專利名稱：具有抗植物病原菌作用的銀杏內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種發(fā)酵培養(yǎng)方法，具體涉及銀杏內(nèi)生真菌的抗菌發(fā)酵液的制備方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，大量使用化學(xué)農(nóng)藥引起一系列環(huán)境和健康問題已被人廣泛認(rèn)知，研制安全、高效、環(huán)保的新型農(nóng)藥已成為發(fā)展的方向和研究的主題。微生物農(nóng)藥因?qū)Νh(huán)境友好，不易產(chǎn)生抗性，生產(chǎn)成本低，發(fā)酵工藝簡單，對(duì)非靶標(biāo)生物安全等優(yōu)點(diǎn)，成為新型農(nóng)藥發(fā)展的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。作為重要的藥源之一的植物內(nèi)生真菌(Endophytic fungi)，在與宿主植物長期相互作用、協(xié)同進(jìn)化的·過程中，在植物體內(nèi)維持了微生態(tài)系統(tǒng)平衡。為了保持這種平衡，植物內(nèi)生真菌可能產(chǎn)生與宿主植物相同或相似功能的次生代謝產(chǎn)物。因此,可將植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物作為新化合物、新藥物篩選的潛在或替代資源，從而有效降低新藥物或其它用途活性物質(zhì)的研發(fā)成本。銀杏{Ginkgo biloba L.)素有裸子植物“活化石”和“植物界熊貓”之稱，是中國特有的珍貴樹種，在漫長的生長期中幾乎不感染病蟲害，壽命極長。根據(jù)植物內(nèi)生真菌內(nèi)共生理論推斷，銀杏中很有可能存在著某些內(nèi)生真菌，通過產(chǎn)生具有特殊抗菌活性的次生代謝產(chǎn)物，影響宿主銀杏的抗病害能力。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種對(duì)植物病原真菌的菌絲生長具有較好抑制作用的銀杏內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的制備方法。本發(fā)明所述的銀杏內(nèi)生真菌命名為腐皮鐮孢T-7 Q7UsariUm solani T-7),現(xiàn)保藏在國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5089。本發(fā)明的銀杏內(nèi)生真菌系從中國安徽省合肥市銀杏biloba L)植物活體中分離得到。抗菌發(fā)酵液的具體制備方法如下:
所述抗菌發(fā)酵液的具體制備操作步驟如下:
(1)菌種活化
在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少許保藏的銀杏內(nèi)生真菌的菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，恒溫避光培養(yǎng)5天，培養(yǎng)溫度28°C 土 TC，得到活化菌種；
(2)種子培養(yǎng)
無菌條件下，利用接種環(huán)挑取3環(huán)活化菌種，接種于50ml的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ±1°C，得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子，以10%接種量，接種于50ml的液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ± I°C，得到二級(jí)種子；
(3)發(fā)酵培養(yǎng)
將二級(jí)種子接種到50ml的液體培養(yǎng)基中，接種量10%，恒溫?fù)u床培養(yǎng)7天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ±1°C，得到銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵液；發(fā)酵液過濾除去菌絲體，無菌條件下，過0.22微米過濾器，即得到銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液。發(fā)酵培養(yǎng)特征:培養(yǎng)第I天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養(yǎng)第3天，淡粉色的細(xì)粉末減少，出現(xiàn)粉色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，粉紅色菌絲球繼續(xù)增多，體積變大，發(fā)酵液為橙紅色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量紅色的菌絲球，體積變大，發(fā)酵液為橙紅色。所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升。所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備:馬鈴薯200克，葡萄糖20克、蒸餾水I升，pH自然。所述液體培養(yǎng)基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸鈉I克，氯化鈣0.5克，硫酸鎂
0.1克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水I升，pH自然。上述三種培養(yǎng)基使用前在溫度121°C、壓力0.1MPa下，滅菌30 min。本發(fā)明通過銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液的抗菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該菌對(duì)供試5種植物病原真菌(番爺枯萎病菌(Fusarium oxysporum),蘋果腐爛病菌ΓCytosporamandshurica),蘋果炭 疽病菌gloeosporioides),梨黑星病菌(Yonturiapirina)，小麥赤霉病菌graminearum))的菌絲生長具有較為明顯的抑制作用。本發(fā)明以植物內(nèi)生真菌作為資源，以求獲得抗植物病原真菌病害的新型農(nóng)用抗生素類天然活性物。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明所述銀杏內(nèi)生真菌T-7內(nèi)生真菌抗植物病原菌發(fā)酵液的抗菌試驗(yàn)如下:
1.植物病原真菌:
辣椒疫霉病菌{Phytoph thora capsici ),番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum),蘋果腐爛病菌(Pytospora mandshuri ca),蘋果炭疽病 HCo I Ietotrichumgloeospori oi des),梨黑星病菌 iyenturia pirina),小麥赤霉病 1^iFusariumgraminearum )；
2.病原微生物的培養(yǎng)
取植物病原真菌的斜面培養(yǎng)物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板活化，在(28±1) °C恒溫箱中培養(yǎng)5天。3.內(nèi)生真菌的培養(yǎng):
本實(shí)施例所用銀杏內(nèi)生真菌命名為腐皮鐮孢T-7 Q7UsariUm solani T_7),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5089 ；
在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少許銀杏內(nèi)生真菌的菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，恒溫避光培養(yǎng)5天，培養(yǎng)溫度28°C ±1°C，得到活化菌種。
4.T-7菌株發(fā)酵液制備
無菌條件下，利用接種環(huán)挑取3環(huán)活化菌種，接種于50ml的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C 土 1°C，得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子，以10%接種量，接種于50ml的液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ± I°C，得到二級(jí)種子； 將二級(jí)種子接種到50ml的液體培養(yǎng)基中，接種量10%，恒溫?fù)u床培養(yǎng)7天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ± I°C，得到銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵液；發(fā)酵液過濾除去菌絲體，無菌條件下，過0.22微米過濾器，即得到銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液；
發(fā)酵培養(yǎng)特征:培養(yǎng)第I天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養(yǎng)第3天，淡粉色的細(xì)粉末減少，出現(xiàn)粉色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，粉紅色菌絲球繼續(xù)增多，體積變大，發(fā)酵液為橙紅色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量紅色的菌絲球，體積變大，銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液為橙紅色；
上述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備:馬鈴薯200克，葡萄糖20克、蒸餾水I升，pH自
然；
上述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I
升;
上述液體培養(yǎng)基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸鈉I克，氯化鈣0.5克，硫酸鎂0.1克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水I升，PH自然；
上述三種培養(yǎng)基使用前在溫度121°C、壓力0.1MPa下，滅菌30 min。5.抑制菌絲生長速率法測(cè)定抗菌活性
無菌條件下，在100毫升三角瓶中加入6毫升本發(fā)明制備的銀杏內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液和54毫升馬鈴薯葡萄糖瓊脂無菌融化的培養(yǎng)基，搖勻，分別取10毫升置于直徑為9厘米無菌培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，待冷卻后在每個(gè)培養(yǎng)基平面上接入I個(gè)供試病原菌菌餅(直徑5毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養(yǎng)基表面，將平板置于28±1°C避光培養(yǎng)72小時(shí)。采用十字交叉法測(cè)定菌落生長直徑，用下述公式計(jì)算抑制率:
S幺生長- +壟( )= 一..—一總、100
表1:本發(fā)明所述的菌株T-7發(fā)酵物對(duì)六種植物病原微生物的抗菌結(jié)果....................................................................................................................................................................................................................................................................................—(%>...........................................................................................................................1Mtfsnmr τ-7觀紀(jì)廳應(yīng)瞧_丨 麵酬
c 雌誦1#>................................................................1jBios............................................................................................................................................................................................................................一..........................................7jfeaj3...................................................................................................mjmrn................................................1iiailgr.................................................4涵9....................................................................................................1tmuM——...............................................................................................................................0ma..................................................................................................1OMi1...............................................由表I可見，腐皮鐮孢T-7發(fā)酵原液對(duì)蘋果腐爛病菌(Cytospora mandshuri ca)菌絲生長抑制率達(dá)到85%以上，對(duì)梨黑星病菌(Venturia pirina)的菌絲生長抑制率在35%以上，對(duì)小麥赤霉病菌(/^sari應(yīng)《raffiifleara )、番爺枯萎病菌 ifusarium oxysporum)、尊果炭疽病菌應(yīng)Woeo1S^orioiofe1S)的菌絲生長也具有一定的抑制作用。由此可見,本發(fā)明制備所得到的銀杏內(nèi)生真菌內(nèi)生真菌腐皮鐮孢T-7發(fā)酵物對(duì)供試植物病原真菌具有明顯的抗菌活性，可以將其選作內(nèi)生真菌資源，通過發(fā)酵制備，以求獲得抗植物病原真菌病害的具備新型 農(nóng)用活性的天然成分。
權(quán)利要求
1.具有抗植物病原菌作用的銀杏內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的制備方法，其特征在于:所述銀杏內(nèi)生真菌命名為腐皮鐮孢T-7 Q7UsariUm solani T-7),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC N0.5089 ；所述抗菌發(fā)酵液的具體制備操作步驟如下: (1)菌種活化 在無菌條件下，用接種環(huán)挑取少許保藏的銀杏內(nèi)生真菌的菌種，轉(zhuǎn)接于已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基平板中，恒溫避光培養(yǎng)5天，培養(yǎng)溫度28°C 土 TC，得到活化菌種； (2)種子培養(yǎng) 無菌條件下，利用接種環(huán)挑取3環(huán)活化菌種，接種于50ml的馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基內(nèi)，恒溫?fù)u床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ±1°C，得到一級(jí)種子；將一級(jí)種子，以10%接種量，接種于50ml的液體培養(yǎng)基中，恒溫?fù)u床培養(yǎng)2天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ± I°C，得到二級(jí)種子； (3)發(fā)酵培養(yǎng) 將二級(jí)種子接種到50ml的液體培養(yǎng)基中，接種量10%，恒溫?fù)u床培養(yǎng)7天，搖床轉(zhuǎn)速160轉(zhuǎn)/分，溫度28°C ±1°C，得到銀杏內(nèi)生真菌發(fā)酵液；發(fā)酵液過濾除去菌絲體，無菌條件下，過0.22微米過濾器，即得到銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液； 發(fā)酵培養(yǎng)特征:培養(yǎng)第I天，菌體為少量淡粉色的粉末；培養(yǎng)第3天，淡粉色的細(xì)粉末減少，出現(xiàn)粉色的小菌絲球；培養(yǎng)第5天，粉紅色菌絲球繼續(xù)增多，體積變大，發(fā)酵液為橙紅色；培養(yǎng)第7天，出現(xiàn)大量紅色的菌絲球，體積變大，銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液為橙紅色； 所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂18克、蒸餾水I升; 所述馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基的制備:馬鈴薯200克，葡萄糖20克、蒸餾水I升，pH自然； 所述液體培養(yǎng)基:蛋白胨15克，葡萄糖20克，硝酸鈉I克，氯化鈣0.5克，硫酸鎂0.1克，磷酸氫二鉀0.1克，蒸餾水I升，PH自然； 上述三種培養(yǎng)基使用前在溫度121°C、壓力0.1MPa下，滅菌30 min。
全文摘要
本發(fā)明涉及具有抗植物病原菌作用的銀杏內(nèi)生真菌抗菌發(fā)酵液的制備方法，所述銀杏內(nèi)生真菌命名為腐皮鐮孢T-7，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2011年7月20日，保藏編號(hào)為CGMCC No.5089。所述抗菌發(fā)酵液的具體制備操作步驟如下(1)菌種活化，(2)一級(jí)、二級(jí)種子培養(yǎng)，(3)發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液為橙紅色?？咕囼?yàn)發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的銀杏內(nèi)生真菌T-7的抗菌發(fā)酵液對(duì)供試的5種植物病原真菌(番茄枯萎病菌，蘋果腐爛病菌，蘋果炭疽病菌，梨黑星病菌，小麥赤霉病菌)的菌絲生長具有較為明顯的抑制作用。本發(fā)明以植物內(nèi)生真菌作為資源，以求獲得抗植物病原真菌病害的新型農(nóng)用抗生素類天然活性物。
文檔編號(hào)A01N63/04GK103194490SQ20131009745
公開日2013年7月10日 申請(qǐng)日期2013年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月26日
發(fā)明者花日茂, 柏鈺, 操海群, 吳祥為, 徐慶慶, 曾現(xiàn)銀 申請(qǐng)人:安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)