高油酸花生分子標(biāo)記及其輔助選擇回交育種方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高油酸分子標(biāo)記和利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇的回交育種方法及其應(yīng)用。分子標(biāo)記的變異特異引物序列為：正向引物MITE-INS-F和反向引物MITE-INS-R；其無變異特異引物序列為：正向引物WILD-F和反向引物WILD-R。利用分子標(biāo)記進(jìn)行回交育種包括將基因型AABB的花生親本，與基因型aabb親本雜交，然后回交；利用基因組中的一對引物擴增FAD2A基因片段，選擇含Aa基因型的單株；利用花生ahFAD2B位點的引物作為標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測，選擇含Bb基因型的單株；將兩個標(biāo)記均顯性即含AaBb基因型的單株與親本AABB回交，直至從后代中選出基因型為aabb,其它農(nóng)藝性狀與輪回親本一致的高油酸單株，然后自交和擴大繁殖。本發(fā)明分子標(biāo)記，方法簡單，成本低，結(jié)果穩(wěn)定；該分子標(biāo)記進(jìn)行回交育種，可顯著提高性狀選擇的準(zhǔn)確性，降低育種成本，提高育種效率。
【專利說明】高油酸花生分子標(biāo)記及其輔助選擇回交育種方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種高油酸分子標(biāo)記和利用該標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇的回交育種方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]栽培花生ClracAi1S Apogaea ),又名落花生,蝶形花科,屬一年生草本植物?；ㄉa(chǎn)南美，其種植地區(qū)主要分布在亞洲、非洲和美洲，其中亞洲約占60%，非洲約占30%，美洲約占5.5%。我國是世界第一花生生產(chǎn)、消費和出口大國，花生在各省、市、自治區(qū)均有種植?；ㄉ鳛橹匾挠土献魑铮渥蚜Ｖ舅峤M成對花生的營養(yǎng)品質(zhì)和貯藏品質(zhì)均有很大影響。花生油中的油酸和亞油酸占總脂肪酸的80%左右。油酸是一種單不飽和脂肪酸，能降低身體低密度脂蛋白(LDL)水平，維持高密度脂蛋白(HDL)的水平；油酸比亞油酸等多不飽和脂肪酸的穩(wěn)定性高，高油酸的食用油更耐貯藏，而且高溫烹調(diào)不易氧化變質(zhì)。因此，高油酸花生不僅有益于人們的身體健康，也可有效延長花生制品的保質(zhì)期和貨架期。
[0003]選育高油酸花生新品種是花生育種的重要目標(biāo)之一。目前我國大面積推廣的花生品種油酸含量不高，大多數(shù)花生種質(zhì)資源的籽仁油酸含量在37%-55%之間，70%以上高油酸含量的花生資源幾乎沒有。
[0004]自從美國Norden (1987)篩選出油酸含量高達(dá)80%的高油酸花生自然突變體F435后，圍繞花生油酸、亞油酸含量的分子基礎(chǔ)及遺傳規(guī)律研究取得了較大進(jìn)展。已知FAD2 (Λ 12脂肪酸脫氫酶)是脂肪酸生物合成途徑中催化油酸在第12碳位脫氫，形成雙鍵向亞油酸轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵酶。花生基因組中存在兩個ahFAD2等位基因，即ahFAD2A和ahFAD2B,分別來自A和B基因組。高油酸是ahFAD2A基因在448 bp處發(fā)生G-A堿基替換，同時ahFAD2B基因突變的結(jié)果。高油酸花生自然突變體F435是在442bp處發(fā)生一個A插入；高油酸花生誘發(fā)突變體M2-225和C458分別是在ahFAD2B基因起始密碼子后997 bp和665bp處存在MITE插入，導(dǎo)致基因功能喪失(Patel et al, 2004)。
[0005]為利用高油酸突變體作為雜交親本進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種(MAS)，Barkley等(2010)開發(fā)了 F435突變位點的實時定量PCR方法進(jìn)行高油酸基因分型；Chen等(2010)開發(fā)了 F435突變位點特異的普通PCR方法；Chu等(2011)利用CAPS方法進(jìn)行了分子標(biāo)記輔助選擇的高油酸花生品種選育，但這些方法均有相應(yīng)的不足，具有熒光標(biāo)記成本高、結(jié)果不穩(wěn)定和方法繁瑣、酶成本高等缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問題:針對現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種高油酸花生分子標(biāo)記；該標(biāo)記引物具有標(biāo)記方法簡單、成本低和結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點；
還提供了利用該分子標(biāo)記進(jìn)行高油酸花生的回交育種方法，該育種方法可顯著提高性狀選擇的準(zhǔn)確性，降低育種成本，提高育種效率。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一種高油酸花生分子標(biāo)記，在花生ahFAD2B位點的變異特異引物序列分別為:
正向引物 MITE-1NS-F:GGATGATGGATTGTATGG,
反向引物 MITE-1NS-R:CTCTGACTATGCATCAG ；
條電ahFAD2B位點無變異特異引物序列分別為:
正向引物 WILD-F 為:CAGAACCATTAGCTTTG，
反向引物 WILD-R 為:CTGAGACATAAATTAGAAGCC。
[0008]利用所述的分子標(biāo)記進(jìn)行高油酸花生的回交育種方法，包括以下步驟:
(1)將基因型AABB的普通油酸含量的花生親本，與基因型aabb的高油酸含量的花生親本雜交，得到后代F1;
(2)選擇后代F1做父本，與基因型AABB的花生親本回交，得到后代BC1F1；
(3)提取后代BC1F1單株的DNA，利用花生基因組中的一對引物擴增FAD2A基因片段，其中正向引物 aF19 為:GATTACTGATTATTGACTT，反向引物 R3 為:CCCTGGTGGATTGTTCA，
擴增后測序，選擇含Aa基因型的單株；
然后利用所述花生位點的變異特異引物和無變異特異引物作為標(biāo)記分別對(Aa)基因型的單株進(jìn)行PCR檢測選擇Bb基因型的單株；將兩個標(biāo)記均顯性即含AaBb基因型的BC1F1單株繼續(xù)與親本AABB回交，得到后代BC2F1 ；
(4)提取后代BC2F1單株的DNA，按照步驟(3)的方法進(jìn)行引物擴增和PCR檢測，將兩個標(biāo)記均顯性即AaBb基因型的BC2F1單株繼續(xù)與優(yōu)良親本AABB回交，得到后代BC3F1 ；
(5)提取后代BC3F1單株的DNA，將兩個標(biāo)記均顯性即含AaBb基因型的BC3F1植株進(jìn)行自交，按照步驟(3)的方法進(jìn)行引物擴增和PCR檢測，從后代中選擇基因型為aabb的高油酸含量的單株，即得到所述的高油酸花生品種。
[0009]所述普通油酸含量花生親本的油酸含量〈55%，高油酸含量的花生親本油酸含量>70%。
[0010]其中利用FAD2A引物的擴增步驟為:
(1)PCR反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系總體積為50μ L，包括10 Xbuffer 5 μ L、2 mmol I/1dNTPs 5 μ L.25 mmol I/1 MgSO4 3 μ LUO μ mo I I/1的正向引物和反向引物引物各1.5μ L、模板 DNA 200 ng、La Taq 酶 I U ;
(2)PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5 min;94°C變性 30 s，50.9°C退火 30 s，72°C延伸 45s，30次循環(huán)；最后72°C延伸10 min。
[0011]所述利用花生36/?/--?位點的變異特異引物和無變異特異引物進(jìn)行PCR檢測的方法為:
先利用正向引物MITE-1NS-F和反向引物MITE-1NS-R進(jìn)行PCR，檢測有無MITE插入；然后利用正向引物WILD-F和反向引物WILD-R進(jìn)行PCR，檢測是否有MITE插入純合體；具體步驟為:
(1)PCR反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系總體積為10 μ L,含IOXbuffer I μ L、2 mmol I/1dNTPs I μ LUO μ mo I I/1正向引物和反向引物各0.5 μ L、模板DNA 200 ng、Taq酶0.1U；
(2)PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5 min;94°C變性 30 s，55.7°C或 55.2°C退火 30 s，72°C延伸45 S，30次循環(huán)；最后72°C延伸10 min ；(3)電泳檢測:將兩對FAD2B引物的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；
(4)凝膠經(jīng)染色后在凝膠掃描儀中檢測擴增條帶；根據(jù)兩次電泳的帶型得到樣本相應(yīng)的基因型。
[0012]所述的高油酸花生分子標(biāo)記在回交育種中的應(yīng)用。
[0013]本發(fā)明的積極有益效果:
1、本發(fā)明提供一種高油酸花生分子標(biāo)記在花生ahFAD2B位點的變異特異引物和無變異特異引物；利用該分子標(biāo)記進(jìn)行基因分型及油酸含量驗證表明，無論在AA背景下還是在aa背景下，B基因組的基因型從BB、Bb到bb油酸含量均呈逐漸升高趨勢，表明PCR分型結(jié)果與基因型對應(yīng)的油酸含量變化一致，可以作為油酸性狀選擇的輔助標(biāo)記。
[0014]2、本發(fā)明針對的MITE插入突變位點的普通PCR分子標(biāo)記，方法簡單，成本低，結(jié)果穩(wěn)定；與定量PCR方法、酶切方法比較，操作簡單；不用熒光染料及限制性內(nèi)切酶，檢測成本低；通過兩個雜交群體后代的驗證結(jié)果，普通PCR條件可重復(fù)試驗，結(jié)果穩(wěn)定。
[0015]3、利用本發(fā)明的分子標(biāo)記進(jìn)行回交育種，為輔助選擇高油酸花生育種提供了新的技術(shù)手段，可顯著提高性狀選擇的準(zhǔn)確性，降低育種成本，提高育種效率。
[0016]由于油酸含量的化學(xué)測定需要破壞籽粒，并且需要一定的樣品量，所以傳統(tǒng)高油酸育種需要等到育種高世代，性狀基本穩(wěn)定并且種子量較多時，才進(jìn)行高油酸性狀的選擇。油酸含量的化學(xué)測定成本較高，高世代檢測也增加了育種成本，降低育種效率；而本發(fā)明在分離世代的早代即可當(dāng)代檢測確定高油酸基因型，基因型選擇準(zhǔn)確率高，不需化學(xué)測定，成本低；結(jié)合回交育種，四個 世代即可得到穩(wěn)定的高油酸優(yōu)良品種，能顯著提高育種效率。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1利用MITE-1NS弓丨物進(jìn)行ahFAD2B位點變異檢測的擴增帶型圖；
圖2利用WILD引物進(jìn)行36/?/--?野生型位點檢測的擴增帶型圖；
圖3利用分子標(biāo)記進(jìn)行高油酸花生回交育種的路線圖。
【具體實施方式】
[0018]實施例一、高油酸花生分子標(biāo)記 (一)分子標(biāo)記的引物序列及其帶型
1.4/?/--位點變異特異引物(檢測MITE插入)
在花生FAD2突變型基因MITE插入序列的63 bp處設(shè)計正向引物MITE-1NS-F，在MITE插入的下游472 bp處設(shè)計反向引物MITE-1NS-R，以檢測MITE插入；如果存在位點變異，將擴增出613 bp的預(yù)期條帶；如果沒有位點變異，將擴增不出任何條帶，得到的引物如下:
正向引物 MITE-1NS-F: 5 ’......GGATGATGGATTGTATGG.......3’
反向引物 MITE-1NS-R: 5，.....CTCTGACTATGCATCAG ……3，。
[0019]2.位點無變異特異引物(檢測野生型無MITE插入)
在花生FAD2野生型基因-80 bp處設(shè)計正向引物WILD-F，654 bp處設(shè)計反向引物WILD-R，如果存在位點變異，將擴增不出任何條帶；如果不存在位點變異，將擴增出754 bp的預(yù)期條帶，得到的引物如下:
正向引物 WILD-F:5，.....CAGAACCATTAGCTTTG......3，反向引物 WILD-R:5，…..CTGAGACATAAATTAGAAGCC......3’。
[0020]MITE是指微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件，其組織結(jié)構(gòu)類似DNA轉(zhuǎn)座子，兩端含有反向重復(fù)序列。
[0021]3.不同基因型的分子標(biāo)記帶型，參見表1。
[0022]表1基因型與帶型對照表
【權(quán)利要求】
1.一種高油酸花生分子標(biāo)記，其特征在于，所述分子標(biāo)記在花生位點的變異特異引物序列分別為: 正向引物 MITE-1NS-F:GGATGATGGATTGTATGG, 反向引物 MITE-1NS-R:CTCTGACTATGCATCAG ； 條電ahFAD2B位點無變異特異引物序列分別為: 正向引物 WILD-F 為:CAGAACCATTAGCTTTG， 反向引物 WILD-R 為:CTGAGACATAAATTAGAAGCC。
2.利用權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記進(jìn)行高油酸花生的回交育種方法，其特征在于，該方法包括以下步驟: (1)將基因型AABB的普通油酸含量的花生親本，與基因型aabb的高油酸含量的花生親本雜交，得到后代F1; (2)以后代F1做父本，與基因型AABB的花生親本回交，得到后代BC1F1； (3)提取后代BC1F1單株的DNA，利用花生基因組中的一對引物擴增FAD2A基因片段，其中正向引物 aF19 為:GATTACTGATTATTGACTT，反向引物 R3 為:CCCTGGTGGATTGTTCA， 擴增后測序，選擇含Aa基因型的單株； 然后利用所述花生位點的變異特異引物和無變異特異引物作為標(biāo)記分別對含Aa基因型的單株進(jìn)行PCR檢測，選擇Bb基因型的單株；將兩個標(biāo)記均顯性即含AaBb基因型的BC1F1單株繼續(xù)與親本AABB回交，得到后代BC2F1 ； (4)提取后代BC2F1單株的DNA，按照步驟(3)的方法進(jìn)行引物擴增和PCR檢測，將兩個標(biāo)記均顯性即AaBb基因型的BC2F1單株繼續(xù)與優(yōu)良親本AABB回交，得到后代BC3F1 ； (5)提取后代BC3F1單株的DNA，將兩個標(biāo)記均顯性即含AaBb基因型的BC3F1植株進(jìn)行自交，按照步驟(3)的方法進(jìn)行引物擴增和PCR檢測，從后代中選擇基因型為aabb的高油酸含量的單株，即得到所述的高油酸花生品種。
3.如權(quán)利要求2所述的回交育種方法，其特征在于:所述普通油酸含量花生親本的油酸含量〈55%，高油酸含量的花生親本油酸含量>70%。
4.如權(quán)利要求2所述的回交育種方法，其特征在于:其中利用FAD2A引物的擴增步驟為: (1)PCR反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系總體積為50μ L，包括IOXbuffer 5 μ L、2 mmol I/1dNTPs 5 μ L.25 mmol I/1 MgSO4 3 μ LUO μ mo I I/1的正向引物和反向引物引物各1.5μ L、模板 DNA 200 ng、La Taq 酶 I U ; (2)PCR 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5 min;94°C變性 30 s，50.9°C退火 30 s，72°C延伸 45s，30次循環(huán)；最后72°C延伸10 min。
5.如權(quán)利要求2-4任一項所述的回交育種方法,其特征在于:所述利用花生36/?/--?位點的變異特異引物和無變異特異引物進(jìn)行PCR檢測的方法為: 先利用正向引物MITE-1NS-F和反向引物MITE-1NS-R進(jìn)行PCR，檢測有無MITE插入；然后利用正向引物WILD-F和反向引物WILD-R進(jìn)行PCR，檢測是否有MITE插入純合體； 具體步驟為: (I)PCR反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)體系總體積為10 μ L,含IOXbuffer I μ L、2 mmol I/1dNTPs I μ LUO μ mo I I/1正向引物和反向引物各0.5 μ L、模板DNA 200 ng、Taq酶0.1U； (2)PCR反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性 5 min;94°C變性 30 s，55.7°C或 55.2°C退火 30 s，72°C延伸45 s，30次循環(huán)；最后72°C延伸10 min ； (3)電泳檢測:將兩對FAD2B引物的PCR產(chǎn)物分別進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳； (4)凝膠經(jīng)染色后在凝膠掃描儀中檢測擴增條帶；根據(jù)兩次電泳的帶型得到樣本相應(yīng)的基因型。
6.權(quán)利要求1-5任一項所述的高油酸花生分子標(biāo)記在回交育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】A01H1/02GK103468678SQ201310434389
【公開日】2013年12月25日 申請日期:2013年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月22日
【發(fā)明者】張新友, 齊飛艷, 黃冰艷, 劉華, 韓鎖義, 湯豐收, 董文召, 徐靜 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院