專利名稱：鹽屋鏈霉菌代謝產(chǎn)物在防治西瓜枯萎病菌中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及生防內(nèi)生放線菌一鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis)的培養(yǎng)及其代謝產(chǎn)物的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物體內(nèi)都存在大量的內(nèi)生菌，內(nèi)生菌最早發(fā)現(xiàn)于牧草，后來(lái)又在木本植物、草本植物、禾本植物、苔蘚、地衣、海藻等植物中被發(fā)現(xiàn)。迄今的研究表明，植物內(nèi)生菌可增強(qiáng)宿主的抗病性、提高植物的生產(chǎn)力、抗逆抗蟲(chóng)等。發(fā)揮這些作用是由于內(nèi)生菌在植物體內(nèi)繁殖和生長(zhǎng)，并在體內(nèi)產(chǎn)生有生物活性的次生代謝產(chǎn)物。因此，內(nèi)生菌可能成為生物防治中有潛力的生物控制劑，在生態(tài)農(nóng)業(yè)和生物農(nóng)藥研制方面具有重要的用途。近年來(lái)植物內(nèi)生菌已引起了微生物學(xué)家、生態(tài)學(xué)家、植物保護(hù)學(xué)家的廣泛興趣，逐漸成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。目前微生物源農(nóng)藥的研究和開(kāi)發(fā)在我國(guó)十分活躍，但微生物資源及其應(yīng)用潛力尚沒(méi)有得到充分的發(fā)揮，而植物內(nèi)生菌即是這樣一類有待開(kāi)發(fā)的新興微生物資源。目前對(duì)植物病害的防治，主要采用化學(xué)農(nóng)藥殺滅病原菌，但化學(xué)農(nóng)藥對(duì)人畜的毒副作用和殘留問(wèn)題至今仍難以有效的解決。利用內(nèi)生菌產(chǎn)生的抗病原真菌的活性物質(zhì)進(jìn)行植物病原真菌病害的生物防治，則具有周期短、易于研究、便于生產(chǎn)和低毒等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明從枸骨中分離到一株生防內(nèi)生放線菌，并對(duì)該菌株發(fā)酵代謝產(chǎn)物進(jìn)行了抑菌作用研究。該發(fā)明為微生物源農(nóng)藥的進(jìn)一步研制和開(kāi)發(fā)提供優(yōu)良的出發(fā)菌株。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)化學(xué)農(nóng)藥不安全與微生物源農(nóng)藥種類較少的不足，提供一株
從枸骨中分離篩選出的內(nèi)生放線菌-鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis);本發(fā)明 的另一目的是提供利用該菌株代謝產(chǎn)物防治植物真菌病害的方法。本發(fā)明鹽屋鏈霉菌的分離、篩選與鑒定:是于2012年7月在浙江杭州采集的枸骨莖中，經(jīng)分離、純化、培養(yǎng)、發(fā)酵和活性測(cè)定等步驟獲得并保存；經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis),定名為鹽屋鏈霉菌107。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號(hào)CGMCCN0.6984。鹽屋鏈霉菌107，顯微形態(tài)特征:孢子絲直、螺旋形，孢子長(zhǎng)圓或橢圓形。本發(fā)明所述的鹽屋鏈霉菌107，經(jīng)發(fā)酵提取可獲得對(duì)部分植物真菌病害病原菌具有抑制作用的代謝產(chǎn)物。本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn): 一種防治水稻紋枯病、黃瓜立枯病、番茄灰霉病、黃瓜枯萎病或西瓜枯萎病等植物真菌病害微生物代謝產(chǎn)物的制備方法，按以下步驟進(jìn)行:(I)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的鹽屋鏈霉菌107菌種移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面平板上，在28°C ±1°C條件下培養(yǎng)至試管斜面長(zhǎng)滿孢子，供接種用；(2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，蛋白胨 5g，(NH4) 2S045g, CaC035g, MgSO4IOg,每 300mL 三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液 60mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無(wú)菌條件下挑取一鉬金環(huán)鹽屋鏈霉菌107孢子接種，在28°C 土 1°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)128h ；(3)發(fā)酵物提取:發(fā)酵完畢，離心收集發(fā)酵上清液，用常規(guī)有機(jī)溶劑萃取經(jīng)真空濃縮后獲得浸膏，用于抑菌活性測(cè)定。本發(fā)明的有益效果:一是本發(fā)明從植物枸骨莖中分離篩選出代謝物對(duì)部分植物真菌病害病原菌具有較強(qiáng)抑制作用的鹽屋鏈霉菌107，這為農(nóng)業(yè)上防治植物真菌病害病原菌提供了一株微生物菌株；二是本發(fā)明提供了利用鹽屋鏈霉菌107發(fā)酵獲得活性代謝產(chǎn)物的方法；該代謝產(chǎn)物可應(yīng)用于植物真菌病害的防治，為農(nóng)用殺菌劑的開(kāi)發(fā)增添了新的途徑。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:(鹽屋鏈霉菌107的分離與篩選)本發(fā)明于2012年7月在浙江杭州采集枸骨莖，經(jīng)表面消毒、內(nèi)生菌分離、培養(yǎng)、發(fā)酵、活性測(cè)定以及對(duì)抑制植物真菌病害病原菌活性菌株的篩選等步驟，從中獲得鹽屋鏈霉菌107，保存。鹽屋鏈霉菌107抑菌活性測(cè)定:取經(jīng)0.22 μ m膜過(guò)濾的發(fā)酵上清液ImL于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，與9mL冷卻至50°C的PDA培養(yǎng)基迅速混勻，冷卻后在每個(gè)培養(yǎng)基平面分別放I個(gè)直徑為4mm的水稻紋枯 病菌(Thanatephorus cucumeris)或黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum.sp.cucumebrium Owen)或黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)或西瓜枯萎病菌(F.0xysporum f.sp.niveum)或番爺灰霉病菌(Botrytis cinerea)等供試菌菌餅，菌餅接于培養(yǎng)皿中央(培養(yǎng)皿直徑為9cm)，置培養(yǎng)箱中28°C培養(yǎng)72h，以無(wú)菌水處理作為對(duì)照，重復(fù)3次；采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，以下列公式計(jì)算抑制率:
權(quán)利要求
1.鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis) 107代謝產(chǎn)物防治西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporumf.sp.niveum)的應(yīng)用，所述的鹽屋鏈霉菌107在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號(hào)CGMCCN0.6984，所述代謝產(chǎn)物按以下方法制備: (1)菌種的活化培養(yǎng):將分離保存的鹽屋鏈霉菌107菌種移至馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)斜面平板上，在28°C ±1°C條件下培養(yǎng)至試管斜面長(zhǎng)滿孢子，供接種用； (2)發(fā)酵培養(yǎng):發(fā)酵培養(yǎng)液為每IOOOmL中含有黃豆餅粉20g，玉米粉15g，麩皮10g，蛋白胨5g，(NH4)2S045g, CaC035g, MgSO4IOg,每300mL三角瓶裝發(fā)酵培養(yǎng)液60mL ;配制后121°C滅菌20min，待冷卻至40°C在無(wú)菌條件下挑取一鉬金環(huán)鹽屋鏈霉菌107孢子接種，在.28 0C 土 1°C條件下，搖床轉(zhuǎn)速180轉(zhuǎn)/分鐘，發(fā)酵培養(yǎng)128h ； (3)發(fā)酵物提取:發(fā)酵完畢后離心收集發(fā)酵液，加入等體積乙酸乙酯萃取，取下層，再用等體積正丁醇萃取，取 上層，在 真空條件下濃縮至浸膏，得正丁醇萃取物。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明所述的枸骨內(nèi)生菌是從浙江杭州采集的枸骨植物活體中采用內(nèi)生菌微生物分離技術(shù)分離獲得的，經(jīng)微生物分類學(xué)鑒定為鹽屋鏈霉菌(Streptomyces sioyaensis)，定名為鹽屋鏈霉菌107。該菌株已在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期2012年12月12日，保藏登記號(hào)CGMCCNo.6984。本發(fā)明最顯著的特征是該菌株液體發(fā)酵能夠產(chǎn)生對(duì)植物真菌病害病原菌如黃瓜立枯病菌(Rhizoctonia solani)和水稻紋枯病菌(Thanatephorus cucumeris)等有抑制作用的活性代謝產(chǎn)物，是農(nóng)業(yè)上重要的微生物資源。
文檔編號(hào)A01P3/00GK103222478SQ20131000802
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2013年1月7日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月7日
發(fā)明者湯谷, 申屠旭萍, 俞曉平, 劉葉丹, 陳昳麗, 俞葉微, 曾惠娟 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院