專利名稱：一種簡便的瓜類疫霉快速分離培養(yǎng)基的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種簡便、快速分離瓜類疫霉菌的培養(yǎng)基。屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
疫霉菌導(dǎo)致的植物病害對寄主植物的破壞性強、危害性大，傳播與蔓延迅速，弓丨起的病害大多難以控制，在植物的一個生長季節(jié)內(nèi)病菌可迅速發(fā)展造成病害流行，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的嚴重損失。因此由疫霉菌所致的植物病害通常稱為“疫病”。例如馬鈴薯晚疫病從1835年第一次在北美洲流行，隨后1845年在歐洲不斷發(fā)生，1847年在愛爾蘭曾因該病的大發(fā)生使馬鈴薯幾近絕產(chǎn)，導(dǎo)致歷史上著名的大饑饉，近百萬人餓死，200多萬人移民他鄉(xiāng)。由大豆疫霉菌(Phytophthora sojae)導(dǎo)致的大豆疫病是危害極為嚴重的大豆病害之一，在環(huán)境條件適宜的情況下可導(dǎo)致感病類型的大豆絕產(chǎn)。惡疫霉(P.cactorum)為一同宗配合疫霉種，是導(dǎo)致我國梨、蘋果、人參、草莓等多種植物疫病的主要病原菌。辣椒疫霉(P. capsici)可侵染辣椒、番茄、黃瓜、西瓜、南瓜和西葫蘆等8科19種主要蔬菜和作物。由瓜類疫霉(P.melonis)引起的黃瓜疫病，可造成黃瓜大面積死亡，是影響黃瓜生產(chǎn)的重要因素之一。該病原菌除為害黃瓜外，還可侵染絲瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、葫蘆、菜瓜、瓠瓜、甜瓜、白蘭瓜、哈密瓜、苦瓜、越瓜等葫蘆科作物，是近10多年來為害瓜類的重要病害。為了對疫霉進行相關(guān)研究，以及調(diào)查病原菌的田間發(fā)病情況，篩選高效的藥劑，最終達到有效防治該病害的目的，分離獲得純化的疫霉是必要的前提條件。常規(guī)的病原菌分離方法是《植病研究方法》介紹的用75%こ醇和0. I %升汞液表面消毒處理。實際工作中，從田間采集到的樣本除被疫霉侵染外，不可避免的常常帶有錸刀菌，立枯絲核菌和腐霉等其他非目標真菌和細菌，按常規(guī)方法進行分離組織病原菌時，由于這些非目標真菌或細菌的污染，造成目標菌分離率低或難于分離到目標菌。因此，利用普通培養(yǎng)基從病組織上或土壌中分離疫霉吋，達不到分離純化的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的ー個目的是提供ー種殺菌劑組合。本發(fā)明所提供的殺菌劑組合，其活性成分如下述I)、2)所示I)、由咯菌臆、惡霉靈、五氯硝基苯、利福平組成；2)、由咪鮮胺、惡霉靈、五氯硝基苯、利福平組成；上述殺菌劑中，所述I)中，所述咯菌臆、惡霉靈、五氯硝基苯和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20)(50-100) (10-50) (50-100)，具體為 10 50 10 : 50 或 15 : 70 : 20 : 70 或20 100 50 100 ；所述2)中，所述咪鮮胺、惡霉靈、五氯硝基苯和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20)(50-100) (10-50) (50-100)，具體為 10 50 10 : 50 或 15 : 70 : 20 : 70 或20 100 50 100 ；、
本發(fā)明的另ー個目的是提供ー種用于分離疫霉屬病原菌(Phytophthora spp.)的
培養(yǎng)基。
本發(fā)明所提供的用于分離疫霉(Phytophthora spp.)的培養(yǎng)基,為如下I或II所示I、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的；II、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的；上述培養(yǎng)基中，所述I所示培養(yǎng)基中，所述咯菌腈在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述惡霉靈在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL,20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述培養(yǎng)基中，所述II所示培養(yǎng)基中，所述咪鮮胺在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL,20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ；上述培養(yǎng)基在分離疫霉(Phytophthora spp.)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。本發(fā)明所提供的分離疫霉(Phytophthora spp.)的方法,包括如下步驟用上述任一所述培養(yǎng)基進行分離，用于分離的樣本為感染疫霉(Phytophthora spp.)的植物的根
莖或土壌。實驗證明，本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基具有可行性、準確性、實用快捷和成本低廉、制備簡便的特點。用本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基分離疫霉，可解決疫霉分離過程中各種非目標真菌和細菌污染嚴重的問題，且速度快，效率高，省時、省力。本發(fā)明為進行田間一次性分離以及室內(nèi)純化疫霉提供技術(shù)支持。本發(fā)明選擇培養(yǎng)基可用于簡便、快捷地從病株組織上或病田土壤中一次性分離辣椒疫霉、瓜類疫霉等疫霉病原菌以及室內(nèi)純化疫霉菌株。


圖I為三種抗生素對植株根莖表面細菌的抑制作用。圖2為三種抗生素對土壤中細菌的抑制作用。圖3為黃瓜疫霉的發(fā)病情況和疫霉分離情況。A為為田間瓜類疫霉引起植株發(fā)??；B為瓜類疫霉侵染引起黃瓜果實發(fā)??；C為田間瓜類疫霉侵染導(dǎo)致黃瓜根莖部發(fā)病山為病樣中分離到的瓜類疫霉。
具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
咯菌腈原藥 購自武漢福德化工有限公司，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是4_(2，2_ ニ氣-I, 3_苯并ニ氧戍環(huán)_4_基)卩比略-3_臆,分子式C12H6F2N202。該藥中略菌腈的質(zhì)量百分含量為96%。咪鮮胺(又叫“咪酰胺”)原藥購自海南カ智生物工程有限公司，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是N-丙基-N-[2-(2，4，6-三氯苯氧基)こ基]-咪唑-I-甲酰胺，分子式C15H16C13N302。該藥中咪鮮胺的質(zhì)量百分含量為97%。惡霉靈原藥購自山東濰坊天達植保有限公司，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是3-羥基-5-甲基異惡唑，通用名稱為惡霉靈，分子式C4H5N02。該藥中主要活性成分物質(zhì)的質(zhì)量百分含量為98%。五氯硝基苯原藥購自山西三立化工有限公司(原山西省臨汾有機化工廠)，其主要活性成分物質(zhì)的化學(xué)名稱是五氯硝基苯，通用名稱為五氯硝基苯，分子式C6C15N02。該藥中五氯硝基苯的質(zhì)量百分含量為95%。青霉素、利福平、氯霉素均購自北京拓英坊科技有限公司。實施例I、四種真菌抑制劑和三種抗生素對瓜類疫霉的抑制作用一、四種真囷抑制劑對瓜果疫霉的抑制作用以丙酮或甲醇為咪鮮胺、咯菌臆、惡霉靈和五氯硝基苯的溶劑，分別配制5000 μ g/mL的四種藥劑母液IOml ;其中，將咪鮮胺、咯菌腈和五氯硝基苯這三種真菌抑制劑的母液分別配制系列濃度為50 μ g/mL、20 μ g/mL和10 μ g/mL的含藥PDA平板；將惡霉靈這種腐霉抑制劑的母液分別配制系列濃度為100 μ g/mL、70 μ g/mL和50 μ g/mL的含藥PDA平板，以加有溶劑的平板為對照；然后采用菌絲生長速率法測定瓜類疫霉對咪鮮胺、咯菌臆、惡霉靈和五氯硝基苯的敏感性。將供試的瓜類疫霉菌株在PDA平板上于25°C預(yù)培養(yǎng)3d，用直徑為5_的打孔器于菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，將菌餅接種到分別含有四種藥劑系列濃度的PDA含藥平板中央(各濃度含等量有機溶剤)，于25°C下黑暗培養(yǎng)，4-5d后用十字交叉法測量各處理的菌落增長直徑(菌落直徑減去菌餅直徑5mm)，每處理重復(fù)3次；最后按照下面公式求出各藥劑濃度對菌絲生長的抑制百分率)，抑制率)=[(對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑)/ (對照菌落增長直徑)]X 100。測定了供試的四種真菌抑制劑對瓜類疫霉的抑制作用，結(jié)果如表I所示，不同濃度的五氯硝基苯對瓜類疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用10-50 μ g/mL的五氯硝基苯作為選擇性藥劑；50μ g/mL咯菌腈和咪鮮胺對瓜類疫霉的抑制率均大于10%，10-20 μ g/mL濃度的咯菌腈和咪鮮胺對瓜類疫霉抑制率較低，所以可以采用10-20 μ g/mL的咪鮮胺為分離疫霉中使用的選擇性藥劑。不同濃度的惡霉靈對瓜類疫霉的抑制率均低于10%，因此可以采用50-100 μ g/mL的惡霉靈作為選擇性藥劑；；表I四種真菌抑制劑對瓜類疫霉的抑制作用
ニ、三種抗生素對瓜類疫霉的抑制作用用滅菌水將上述三種抗生素均配制成5Χ104μ g/mL的母液，使用三種母液分別配制成濃度為100 μ g/mL>50 μ g/mL的利福平、青霉素和氯霉素，以加有無菌水的平板為對照。然后采用菌絲生長速率法測定瓜類疫霉對這三種抗生素的敏感性。將供試的瓜果瓜類疫霉在PDA平板上于25°C預(yù)培養(yǎng)3d，用直徑為5mm的打孔器于菌落邊緣的同一圓周上打取菌餅，將菌餅接種到分別含藥劑系列濃度的PDA含藥平板中央，于25°C下黑暗培養(yǎng)，4-5d后用十字交叉法測量各處理的菌落增長直徑(菌落直徑減去菌餅直徑5mm)，每處理重復(fù)3次；最后按照下面公式求出各藥劑濃度對菌絲生長的抑制百分率(％)，抑制率(％)=[(對照菌落增長直徑-處理菌落增長直徑)/ (對照菌落增長直徑)]X 100。同時測定了不同濃度的三種抗生素對瓜類疫霉的抑制作用，結(jié)果見表2，濃度為100和50 μ g/mL的青霉素、利福平和氯霉素對瓜類疫霉均沒有明顯的抑制作用。因此，可以在分離瓜果腐霉時使用100 μ g/mL或是50 μ g/mL濃度的青霉素、利福平和氯霉素作為分離純化瓜類疫霉選擇性培養(yǎng)基中的抗生素成份。并進ー步測定三種抗生素對環(huán)境中帶菌土壌和黃瓜根莖組織上攜帯的細菌的抑制作用。表2三種抗生素對瓜類疫霉的抑制作用
抑制率(％)
菌株青霉素 「利福平「氯霉素------
IOOppm 50ppm IOOppm 5 Oppm IOOppm 5 Oppm
—瓜類疫霉 L 2.2 J_1.6 I 3.5 I 1.2__1.8 J_-1.1 _實施例2、三種抗生素對環(huán)境中細菌的抑制作用供試植株將感病黃瓜品種長春密刺栽培于Φ 15cm,高12cm的育苗缽內(nèi)，置于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)科學(xué)園辣椒試驗田培養(yǎng)，植株長到4-5葉期后隨即采集根莖部，用于菌懸液的制備。供試土壤于2009年從天津市西青區(qū)瓜類疫病發(fā)生嚴重地區(qū)采集土樣，備用。試驗方法此試驗是在實施例I結(jié)果的基礎(chǔ)上檢測所選擇的三種濃度抗生素是否可有效抑制環(huán)境中的細菌。對于環(huán)境中細菌的檢測，主要針對來自植株莖基部以及發(fā)病土壤中的細菌，這是根據(jù)瓜類疫霉的分離部位主要是發(fā)病的莖基部以及帶病土壤決定的，本實驗采用的是黃瓜莖基部以及疫病發(fā)生比較嚴重的天津市西青區(qū)田間的土樣。首先，采30棵黃瓜幼苗的根莖部，剪碎后采用四分法將樣本隨機分成4份，取出其中I份放入25ml離心管中，加入15ml滅菌水，200r/min振蕩2分鐘，過濾取濾液，使用無菌水稀釋100X，分別取100 μ I涂布在分別含有100 μ g/mL、50 μ g/mL的利福平、青霉素和氯霉素，以不含藥平板為對照，每處理3個重復(fù)，2d后觀察其對細菌的抑制作用；然后從瓜類疫病發(fā)病嚴重的天津市河西區(qū)和西青區(qū)田間取土樣，稱取5g,放入燒杯中加入20ml滅菌水,200r/min振蕩20min，取上清100 μ I分別涂布在含有100 μ g/mL,50 μ g/mL的利福平、青霉素和氯霉素，以不含藥平板為對照，每處理3個重復(fù)，2天后觀察其對細菌的作用。選擇對細菌具有明顯抑制作用的抗生素濃度。本研究在表2結(jié)果的基礎(chǔ)之上，分別測定了初步選擇可用的三種抗生素對幼苗莖基部和土壌中細菌的抑制作用，兩個研究的結(jié)果一致。從圖I和圖2看出，氯霉素抑菌活性差，在其濃度達到100μ g/mL時，與對照相比，抑菌效果不明顯。青霉素、利福平的抑菌活性較強，可以達到抑菌的作用。由于環(huán)境中細菌種類的多祥性，青霉素主要對革蘭氏陽性菌有較強的抑制作用，所以平板中有少許零星革蘭氏陰性菌菌落。而對于利福平，平板中只有少許真菌菌落。因此，利福平對幼苗根莖部和土壤中的細菌具有廣譜的抑菌作用。綜上所述，本發(fā)明篩選藥劑的原則是對瓜類疫霉抑制率小于10%的前提下，盡可能選擇高濃度的藥劑，以提高對非目標菌的抑菌活性。根據(jù)以上所有的試驗結(jié)果可以看出，應(yīng)用于從田間一次性分離瓜類疫霉的選擇性培養(yǎng)基，可以選擇的真菌抑制劑為咯菌腈、咪鮮胺、惡霉靈和五氯硝基苯，濃度分別為10-20 μ g/mL、10-20 μ g/mL、50-100 μ g/mL和10-50 μ g/mL ;可以選擇的抗生素類為利福平,濃度采用50-100 μ g/mL。實施例3、用于分離瓜類疫霉的PDA選擇性培養(yǎng)基一、分離方法2009,2011年從天津市西青區(qū)，河西區(qū)瓜類疫病發(fā)病嚴重地區(qū)采集病樣，用于分離瓜類疫霉。瓜類疫霉的分離按下述方法進行在同一地區(qū)選擇不同的田塊，采集疫病的病樣(根莖和土壌)進行分離。分離步驟將發(fā)病組織使用清水清理干凈后充分晾干，切取根莖部病健交界處的小塊組織接種在本發(fā)明的選擇性培養(yǎng)基上，25°C下黑暗培養(yǎng)，至有菌絲長出；在菌落邊緣打取菌餅，置于加入IOmL滅菌水的培養(yǎng)皿中，在28°C光照條件下培養(yǎng)24-48h，可誘導(dǎo)其產(chǎn)生孢子囊，將培養(yǎng)皿置于4°C冰箱中處理40-60min后放回到室溫，30-60min后游動孢子釋放；挑單游動孢子置于普通PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，至長出菌落，得到瓜類疫霉。對得到的瓜類疫霉進行鑒定。將真正的瓜類疫霉菌落保存在白云豆培養(yǎng)基試管斜面上，加適量的滅菌石蠟油置于室溫下保存?zhèn)溆?。根?jù)現(xiàn)有的瓜果腐霉菌鑒定方法進行鑒定。ニ、分離中使用的培養(yǎng)基(一)I、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)的配制方法馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂粉14g,加蒸懼水定容至IOOOmL,高壓蒸汽滅菌，121で，20min。2、白云豆培養(yǎng)基的配制方法白云豆粉60g，雙層紗布過濾，瓊脂粉14g，加蒸餾水定容至IOOOmL,高壓蒸汽滅菌，121 °C, 20min。(ニ)從發(fā)病田土壌或病樣根莖部分離瓜類疫霉使用不同的PDA選擇培養(yǎng)基，具體如下I、病樣分離部位為根莖PDA選擇培養(yǎng)基I :向未冷卻的PDA培養(yǎng)基中添加咪鮮胺、惡霉靈、五氯硝基苯、、和利福平，并用未冷卻的PDA培養(yǎng)基定容至I升；咪鮮胺在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為15 μ g/mL，惡霉靈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為70 μ g/mL，五氯硝基苯在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為20 μ g/mL,利福平在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為70 μ g/mL。PDA選擇培養(yǎng)基II :與PDA選擇培養(yǎng)基I基本相同，不同之處在于咪鮮胺在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為10 μ g/mL,惡霉靈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為50 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為10 μ g/mL，利福平在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為 50 μ g/mL。PDA選擇培養(yǎng)基III :與PDA選擇培養(yǎng)基I基本相同，不同之處在于咪鮮胺在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為20 μ g/mL,惡霉靈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為100 μ g/mL,五 氯硝基苯在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為50 μ g/mL，利福平在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為 100 μ g/mL。2、病樣分離部位為土壤PDA選擇培養(yǎng)基I :向未冷卻的PDA培養(yǎng)基中添加咯菌腈、惡霉靈、五氯硝基苯、和利福平，并用未冷卻的PDA培養(yǎng)基定容至I升；咯菌腈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為15 μ g/mL,惡霉靈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為70 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為20 μ g/mL，利福平在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為70 μ g/mL。PDA選擇培養(yǎng)基II :與PDA選擇培養(yǎng)基I基本相同，不同之處在于咯菌腈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為10 μ g/mL,惡霉靈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為50 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為10 μ g/mL，利福平在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為 50 μ g/mL。PDA選擇培養(yǎng)基III :與PDA選擇培養(yǎng)基I基本相同，不同之處在于咯菌腈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為20 μ g/mL,惡霉靈在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為100 μ g/mL,五氯硝基苯在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為50 μ g/mL,利福平在PDA選擇培養(yǎng)基I中的濃度為 100 μ g/mL。真菌抑制劑溶液的配制以丙酮或甲醇為溶剤，以咯菌腈原藥、咪鮮胺原藥、惡霉靈原藥和五氯硝基苯原藥為溶質(zhì)，分別配制濃度為5000 μ g/mL的母液IOml,四種原藥的稱量量依次為 50. 2mg、51. 0mg、50. 6mg 和 50. 5mg ；細菌抑制劑溶液的配制用滅菌水將各種抗生素均配制成濃度為5 X IO4 μ g/mL的溶液。四、分離及鑒定結(jié)果在使用不同的本發(fā)明選擇培養(yǎng)基進行分離的過程中，PDA選擇培養(yǎng)基中均沒有雜菌長出，只有瓜類疫霉能夠生長，說明本發(fā)明的PDA選擇培養(yǎng)基抑制了雜菌和腐霉生長，使瓜類疫霉的分離更容易。本發(fā)明方法從開始將病變組織接種至選擇性培養(yǎng)基上至有瓜類疫霉菌絲長出，一般只需要3-4天，本發(fā)明的選擇培養(yǎng)基有效的抑制了其它真菌和細菌的生長，使瓜類疫霉在培養(yǎng)基中成為優(yōu)勢菌群，生長速度提高，從而加快了分離進程。2009,2011年從上述天津市西青區(qū)和河西區(qū)瓜類疫病發(fā)病嚴重地區(qū)采集黃瓜、冬瓜和南瓜病樣，共分離得到167株瓜類疫霉菌株，167株瓜類疫霉均鑒定正確。在用于田間一次性分離疫霉時，根據(jù)疫霉分離部位和采樣地區(qū)施藥歷史的不同，用于疫霉分離培養(yǎng)的殺菌劑組合物中以腐霉抑制劑惡霉靈和細菌抑制劑利福平為主，加入的其它真菌抑制劑可以有不同的組合。針對不同的分離部位，選擇不同的真菌抑制劑。其中，咪鮮胺對錸刀屬真菌有特效，對鏈格孢菌和立枯絲核菌也有較好的抑制作用，并且與生產(chǎn)中廣泛使用的多菌靈無交互抗藥 性。因此，對于植物根莖部組織中瓜類疫霉的分離，真菌抑制劑組合可選10-20 μ g/mL咪鮮胺，有利于抑制對多菌靈產(chǎn)生抗藥性的錸刀菌和絲核菌?？┚媸签`種非內(nèi)吸的殺菌劑，對立枯絲核菌有特效，對錸刀菌也有較好的抑制作用，在從病土中分離瓜類疫霉時，可以用于腐生錸刀菌及絲核菌的真菌抑制劑。因此，對于土壤中瓜類疫霉的分離，真菌抑制劑組合可選擇10-20 μ g/mL咯菌腈；五氯硝基苯對子囊菌門的根霉特效，主要用于環(huán)境溫度較高時空氣中黑根霉的抑制，因此如在溫度較高的季節(jié)分離瓜疫霉，需在上述殺菌劑組合物中添加濃度為10-50 μ g/mL五氯硝基苯后使用效果最佳。惡霉靈可選擇性的抑制真菌和腐霉，但對疫霉沒有抑制作用，在從根莖部組織中或從土壤中分離瓜類疫霉時，可以用于腐霉的抑制劑。因此，對于土壌中瓜類疫霉的分離，腐霉抑制劑組合可選擇50-100 μ g/mL惡霉靈。將上述該含有不同殺菌譜的真菌抑制劑和抗生素類殺細菌劑的殺菌劑組合物添加至PDA培養(yǎng)基中，制備成瓜類疫霉的選擇性培養(yǎng)基。
權(quán)利要求
1.ー種殺菌劑，其活性成分如下述I)或2)所示 1)、由多菌靈、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成； 2)、由咪鮮胺、五氯硝基苯、氟嗎啉和利福平組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的殺菌劑，其特征在于 所述I)中，所述咯菌臆、惡霉靈、五氯硝基苯和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20)(50-100) (10-50) (50-100)，具體為 10 : 50 : 10 : 50 或 15 : 70 : 20 : 70 或20 100 50 100 ； 所述2)中，所述咪鮮胺、惡霉靈、五氯硝基苯和利福平的質(zhì)量份數(shù)比為(10-20)(50-100) (10-50) (50-100)，具體為 10 50 10 : 50 或 15 : 70 : 20 : 70 或20 100 50 100。
3.一種用于分離疫霉(Phytophthora spp)的培養(yǎng)基,為如下I或II所示 I、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述I)所示殺菌劑得到的； II、是向PDA培養(yǎng)基中添加權(quán)利要求I或2中所述2)所示殺菌劑得到的。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基，其特征在于 上述培養(yǎng)基中，所述I所示培養(yǎng)基中，所述咯菌腈在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述惡霉靈在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL>20 μ g/mL或50 μ g/mL ；所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL,70 μ g/mL 或 100 μ g/mL ； 上述培養(yǎng)基中，所述II所示培養(yǎng)基中，所述咪鮮胺在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-20 μ g/mL,具體為10 μ g/mL、15 μ g/mL或20 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL、70 μ g/mL或100 μ g/mL ;所述五氯硝基苯在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為10 μ g/mL-50 μ g/mL,具體為10 μ g/mL,20 μ g/mL或50 μ g/mL ;所述利福平在所述PDA培養(yǎng)基中的濃度為50 μ g/mL-100 μ g/mL,具體為50 μ g/mL>70 μ g/mL Wi 100 μ g/mL。
5.權(quán)利要求3或4所述培養(yǎng)基在分離疫霉(Phytophthoraspp.)中的應(yīng)用。
6.ー種分離疫霉(Phytophthora spp.)的方法,包括如下步驟用權(quán)利要求3或4中所述培養(yǎng)基進行分離，用于分離的樣本為感染疫霉(Phytophthora spp.)的植物的根莖部組織或土壌。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種簡便、快速分離瓜類疫霉菌的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基是向PDA培養(yǎng)基中添加如下1)或2)所述殺菌劑得到的1)、由咯菌腈、惡霉靈、五氯硝基苯和利福平組成；2)、由咪鮮胺、惡霉靈、五氯硝基苯和利福平組成；實驗證明，本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基具有可行性、準確性、實用快捷和成本低廉、制備簡便的特點。用本發(fā)明的PDA選擇性培養(yǎng)基分離瓜類疫霉等疫霉屬卵菌，可解決疫霉分離過程中各種非目標真菌和細菌污染嚴重的問題，且速度快，效率高，省時、省力。
文檔編號A01N43/90GK102742585SQ20121025062
公開日2012年10月24日 申請日期2012年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2012年7月19日
發(fā)明者劉鵬飛, 賈睿哲 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)