專利名稱：一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及林木育種中胚性材料的保存方法，具體涉及ー種胚性材料的超低溫冷凍保存方法。
背景技術(shù)：
在林木體細胞胚胎發(fā)生和植株再生體系中，培養(yǎng)材料中的胚性細胞是否能較長時間保持旺盛的分和植株再生能力也是林木體胚產(chǎn)業(yè)化的 重要瓶頸。目前，還沒有較好的用于保存胚性材料的方法，常用的就是低溫保藏，這種方法雖然簡單，但是保存時間短，而且細胞恢復(fù)困難，増殖能力低，根本不能長期保存。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明目的針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，以實現(xiàn)胚性材料長期保存井能使其保持高頻增殖能力。技術(shù)方案為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下
一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，包括以下步驟
(1)取待保存的胚性材料，按10%的接種量接入高滲液體培養(yǎng)基，25°C，培養(yǎng)3 10d;其中，高滲液體培養(yǎng)基為添加有O. Γ0. 8mg/L山梨醇的M13基本培養(yǎng)基；
(2)過濾步驟(I)預(yù)培養(yǎng)的胚性材料，裝入冷凍管，向冷凍管中加入復(fù)合玻璃化保護劑，(TC，放置脫水O 70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；復(fù)合玻璃化保護劑為添加30%甘油和30%こニ醇的M13基本培養(yǎng)基。步驟(I)中，培養(yǎng)6 8d。步驟(I)中，在所述的高滲液體培養(yǎng)基中還加有f 5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。步驟(2)中，所述的放置脫水，為先用60%復(fù)合玻璃化保護劑保護胚性材料過渡脫水lOmin，然后轉(zhuǎn)到100%復(fù)合玻璃化保護劑脫水l(T60min，然后再投入液氮保存。有益效果與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，操作簡單，方便可行，解決了林木體胚產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸問題，可實現(xiàn)胚性材料長期保存到I年以上，井能使其保持高頻增殖能力，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟效益和社會效應(yīng)。


圖I是預(yù)培養(yǎng)滲透劑濃度試驗結(jié)果 圖2是預(yù)培養(yǎng)時間試驗結(jié)果 圖3是不同溫度進行細胞復(fù)蘇結(jié)果 圖4是胚性懸浮細胞復(fù)蘇結(jié)果圖5是可溶性淀粉在恢復(fù)培養(yǎng)中的作用結(jié)果圖；圖中，A、B為恢復(fù)5d時的狀態(tài)，C、D為恢復(fù)25d時的狀態(tài)；
圖6是ABA對細胞存活的影響結(jié)果 圖7是山梨醇處理后內(nèi)源脯氨酸的變化結(jié)果 圖8是外源脯氨酸對細胞的保護作用結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進ー步的說明。以下實施例的胚性材料為雜種馬褂木胚性懸浮細胞，其培養(yǎng)方法同中國專利申請02112948. 7 或 201010298850. 6。Μ13 基本培養(yǎng)基的配方為MS+2，4_D 2. 0mg/L+6，BA0. 2mg/L+LH 500mg/L + 蔗糖 30g/L, pH 值為 5. 8。實施例I
為了提高冷凍細胞的存活率，需要將胚性細胞進行預(yù)處理，采取的措施是將需要冷凍保存的胚性細胞接種在含有山梨醇等滲透調(diào)節(jié)劑滲透劑的培養(yǎng)基上，通過滲透調(diào)節(jié)使細胞部分脫水，減少細胞內(nèi)的水分，降低冷凍過程中冰晶的形成對細胞造成的傷害。通過TTC法檢測細胞活力，從而確定合適的預(yù)處理條件。TTC法是細胞活力測定的常用方法，該方法用于檢測細胞內(nèi)脫氫酶的活性。脫氫酶使氯化三苯四氮哇(TTC)還原生成ー種紅色復(fù)合物，此有色物質(zhì)不溶于水，但溶于酒精。因此，用酒精抽提，然后用分光光度計測定485nm時的吸光度，吸光度高的細胞活性強，從而可以確定細胞的生理狀態(tài)。將胚性懸浮細胞繼代到高滲液體培養(yǎng)基中，預(yù)培養(yǎng)不同的天數(shù)。高滲液體培養(yǎng)基為在MS基本培養(yǎng)基中加入2. Omg/L 2，4-D、0. 2mg/L 6，BA、500mg/L LH和30g/L蔗糖，以及濃度分別為 O. Img/L、0. 2mg/L、0. 3mg/L、0. 4mg/L、0. 5mg/L、0. 6mg/L、0. 7mg/L 和 0. 8mg/L的山梨醇。結(jié)果如圖I所示，表明在不同預(yù)培養(yǎng)濃度下細胞存活率不同，以山梨醇濃度O. 2mol/L O. 5mol/L時進行的預(yù)培養(yǎng)，細胞存活率隨山梨醇濃度上升而逐漸上升，到0.6mol/L時活力達到最高。當(dāng)山梨醇濃度超過O. 6mol/L吋，細胞存活率呈下降趨勢。在
O.6mol/L山梨醇濃度下冷凍細胞存活率最高的結(jié)果說明，該濃度下細胞脫水最充分，同時沒有高滲脅迫存在。通過不同預(yù)培養(yǎng)時間比較，結(jié)果如圖2所示，表明隨著預(yù)培養(yǎng)時間的増加，細胞冷凍后的活力明顯上升，在第4d和第7d處理情況下細胞活力達到ー個小高峰，隨后細胞活力開始下降，預(yù)培養(yǎng)時間短于3d時細胞活力明顯偏低，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長細胞活力不斷升高并趨于穩(wěn)定，說明胚性懸浮細胞對高滲環(huán)境的ー個逐步適應(yīng)的過程。預(yù)培養(yǎng)7d吋，細胞在每個處理情況下都達到了最高值。因此，認為預(yù)培養(yǎng)7d是合適的時間。在進行懸浮培養(yǎng)中，在I :9體積比的細胞和培養(yǎng)基的比例下，細胞在第7d處于細胞生長的對數(shù)生長期，細胞分裂旺盛，形態(tài)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，對冷凍，化凍造成的損傷有較強的抵抗力。實施例2
將實施例I預(yù)培養(yǎng)的胚性懸浮細胞過濾，取適量體積(約ImL)的細胞加入冷凍管(5mL)中，向管中加入ImL復(fù)合玻璃化保護劑(含30%體積甘油、30%體積こニ醇的M13基本培養(yǎng) 基)，在0°C下，放置脫水O 70min，然后將冷凍管裝入冷凍盒直接投入液氮，長期保存。預(yù)培養(yǎng)時間對冷凍保存的成功有著極其重要的作用，通過調(diào)節(jié)滲透壓，可以提高細胞的抗逆性同時降低細胞內(nèi)的含水量，從而降低冰晶產(chǎn)生的程度，減少對細胞的傷害。通過確定以含有O. 6mol/L山梨醇的M13號培養(yǎng)基為預(yù)處理培養(yǎng)基，細胞與培養(yǎng)基體積比為
I:9，以含30%こニ醇和30%甘油的M13基本培養(yǎng)基作為復(fù)合玻璃化保護劑，先放入60%體積(用水稀釋)的復(fù)合玻璃化保護劑過渡脫水O或lOmin，然后放入100%復(fù)合玻璃化保護劑脫水時間(TeOmin為試驗條件，對預(yù)培養(yǎng)時間進行篩選。結(jié)果顯示，在預(yù)培養(yǎng)初期，隨著培養(yǎng)時間的増加，細胞活力迅速上升，在培養(yǎng)3天時達到最高值，隨后開始下降，在第5天開始細胞活力維持在ー個相對穩(wěn)定的階段，在13天時明顯下降。隨著預(yù)培養(yǎng)時間的増加，細胞冷凍后的活力明顯上升；在第4天和第7天，各處理細胞活力達到ー個小高峰，隨后細胞活力開始下降，預(yù)培養(yǎng)時間短于3天時細胞活力明顯偏低，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的延長細胞活力不斷升高并趨于穩(wěn)定，體現(xiàn)了雜交鵝掌楸胚性懸浮細胞對高滲環(huán)境的ー個逐步適應(yīng)的過程。在不同的過渡脫水和脫水時間情況下，在未經(jīng)過復(fù)合玻璃化保護劑處理，直接把預(yù)培養(yǎng) 后的細胞放入液氮中，隨著預(yù)培養(yǎng)時間的増加，細胞的抗性增強，呈上升趨勢，在第8天達到高值，但與經(jīng)過復(fù)合玻璃化保護劑處理后的相比，其活力低于經(jīng)過處理的細胞，可以發(fā)現(xiàn)在過渡脫水lOmin，脫水30min在各個預(yù)培養(yǎng)時間情況下都能活得ー個較高的細胞活力，說明處理對細胞能起到最大限度地保護作用。實施例3
將實施例2儲存胚性懸浮細胞的冷凍盒從液氮中取出，迅速將冷凍管置于不同溫度梯度水浴中，快速化凍2min。吸去冷凍保護劑，向冷凍管加入ImL的清洗培養(yǎng)基(即預(yù)培養(yǎng)基，為O. 6mol/L山梨醇的愈傷增殖培養(yǎng)基)，停留2min，重復(fù)3次洗滌。在本實施例設(shè)置了五個水浴溫度梯度，結(jié)果如圖4所示，發(fā)現(xiàn)復(fù)蘇溫度在37°C時，復(fù)蘇細胞的活力達到最高點。對于雜種馬褂木來說，該溫度條件下，細胞的活力要高于40°C的化凍溫度。通過恢復(fù)培養(yǎng)讓細胞迅速地從逆境條件恢復(fù)到正常培養(yǎng)的環(huán)境中。由于冷凍保護劑是高滲條件(O. 4M蔗糖)，如果滲透壓降低過快將導(dǎo)致細胞過快膨脹，從而對細胞膜產(chǎn)生傷害。因此緩慢地降低滲透壓可以最大限度地提高細胞存活率，該試驗步驟過程如下
第一歩高滲恢復(fù)培養(yǎng)把洗滌后的細胞團物質(zhì)迅速轉(zhuǎn)移到墊有濾紙的高滲恢復(fù)培養(yǎng)基。a.培養(yǎng)時間梯度為l、2、3、4、5、6d，25°C培養(yǎng)。根據(jù)試驗結(jié)果表明，在含0.4M蔗糖
的高滲愈傷増殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d較為合適。b.加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5M濃度的蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓。根據(jù)試驗結(jié)果以蔗糖滲透壓濃度為O. 4M吋，恢復(fù)培養(yǎng)的細胞可以迅速達到良好狀態(tài)，在轉(zhuǎn)到愈傷增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)5d后就可以看到新的愈傷長出。第二歩低滲的恢復(fù)培養(yǎng)
a.培養(yǎng)天數(shù)為l、2、3、4、5、6d，含O. 3M蔗糖的低滲愈傷增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2d較為合適。b.加入0、0. 1,0. 2,0. 3,0. 4,0. 5M濃度的蔗糖調(diào)節(jié)滲透壓，根據(jù)試驗測定在滲透
壓濃度O. 3M時，細胞的恢復(fù)時間最短，在轉(zhuǎn)到愈傷增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)第5d就長出新的愈傷組織，最后轉(zhuǎn)移到愈傷增殖培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)。復(fù)蘇后重新誘導(dǎo)成的體細胞胚胎，經(jīng)過超低溫凍存與復(fù)蘇處理后的胚性材料，在體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)過3個月的體胚發(fā)育過程，如圖4所示，能夠?qū)崿F(xiàn)高頻體細胞胚胎發(fā)生，與沒有凍存的材料發(fā)育過程相一致。
實施例4
將實施例2凍后的胚性懸浮細胞分別接種在添加有l(wèi)mg/L、2mg/L、5mg/L、I Omg/L、20mg/L可溶性淀粉的O. 4M蔗糖愈傷增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)2天后，轉(zhuǎn)到O. 3M蔗糖的愈傷增殖培養(yǎng)基上培養(yǎng)2天，再轉(zhuǎn)到正常生長培養(yǎng)基上。觀察結(jié)果如圖5所示，發(fā)現(xiàn)接種在淀粉培養(yǎng)基上效果最好，細胞恢復(fù)生長的延滯較短，為2 4d，細胞生長迅速。其它兩個處理，許多細胞團要先變成黃褐色，經(jīng)過9 14d的延滯后才開始生長。直接轉(zhuǎn)接在未加可溶性淀粉的培養(yǎng)基上，許多團塊變成白色或者褐色，不能生長。通過試驗加入不同濃度的可溶性淀粉，可以有效地消除濕潤現(xiàn)象，使細胞在進行滲透平衡過程時損傷最小，試驗結(jié)果表明10mg/L體細胞胚胎的發(fā)生頻率高。、
實施例5
在實施例I的預(yù)培養(yǎng)基中加入不同濃度的ABA，通過ABA提高細胞的抗逆性，從而提高細胞的存活率，在本試驗中，在預(yù)培養(yǎng)階段加入不同濃度lmg/L、2 mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的ABA，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)在4mg/L時能顯著地提高細胞的抗凍性，細胞存活率達到了80%。實施例6
在植物的組織、器官和全株實驗中，發(fā)現(xiàn)脯氨酸的積累與抗?jié)B透脅迫之間有顯著的正相關(guān)，可以作為衡量細胞對逆境適應(yīng)能力的指標(biāo)。經(jīng)過不同濃度的山梨醇預(yù)培養(yǎng)后，細胞的抗凍活力有所差異，結(jié)果如圖7所示，在超低溫保存后，O. Γ0. 6mol/L山梨醇培養(yǎng)后的細胞其脯氨酸含量呈直線上升；山梨醇濃度在O. 5,0. 7mol/L處的脯氨酸含量與冷凍前幾乎持平，在O. 6mol/L時脯氨酸含量超過冷凍前并達到最大值。說明超低溫條件下，盡管細胞會部分死亡，但是其體內(nèi)的脯氨酸含量還是會相對的增加用來保護細胞，這也與在O. 6mol/L山梨醇預(yù)培養(yǎng)下超低溫保存后細胞活力最高相一致。在實施例I的預(yù)培養(yǎng)基中，加入脯氨酸后，細胞的存活率隨著濃度增加而提高。如圖8所示，在150mg/L時細胞存活率達到最高值，但脯氨酸含量繼續(xù)增加后，細胞存活率開始下降，說明高濃度脯氨酸可能對細胞產(chǎn)生了一定的毒害作用，導(dǎo)致細胞在外加高濃度脯氨酸情況下，細胞活力快速下降。
權(quán)利要求
1.一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)取待保存的胚性材料，按10%的接種量接入高滲液體培養(yǎng)基，25°C，培養(yǎng)3 10d;其中，高滲液體培養(yǎng)基為添加有O. Γ0. 8mg/L山梨醇的M13基本培養(yǎng)基； (2)過濾步驟(I)預(yù)培養(yǎng)的胚性材料，裝入冷凍管，向冷凍管中加入復(fù)合玻璃化保護劑，(TC，放置脫水O 70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存；復(fù)合玻璃化保護劑為添加30%甘油和30%こニ醇的M13基本培養(yǎng)基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟(I)中，培養(yǎng)6 8d。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟(I)中，在所述的高滲液體培養(yǎng)基中還加有f 5mg/L ABA和5(T200mg/L脯氨酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，其特征在于步驟(2)中，所述的放置脫水，為先用60%復(fù)合玻璃化保護劑保護胚性材料過渡脫水lOmin，然后轉(zhuǎn)到100%復(fù)合玻璃化保護劑脫水l(T60min，然后再投入液氮保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種胚性材料的超低溫冷凍保存方法，包括以下步驟取待保存的胚性材料接種入高滲液體培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)3~10d；過濾胚性材料裝入冷凍管，加入復(fù)合玻璃化保護劑，0℃放置脫水0～70min，然后裝入冷凍盒直接投入液氮速凍，液氮中長期保存即可。本發(fā)明的胚性材料的超低溫冷凍保存方法，操作簡單，方便可行，解決了林木體胚產(chǎn)業(yè)化的重要瓶頸問題，可實現(xiàn)胚性材料長期保存到1年以上，并能使其保持高頻增殖能力，具有很好的實用性，能夠產(chǎn)生很好的經(jīng)濟效益和社會效應(yīng)。
文檔編號A01N3/00GK102657152SQ20121013514
公開日2012年9月12日 申請日期2012年5月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月4日
發(fā)明者施季森, 陳金慧, 龍偉 申請人:南京林業(yè)大學(xué)