專利名稱：小卷蛾斯氏線蟲的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種小卷蛾斯氏線蟲的制備方法，其用于防治隱蔽性害蟲(例如鉆蛀和土棲)，屬于林木害蟲生物防治領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
鉆蛀和土棲等隱蔽性害蟲是重要的農(nóng)林害蟲種類，并隨著農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整其危害的嚴重性日益突出。該類害蟲的棲息和危害部位隱蔽、為害周期長、種群一旦建立就能穩(wěn)定增長，而目前又缺乏行之有效的防治方法，因此成為國際上公認的難于防治的重大害蟲種類。 目前生產(chǎn)中以一些高毒、高殘留的化學(xué)藥劑防治為主，但往往因其隱蔽性的生活特征而難于取得理想的效果。另一方面，長期單純使用化學(xué)農(nóng)藥導(dǎo)致目標害蟲抗藥性迅速增強、次要害蟲上升爆發(fā)成災(zāi)，同時引起生態(tài)平衡破壞、環(huán)境污染等一系列問題，并嚴重影響農(nóng)林產(chǎn)品生產(chǎn)安全。隨著人們環(huán)境保護和可持續(xù)發(fā)展意識的不斷提高，對無公害、綠色農(nóng)產(chǎn)品的需求日益迫切，生物防治作為害蟲綜合治理的一種重要手段受到越來越多的重視。
昆蟲病原線蟲作為一類重要的新型殺蟲劑，對隱蔽性害蟲的防治表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢和良好的商業(yè)前景。昆蟲病原線蟲寄主范圍較廣，對寄主具有主動搜索能力，特別是對棲息和危害部位比較隱蔽的如土棲性和鉆蛀性害蟲具有獨特的防治優(yōu)勢；可人工大量培養(yǎng)；對人、畜、環(huán)境安全。其體內(nèi)帶有共生細菌,隨線蟲進入昆蟲體內(nèi)，造成昆蟲敗血癥而死亡。在工業(yè)化國家昆蟲病原線蟲制劑占生物農(nóng)藥市場銷售額的13%，僅次于蘇云金桿菌產(chǎn)品。澳大利亞、美國、德國、荷蘭、加拿大等國家的數(shù)十家商業(yè)化公司均可提供昆蟲病原線蟲供實際應(yīng)用。廣泛用于農(nóng)林、牧草、花卉、和衛(wèi)生等重要害蟲。自1985年由中國農(nóng)科院生防所從澳大利亞引進大量離體培養(yǎng)昆蟲病原線蟲技術(shù)以來，我國已成功用于對桃小食心蟲 (Carposina onens)、小木蠢蛾(Holcocerusinsularis)等多種林業(yè)害蟲的防治，其中防治蘋果園桃小食心蟲的面積已超過7000公頃，取得了明顯的經(jīng)濟效益和社會效益。
但目前的大量繁殖技術(shù)和依賴于低溫的貯存技術(shù)使昆蟲病原線蟲生產(chǎn)成本過高， 而限制了它對害蟲控制作用的充分發(fā)揮和進一步的推廣應(yīng)用，同時也使昆蟲病原線蟲的生產(chǎn)規(guī)模滯留于中試和商業(yè)小量生產(chǎn)階段，因此昆蟲病原線蟲大量繁殖技術(shù)和常溫貯存技術(shù)的研究具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價值。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及一種小卷蛾斯氏線蟲成品的制備方法將小卷蛾斯氏線蟲制成微膠囊的形式。
本發(fā)明通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)
—種小卷蛾斯氏線蟲成品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟將線蟲懸浮液和I液混合，將所述混合液滴入II液，靜置后，從II液中濾出微膠囊，其中所述的I液包括: 10%甘油、O. 075%福爾馬林、2%海藻糖、余量為蒸餾水；所述的II液包括10%甘油、O. 075% 福爾馬林、O. 5%CaCl2、余量為蒸餾水。所述的線蟲懸浮液是將線蟲加入適量水中配成的。
根據(jù)本發(fā)明，還提供一種小卷蛾斯氏線蟲成品的制備方法，其特征在于，包括將線蟲懸浮液和I液混合，將線蟲的濃度調(diào)至lX104IJs/ml—3X104IJs/ml (優(yōu)選I.5-2 X IO4IJs/ml)，將所述線蟲懸浮液和I液的混合液以100-130滴/min (優(yōu)選110-120 滴/min)的速度滴入II液，靜置(優(yōu)選20-60分鐘，優(yōu)選30-40分鐘)后，用篩網(wǎng)將成型的微膠囊從II液中濾出。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選地，所述方法包括將所述混合液懸于II液上方IOcm左右。其中優(yōu)選所述的線蟲懸浮液的濃度彡2X IO4IJs/ml。
根據(jù)本發(fā)明，上述小卷蛾斯氏線蟲成品的制備方法中使用的小卷蛾斯氏線蟲可以通過任何方法獲得。
根據(jù)本發(fā)明，上述小卷蛾斯氏線蟲成品的制備方法中使用的小卷蛾斯氏線蟲可以通過本發(fā)明中的大量繁殖方法獲得。本發(fā)明進一步提供一種小卷蛾斯氏線蟲的大量繁殖方法，其特征在于，所述方法包括，將線蟲共生菌接入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將所述經(jīng)培養(yǎng)的線蟲共生菌菌液接入裝在不銹鋼培養(yǎng)盒中的固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再接入線蟲懸浮液，培養(yǎng)線蟲，并收獲線蟲，其中所述的線蟲懸浮液是將線蟲加入適量水中配成的。
根據(jù)本發(fā)明，所述線蟲懸浮液的濃度彡2X IO4IJs/ml0
優(yōu)選的，所述不銹鋼培養(yǎng)盒為長方體，特別優(yōu)選長35cm，寬25cm，高20cm。
根據(jù)本發(fā)明，一種小卷蛾斯氏線蟲的大量繁殖方法，其特征在于，所述方法包括， 將線蟲共生菌接入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將所述經(jīng)培養(yǎng)的線蟲共生菌菌液以O(shè). lml/g的量接入裝在不銹鋼培養(yǎng)盒中的線蟲固態(tài)培養(yǎng)基中，在25土 1°C培養(yǎng)3-5天后，接入線蟲懸浮液，黑暗靜置培養(yǎng)(優(yōu)選25°C )，定期取樣檢測線蟲發(fā)育進程，培養(yǎng)3周后收獲線蟲。
根據(jù)本發(fā)明，所述線蟲共生菌菌液優(yōu)選由如下方法制備將線蟲共生菌(優(yōu)選單個菌落)，接入培養(yǎng)液，培養(yǎng)，優(yōu)選在振蕩下培養(yǎng)(如160rpm)，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25_28°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選 24-48h。
根據(jù)本發(fā)明，所述線蟲共生菌優(yōu)選為活化的線蟲共生菌，優(yōu)選采用如下的方法活化線蟲共生菌將線蟲共生菌菌種在培養(yǎng)基上活化，優(yōu)選在25°C下培養(yǎng)1-2天。
所述固態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)選包括黃豆粉10-30%，面粉5-20%，蛋黃粉O. 5_5%，蛋白陳 O. 5-2%，酵母膏O. 5-5%，海綿5-20%，余量為蒸餾水。
優(yōu)選地,所述培養(yǎng)基優(yōu)選為黃豆粉15%,面粉10%,蛋黃粉1%,蛋白陳1%,酵母膏1%, 海綿10%，水62%。
固態(tài)培養(yǎng)基優(yōu)選滅菌后使用，滅菌時間優(yōu)選40-45分鐘，優(yōu)選在100_140°C (例如 121°C)濕熱下。
根據(jù)本發(fā)明，進一步地，將收獲的線蟲連同固態(tài)培養(yǎng)物置于篩網(wǎng)中一起浸泡于裝有清水的較大容器中，靜置分離(優(yōu)選O. 5-1小時)后，線蟲沉降到容器底部，將篩網(wǎng)連同培養(yǎng)物移走，再加入清水反復(fù)清洗(優(yōu)選2-3次)，收獲清潔的線蟲。
本發(fā)明通過將小卷蛾斯氏線蟲制成微膠囊的形式獲得穩(wěn)定的線蟲成品，該線蟲成品可以實現(xiàn)常溫貯存，在常溫低濕下貯存保質(zhì)期可達3個月以上，濕度提高則保質(zhì)時間延長。如果冷藏保存(4°C_8°C)，則保質(zhì)期為六個月。


圖I是線蟲生產(chǎn)工藝流程圖。
其中包括如下步驟
共生菌活化，共生菌培養(yǎng)，固態(tài)培養(yǎng)基的共生菌接種，固態(tài)培養(yǎng)基的線蟲接種(種管，種瓶)，線蟲培養(yǎng),線蟲清洗收獲,線蟲儲存。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于實施例。 任何對本發(fā)明做出的改進和變化，都在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
一、小卷蛾斯氏線蟲的大量繁殖方法
I、常用培養(yǎng)基配方
菌種培養(yǎng)基配方營養(yǎng)瓊脂45g，水IOOOml ；
鑒別培養(yǎng)基配方營養(yǎng)瓊脂18g，溴百里酚蘭O. Olg，蒸餾水400ml。
固態(tài)培養(yǎng)基黃豆粉15%，面粉10%，蛋黃粉1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，海綿10%，水 62%。
2、線蟲共生菌菌種制備
線蟲共生菌為桿狀細菌，線蟲共生菌在上述菌種培養(yǎng)基平板上為白色菌落，生長初期菌落不規(guī)則，有芳香氣味。在鑒別培養(yǎng)基上為藍色菌落。
2. I、菌種的活化
將線蟲共生菌菌種在鑒別培養(yǎng)基平板上劃線活化，在25°C下培養(yǎng)1-2天備用。
2. 2、搖瓶菌液的制備
搖瓶培養(yǎng)液配方牛肉浸膏3g，氯化鈉10g，pH 7. 4-7. 6。
500ml三角瓶中搖瓶培養(yǎng)液的裝液量為250ml，以接種環(huán)挑取鑒別培養(yǎng)基平板上活化的單個藍色菌落，接入搖瓶培養(yǎng)液。于25-28°C下160rpm振蕩培養(yǎng)24-48h，得到共生菌菌液。
3、線蟲種管制備
小卷蛾斯氏線蟲(Steinernema carpocapsae)隸屬于線蟲動物門，側(cè)尾腺綱，小桿目，斯氏線蟲科。線蟲顯微形態(tài)體表角質(zhì)層光滑或有環(huán)紋。口腔無口針、口腔壁由分開或融合的桿體組成。收獲的侵染期幼蟲體外有鞘。體長438-650 μ m，體寬20-30 μ m。
用菌種培養(yǎng)基制備試管斜面培養(yǎng)基，冷卻后每管中加入2-3頭濕熱滅菌的大蠟螟，同時加入3-4塊滅菌的固態(tài)培養(yǎng)基，接共生菌菌液適量，以不見明水為宜，25 °C培養(yǎng)3天后加入無菌的線蟲。培養(yǎng)三周后冰箱4°C保存。
4、固態(tài)培養(yǎng)接種及培養(yǎng)
4. I、固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基
黃豆粉15%，面粉10%，蛋黃粉1%，蛋白胨1%，酵母膏1%，海綿10%，水62%。
4. 2、固態(tài)發(fā)酵容器、裝量及滅菌
不銹鋼培養(yǎng)盒，長35cm，寬25cm，高20cm，側(cè)面靠上部處開突出圓口，裝入 1000-1200g固態(tài)培養(yǎng)基，培養(yǎng)基含水量為63%，以紗布封口，121 °C濕熱滅菌40_45min。
4. 3、線蟲和共生菌接種
將上述制備的搖瓶菌液以O(shè). lml/g的量接入上述配置好的固態(tài)培養(yǎng)基中，在25°C培養(yǎng)3天后，接入線蟲懸浮液(將線蟲加入適量水中)，25°C黑暗靜置培養(yǎng)，定期取樣檢測線蟲發(fā)育進程，培養(yǎng)3周后收獲線蟲。以休眠期線蟲比例占到總比例的95%左右為收獲標準。
5、線蟲清洗與回收
將收獲的線蟲連同固態(tài)培養(yǎng)物置于篩網(wǎng)中一起浸泡于裝有清水的較大容器中，靜置分離O. 5-1小時后，線蟲沉降到容器底部，將篩網(wǎng)連同培養(yǎng)物移走，再加入清水反復(fù)清洗 2-3次。收獲清潔的線蟲。
二、小卷蛾斯氏線蟲的成品的制備方法和質(zhì)量標準
I、小卷蛾斯氏線蟲的成品的制備
線蟲懸浮液將收獲的線蟲加入適量清水配成線蟲懸浮液，線蟲濃度彡 2 X IO4I Js/ml ο
I液配置10%甘油、O. 075%福爾馬林、2%海藻糖，余量為蒸餾水；
II液配置10%甘油、O. 075%福爾馬林、O. 5%CaCl2，余量為蒸餾水。
將I液和線蟲懸浮液混合，將線蟲濃度調(diào)至2X IO4IJs/ml線蟲。將I液與線蟲的混合液懸于II液上方IOcm左右以120滴/min的速度滴入II液，靜置40min后，用篩網(wǎng)將成型的微膠囊從II液中濾出。
2、成品的質(zhì)量標準
整齊度將線蟲懸浮液濃度稀釋至100-200IJs/ml，在解剖境下對線蟲的侵染期線蟲的比例進行檢測，以達到95%左右為整齊度的標準；
侵染力以大蠟螟老熟幼蟲作為侵染對象，侵染率在7-10%左右線蟲的質(zhì)量較好。
3、產(chǎn)品儲存及保質(zhì)期
常溫低濕下貯存保質(zhì)期達3個月以上，濕度提高則保質(zhì)時間延長。冷藏保存 (4°C-8°C)，保質(zhì)期為六個月。
權(quán)利要求
1.一種小卷蛾斯氏線蟲成品的制備方法，將小卷蛾斯氏線蟲制成微膠囊。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于，將線蟲懸浮液和I液混合，將所述混合液滴入II液，靜置后，從II液中濾出微膠囊，其中所述的I液包括10%甘油、O. 075%福爾馬林、2%海藻糖、余量為蒸餾水；所述的II液包括10%甘油、O. 075%福爾馬林、O. 5%CaCl2、余量為蒸餾水，所述的線蟲懸浮液是將線蟲加入水中配成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，將線蟲懸浮液和I液混合，將線蟲的濃度調(diào)至IX 104IJs/ml-3X 104IJs/ml(優(yōu)選I. 5-2 X 104IJs/ml )，將所述線蟲懸浮液和I液的混合液以100-130滴/min (優(yōu)選110-120滴/min)的速度滴入II液，靜置(優(yōu)選20-60分鐘，優(yōu)選30-40分鐘)后，用篩網(wǎng)將成型的微膠囊從II液中濾出。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的制備方法，其特征在于，其中所述小卷蛾斯氏線蟲是由如下繁殖方法獲得的將線蟲共生菌接入培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將所述培養(yǎng)的線蟲共生菌菌液接入裝在不銹鋼培養(yǎng)盒中的固態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，再接入線蟲懸浮液，培養(yǎng)線蟲，收獲線蟲。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述不銹鋼培養(yǎng)盒為長方體，優(yōu)選長35cm,寬 25cm,高 20cm。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，其中所述小卷蛾斯氏線蟲是由如下繁殖方法獲得的將線蟲共生菌菌液以O(shè). lml/g的量接入裝在不銹鋼培養(yǎng)盒中的線蟲固態(tài)培養(yǎng)基中，在25± 1°C培養(yǎng)3d-5d后，接入線蟲懸浮液，黑暗靜置培養(yǎng)(優(yōu)選25°C )，定期取樣檢測線蟲發(fā)育進程，培養(yǎng)3周后收獲線蟲。
7.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的制備方法，其特征在于，所述線蟲共生菌菌液由如下方法制備將線蟲共生菌(優(yōu)選單個菌落)，接入培養(yǎng)液，培養(yǎng)，優(yōu)選在振蕩下培養(yǎng)(如160rpm)，培養(yǎng)溫度優(yōu)選25_28°C，培養(yǎng)時間優(yōu)選24_48h。
8.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的制備方法，其特征在于，所述線蟲共生菌為活化的線蟲共生菌，優(yōu)選采用如下的方法活化共生菌將共生菌菌種在培養(yǎng)基上活化，優(yōu)選在25°C下培養(yǎng)1-2天。
9.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的制備方法，其特征在于，所述固態(tài)培養(yǎng)基包括黃豆粉，面粉，蛋白陳，酵母膏，海綿，水。
10.根據(jù)權(quán)利要求4-6任一項所述的制備方法，其特征在干，將收獲的線蟲連同固態(tài)培養(yǎng)物置于篩網(wǎng)中一起浸泡于裝有清水的較大容器中，靜置分離(優(yōu)選O. 5-1小吋)后，線蟲沉降到容器底部，將篩網(wǎng)連同培養(yǎng)物移走，再加入清水反復(fù)清洗(優(yōu)選2-3次)，收獲清潔的線蟲。
全文摘要
本發(fā)明提供一種小卷蛾斯氏線蟲的制備方法，小卷蛾斯氏線蟲隸屬于尾感器綱小桿目斯氏線蟲科，是害蟲生物防治中應(yīng)用最廣泛、最具潛力的昆蟲病原線蟲之一。昆蟲病原線蟲的體內(nèi)帶有共生細菌，隨線蟲進入昆蟲體內(nèi)，造成昆蟲敗血癥而死亡，對鉆蛀和土棲等隱蔽性害蟲的防治表現(xiàn)出獨特優(yōu)勢和良好的防治效果。
文檔編號A01K67/033GK102972446SQ20121048050
公開日2013年3月20日 申請日期2012年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年11月22日
發(fā)明者梁洪柱, 田會鵬, 陳倩, 李學(xué)燕 申請人:北京市西山試驗林場