(yǎng)，待長(zhǎng)出菌絲后用接種針挑取少量菌絲轉(zhuǎn)另一平皿(sday培養(yǎng)基)培養(yǎng)(同上)，直至長(zhǎng)出單一的純化的菌落為止。并經(jīng)形態(tài)學(xué)或分子生物學(xué)方法驗(yàn)證，該菌株為蟬花蟲(chóng)草(isariacicadaemiquel)無(wú)性型。光質(zhì)對(duì)孢梗束質(zhì)量的影響取擴(kuò)大培養(yǎng)得到的液體種子，分別按實(shí)施例4～8進(jìn)行固體培養(yǎng)，按照實(shí)施例9的采收及干燥方法對(duì)孢梗束進(jìn)行采收及干燥。1.光質(zhì)對(duì)產(chǎn)量的影響計(jì)算實(shí)施例4～8每800g固體培養(yǎng)基(干重)孢梗束產(chǎn)量，結(jié)果見(jiàn)表1。表1光質(zhì)對(duì)產(chǎn)量的影響結(jié)果(n＝3)結(jié)果表明，采用綠光進(jìn)行光培養(yǎng)，單位固體培養(yǎng)基的孢梗束產(chǎn)量顯著提高。此外，采用綠光進(jìn)行培養(yǎng)還能顯著降低產(chǎn)孢量，本發(fā)明研究表明采用白色復(fù)合光進(jìn)行培養(yǎng)其產(chǎn)孢量在0.8～0.9g/800g固體培養(yǎng)基，而采用綠光進(jìn)行培養(yǎng)，產(chǎn)孢量在0.02～0.03g/800g固體培養(yǎng)基，相對(duì)于白色復(fù)合光而言產(chǎn)孢量顯著降低。產(chǎn)孢量降低不就使產(chǎn)品外觀顏色好，質(zhì)量?jī)?yōu)，產(chǎn) 量穩(wěn)定可控，且能明顯減少生產(chǎn)培養(yǎng)過(guò)程中粉塵擴(kuò)散帶來(lái)的麻煩。2.光質(zhì)對(duì)有效成分含量的影響取實(shí)施例1擴(kuò)大培養(yǎng)的菌種，分別按實(shí)施例4～8進(jìn)行固體培養(yǎng)，測(cè)定其有效成分腺苷、hea、多糖的含量。2.1檢測(cè)方法2.1.1腺苷和n6-(2-羥乙基)腺苷(hea)的測(cè)定采用高效液相色譜法：色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：色譜柱：symmetryc18(waters，4.6mm×250mm，5μm，l.n.0264313291)；流動(dòng)相：乙腈-0.04mol/l磷酸二氫鉀(5:95)；流速：1.0ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μl。理論塔板數(shù)按腺苷峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。對(duì)照品溶液的制備：取腺苷及hea對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50％甲醇水溶液制成25μg/ml的溶液，即得。供試品溶液的制備：取0.2g蟬花子實(shí)體粉末，精密稱(chēng)定，置20ml具塞試管，精密加入5ml蒸餾水，超聲(40khz)處理30分鐘，取出，立即精密加入5ml甲醇，混勻，過(guò)0.22μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。測(cè)定：分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，進(jìn)樣時(shí)間為20min，測(cè)定，在此波長(zhǎng)下記錄對(duì)照品及供試品對(duì)應(yīng)的峰面積，根據(jù)濃度換算結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，即得。2.1.2甘露醇的測(cè)定采用紫外-可見(jiàn)分光光度法：樣品提取液的制備：精密稱(chēng)取0.1g蟬花子實(shí)體粉末，加入100ml70％乙醇水溶液，85-90℃水浴回流提取，溶液沸騰5min后，取出，過(guò)濾，取濾液，待濾液冷卻至室溫，用70％乙醇水溶液定容至100ml，搖勻，即為待測(cè)樣品溶液。樣品甘露醇含量測(cè)定：精密移取樣品提取液1ml，置15ml具塞試管中，精密加入1ml高碘酸鉀溶液，混勻，室溫放置10min，再加0.1％l-鼠李糖溶液2ml以除去過(guò)多的高碘酸鹽，振蕩混勻，最后加4ml新鮮配制的nash試劑，53℃水浴加熱15min使其顯色，快速冷卻至室溫。照紫外-可見(jiàn)分光光度法(中華人民共和國(guó)藥典一部附錄va)，在412nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出樣品甘露醇濃度(mg/ml)，再 根據(jù)公式計(jì)算樣品甘露醇含量(mg/g)。計(jì)算公式：2.1.3多糖的測(cè)定按照《保健食品功效成分檢測(cè)方法》(白鴻主編)的方法。結(jié)果見(jiàn)表2。表2光質(zhì)對(duì)有效成分含量的影響(n＝3)實(shí)施例腺苷(％)hea(％)甘露醇(mg/g)多糖(mg/g)實(shí)施例40.11±0.010.14±0.0182.99±4.2051.18±2.49實(shí)施例50.10±0.010.14±0.0181.24±4.1151.32±2.80實(shí)施例60.10±0.010.14±0.0181.01±3.9550.95±2.61實(shí)施例70.11±0.010.14±0.0181.17±4.0150.83±2.45實(shí)施例80.10±0.010.14±0.0180.85±3.9750.27±2.32白光0.10±0.010.17±0.0180.44±4.0054.64±2.76結(jié)果表明，采用綠光進(jìn)行光培養(yǎng)(實(shí)施例4～8)，其孢梗束有效成分含量與白光相比無(wú)顯著變化，表明采用單色光照射不影響產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量。當(dāng)前第1頁(yè)12