一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，包括將魁蚶精液與抗凍液混合稀釋，預(yù)冷后進行分步降溫冷凍，保存2周后，進行解凍激活及活力檢驗；其中所述抗凍液由基礎(chǔ)液、抗凍保護劑和添加劑組成；所述基礎(chǔ)液為滅菌后的天然海水或濃度為0.5mol/L的氯化鈉溶液，所述抗凍保護劑為體積濃度為5%的二甲基亞砜，所述添加劑為海藻糖。本發(fā)明的魁蚶精子長期冷凍保存方法對于魁蚶人工繁育、種質(zhì)保存及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及海洋生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體的說是一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活 方法。 一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法

【背景技術(shù)】
[0002] 魁紺（Scapharca broughtonii Sckrenck)，隸屬于軟體動物門、雙殼綱、紺目、紺 科、毛蚶屬，俗名赤貝、大毛蛤，是一種大型冷水性底棲經(jīng)濟貝類，主要分布在太平洋西北部 日本海、黃海、渤海及東海?？廊赓|(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，深受國內(nèi)外市場的歡迎，是出口創(chuàng)匯 的優(yōu)良品種。上世紀(jì)因為魁蚶的過度開發(fā)導(dǎo)致其野生資源急速下降，加上市場和出口的大 量需求，人工養(yǎng)殖規(guī)模也隨之不斷擴大，對優(yōu)質(zhì)苗種的需求也有增無減。然而近幾年來，由 于累代養(yǎng)殖、近親交配產(chǎn)生了種質(zhì)退化、雜合度降低等一系列問題。種質(zhì)退化及苗種短缺已 經(jīng)成為魁蚶養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的首要制約因素，開展魁蚶良種選育及規(guī)?；绶N繁育的研究迫在 眉睫?？谰映蜏乩鋬霰４婕夹g(shù)對于魁蚶種質(zhì)保存、貝類品的選育、精液長距離運輸?shù)?方面有著重要意義。
[0003] 目前，精子超低溫冷凍保存技術(shù)在海洋動物種質(zhì)細(xì)胞保存研究的范圍主要集中在 魚類和牡蠣等少數(shù)幾種海洋生物。冷凍保存成功的關(guān)鍵在于在慢速降溫過程中使細(xì)胞質(zhì)有 效地脫水和收縮，在投入到液氮中去之前，防止或盡量減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，以把對細(xì)胞 的損傷縮小到最低。因為不同種生物精子的滲透壓、細(xì)胞液離子濃度都不同，所以它們都有 各自相應(yīng)的最佳抗凍液配比、最優(yōu)冷凍降溫速率和最適激活方法，需要大量的實驗才可篩 選得出。相比魚類，貝類的精子冷凍技術(shù)還不是很成熟。不同種貝類的精子冷凍技術(shù)不具有 通用性?，F(xiàn)有的貝類精子技術(shù)中使用的抗凍液組成較為復(fù)雜，配比繁瑣，且稀釋比例較大， 保存的精子濃度較低；抗凍程序多采用二步降溫法，冷凍程序相對粗糙。經(jīng)文獻檢索，未見 與本發(fā)明魁蚶精子超低溫冷凍保存以及激活方法的報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明為了解決魁蚶良種選育中優(yōu)良種質(zhì)的保存、選育及長距離運輸?shù)燃夹g(shù)難 題，提供一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法。該發(fā)明方法中的精子抗凍液配比簡單， 冷凍程序相對精細(xì)，顯著提高了魁蚶冷凍精子的復(fù)活率。
[0005] 為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：
[0006] -種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，具體包括將魁蚶精液與抗凍液混合稀 釋，裝入2. 0ml的凍存管中，預(yù)冷后，進行分步降溫冷凍，保存在液氮中，保存2周后，從液氮 中取出凍存管進行解凍，在激活液中進行精子激活，最后進行活力檢驗；其中所述抗凍液由 基礎(chǔ)液、抗凍保護劑和添加劑組成；所述基礎(chǔ)液為滅菌后的天然海水或濃度為〇. 5mol/L的 氯化鈉溶液，所述抗凍保護劑為體積濃度為5 %的二甲基亞砜（V/V，DMS0體積/抗凍液體 積），所述添加劑為海藻糖。
[0007] 進一步的，所述氯化鈉溶液中氯化鈉的加入量為58. 4g/L。
[0008] 進一步的，所述抗凍液中基礎(chǔ)液與抗凍保護劑的體積比為95% :5%。
[0009] 進一步的，所述添加劑海藻糖的加入量為90g/L。
[0010] 進一步的，所述精液與抗凍液的體積比為1:10。
[0011] 進一步的，所述預(yù)冷是在〇°C預(yù)冷2_5min。
[0012] 進一步的，所述分步降溫冷凍是在程序降溫儀中，在_60°C前降溫速率為-12°C / min,降至-60°C時，平衡2-5min，再以-20°C /min快速降溫至-180°C，迅速投入液氮中保 存。
[0013] 進一步的，所述解凍是將放有精液與抗凍液的凍存管于37-40°C的水浴中解凍 100-110s，然后于室溫下放至完全融化。
[0014] 進一步的，所述激活液為添加了胎牛血清和氯化銨的天然海水，所述胎牛血清的 體積濃度為5% (V/V，胎牛血清/激活液），所述氯化銨的添加量為0. 2g/100ml。
[0015] 進一步的，所述活力檢測是采用計算機輔助分析法（CASA)檢測魁蚶精子的運動 率。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：
[0017] 1.本發(fā)明冷凍保存魁蚶精子，解凍后精子活力高，精子游動率達到了 70%以上， 平均曲線速度均大于150 μ m/s,平均直線速度均大于122 μ m/s。
[0018] 2.本發(fā)明采用滅菌后的天然海水或0. 5mol/L的氯化鈉溶液作為基礎(chǔ)液，相比其 他稀釋液，更為簡單，更容易操作。因其具有較為合適的滲透壓，冷凍效果更好。
[0019] 3.本發(fā)明采用5% (v/v)二甲基亞砜（DMS0)為抗凍保護劑，并加入了 0. 2M海藻 糖作為添加劑，保持較好滲透性的同時又降低了保護劑毒性。二甲基亞砜為滲透性抗凍劑， 可緩解冷凍時細(xì)胞過冷引起的脫水皺縮和復(fù)活時細(xì)胞滲透性腫脹引起的損傷；而海藻糖為 非滲透型抗凍劑，具有不同于其他糖類的生物學(xué)特性，其可以穩(wěn)定生物分子，對細(xì)胞抗脫水 保護和抗高滲保護有著獨特的作用。
[0020] 4.本發(fā)明使用添加了胎牛血清和氯化銨的天然海水來激活經(jīng)冷凍復(fù)蘇的精子，取 得了較好的激活效果，精子易被激活，且游動速度相對較快。

【具體實施方式】
[0021] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下將結(jié)合實施例，對本發(fā) 明作進一步詳細(xì)說明。
[0022] 實施例1 :
[0023] 1)精子的采集：2014年7月23日，正值魁蚶的生殖期，從日照東港養(yǎng)殖場取回45 只魁蚶親貝。經(jīng)解剖鏡檢，選取性腺發(fā)育良好，顯微鏡檢測活力在85%以上的魁蚶雄性個體 進行精子冷凍保存試驗。
[0024] 2)精子激活液的篩選：分別使用天然海水、添加了胎牛血清和氯化銨的天然海 水、添加了胎牛血清和乙酸銨的天然海水、添加了胎牛血清和氫氧化鈉的天然海水來激活 魁蚶鮮精，經(jīng)鏡檢觀察，添加了胎牛血清和氯化銨的天然海水的激活精子效果較好，精子平 均曲線速度為185. 1 μ m/s，平均直線速度為143. 4 μ m/s。數(shù)據(jù)對比見下表。
[0025]

【權(quán)利要求】
1. 一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于：包括將魁蚶精液與抗凍液 混合稀釋，裝入2. Oml的凍存管中，預(yù)冷后，進行分步降溫冷凍，保存在液氮中，保存2周后， 從液氮中取出凍存管進行解凍，然后在激活液中進行精子激活，最后進行活力檢驗；其中所 述抗凍液由基礎(chǔ)液、抗凍保護劑和添加劑組成；所述基礎(chǔ)液為滅菌后的天然海水或濃度為 0. 5 mol/L的氯化鈉溶液，所述抗凍保護劑為體積濃度為5%的二甲基亞砜，所述添加劑為 海藻糖。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于：所 述氯化鈉溶液中氯化鈉的加入量為58. 4g/L。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于： 所述抗凍液中基礎(chǔ)液與抗凍保護劑的體積比為95% :5%。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于：所 述添加劑海藻糖的加入量為90g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于： 所述精液與抗凍液的體積比為1:10。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于：所 述預(yù)冷是在〇°C預(yù)冷2_5min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于： 所述分步降溫冷凍是在程序降溫儀中，在_60°C前降溫速率為-12°C / min，降至-60°C時， 平衡2-5min，再以-20°C /min降溫至-180°C，迅速投入液氮中保存。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于： 所述解凍是將放有精液與抗凍液的凍存管于37-40°C的水浴中解凍ΙΟΟ-llOs，然后于室溫 下放至完全融化。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在于： 所述激活液為添加了胎牛血清和氯化銨的天然海水，所述胎牛血清的體積濃度為5%，所述 氯化銨的添加量為0. 2g/100ml。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的一種魁蚶精子超低溫冷凍保存與激活方法，其特征在 于：所述活力檢測是采用計算機輔助分析法檢測魁蚶精子的運動率。
【文檔編號】A01N1/02GK104145944SQ201410422797
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月25日
【發(fā)明者】宋愛環(huán), 鄒琰, 李翹楚, 王英俊, 辛美麗, 盧珺, 韓龍江, 劉洪軍 申請人:山東省海洋生物研究院