一種牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系的選育方法
【專利摘要】本發(fā)明建立了牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系選育方法，主要包括如下的步驟：遲鈍愛德華氏菌感染牙鲆魚苗及其抗病力測定方法、抗遲鈍愛德華氏菌病群體篩選方法、抗遲鈍愛德華氏菌病家系篩選方法以及抗遲鈍愛德華氏菌病家系特異微衛(wèi)星標記篩選方法等，篩選到抗病家系特異微衛(wèi)星標記；建立了抗病家系后代抗病力和養(yǎng)殖成活率測試方法，創(chuàng)制了牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系。采用本發(fā)明技術(shù)生產(chǎn)的牙鲆苗種具有抗遲鈍愛德華氏菌病能力強、養(yǎng)殖成活率高、死亡率低、生長速度較快的特點，基本解決了牙鲆苗種夏季因感染遲鈍愛德華氏菌而爆發(fā)腹水病引起大量死亡的問題，適合在全國沿海地區(qū)牙鲆養(yǎng)殖場推廣應用。
【專利說明】-種牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系的選育方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的魚類遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種牙鲆抗遲鈍愛德 華氏菌病優(yōu)良品系的選育方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 牙鲆是中國、日本和韓國重要的海水養(yǎng)殖魚類，也是人們喜愛的高蛋白水產(chǎn)品。目 前我國牙鲆的養(yǎng)殖產(chǎn)量大約是每年2萬噸，產(chǎn)值為25-30億元人民幣。除滿足國內(nèi)市場的 需要外，牙鲆還是出口創(chuàng)匯的主要水產(chǎn)品之一。然而，隨著牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，一些問 題相繼出現(xiàn)，特別是病害頻發(fā)、種質(zhì)退化、苗種成活率低等，每年給牙鲆養(yǎng)殖業(yè)造成高達近 10億元人民幣的經(jīng)濟損失，從而極大限制了牙鲆養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。
[0003] 危害牙鲆的主要病害是細菌性和病毒性疾病，尤以細菌性疾病造成的危害最大。 目前牙鲆養(yǎng)殖業(yè)中危害最大的細菌性疾病是由遲鈍愛德華氏菌引起的腹水?。◤垥跃龋?2005 ;朱壯春等，2006)和由鰻弧菌引起的弧菌?。ㄖ茺惖?，1997)。特別是由遲鈍愛德華氏 菌引起的腹水病危害尤為嚴重，導致苗種階段死亡率高達70%以上。一些學者雖然針對鲆 鰈類腹水病的病原和病理開展過一些研究，但這些研究主要是針對自然發(fā)病的病魚進行遲 鈍愛德華氏菌的分離、鑒定及抗菌素類藥物防治等（王印庚等，2007;秦雷等，2009)。盡管 采取抗菌素類藥物等傳統(tǒng)的防病措施對腹水病的治療有一定效果，但仍無法從根本上解決 病害頻發(fā)及其導致的重大經(jīng)濟損失等問題；并且抗菌素類藥物容易在魚體內(nèi)積累、對消費 者的健康具有潛在危害、容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性以及嚴重污染養(yǎng)殖環(huán)境等問題，因此在 魚類養(yǎng)殖業(yè)中的應用越來越受到限制；同時抗菌素的使用也不能滿足人們?nèi)找嬖鲩L的對無 藥物殘留綠色水產(chǎn)品的需求。因此，采用現(xiàn)代生物技術(shù)培育抗遲鈍愛德華氏菌病能力強、 生長速度快的牙鲆新品種，已成為海洋漁業(yè)科技工作者必須解決的重大課題，也是解決牙 鲆病害問題的根本途徑。在海水魚類遺傳育種研究方面，迄今主要在牙鲆、大菱鲆和大黃魚 上開展了人工雌核發(fā)育、單性苗種培育及快速生長良種選育的研究工作（王新成等，1997 ; 王曉清等，2006 ;蘇鵬志等，2008 ;陳松林等，2008)，同時，還開展了一些分子標記篩選和遺 傳多樣性評價、種質(zhì)鑒定以及抗鰻弧菌病相關(guān)MHC基因標記篩選等方面的研究工作，如鄒 曙明等（2000)采用RAH)技術(shù)對牙鲆和大菱鲆養(yǎng)殖群體遺傳結(jié)構(gòu)進行的檢測分析；尤峰 等（2001)采用同工酶技術(shù)對山東近海牙鲆和養(yǎng)殖牙鲆的遺傳多樣性進行的分析；Liu等 (2005a，b)利用微衛(wèi)星標記和AFLP技術(shù)評價牙鲆養(yǎng)殖群體和野生群體的遺傳結(jié)構(gòu)，表明 養(yǎng)殖群體的遺傳多樣性具有一定程度的下降；陳微等（2005)開展了牙鲆微衛(wèi)星標記篩選 和遺傳多樣性的分子研究；張玉喜等（2006)分析了牙鲆抗鰻弧菌病群體和不抗病群體的 MHC基因多態(tài)性，初步篩選到抗鰻弧菌病相關(guān)的MHC基因型。盡管黃海水產(chǎn)研究所陳松林等 人已經(jīng)對牙鲆抗鰻弧菌病群體和家系篩選開展過大量研究，篩選出抗鰻弧菌病群體和家系 (陳松林等，2008)，但這些群體和家系僅僅只是針對鰻弧菌這一單一病原具有一定抗性，因 而還滿足不了牙鲆養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中對抗病家系的迫切需求。因此，抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆家 系的選育就顯得格外重要，也是牙鲆養(yǎng)殖業(yè)中急需攻克的重大課題。而有關(guān)牙鲆抗遲鈍愛 德華氏菌病家系的構(gòu)建及優(yōu)良品系選育技術(shù)，迄今國內(nèi)外尚未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是建立一種牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系選育方法，彌補現(xiàn)有 技術(shù)的不足，為魚類抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品種培育提供技術(shù)方法，解決牙鲆養(yǎng)殖業(yè)中 缺乏抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系選育方法的問題，為魚類養(yǎng)殖業(yè)提供抗病優(yōu)良品系選育 的技術(shù)手段。
[0005] 本發(fā)明牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系選育方法，包括有如下的步驟：
[0006] 1)抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆群體的篩選：采用自然選擇途徑或人工感染途徑篩 選牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病的群體；
[0007] 2)抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆家系的選育：將培養(yǎng)成熟的牙鲆抗愛德華氏菌病群 體進行不同地理群體雜交來建立牙鲆家系，當不同牙鲆家系魚苗生長至10-12厘米時，采 用遲鈍愛德華氏菌對構(gòu)建的家系魚苗進行人工感染，篩選出抗遲鈍愛德華氏菌病家系；
[0008] 3)牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病家系特異微衛(wèi)星標記的篩選：通過牙鲆多態(tài)性微衛(wèi) 星標記引物對篩選出的牙鲆抗病家系進行基因分型，篩選出牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病家系 的特異微衛(wèi)星標記；
[0009] 4)牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病品系的選育：采用篩選到的牙鲆抗病家系與其它家 系進行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特異的微衛(wèi)星標記對建立的牙鲆家系進行鑒 定，篩選出牙鲆抗病家系的后代家系；然后對獲得的后代家系再次進行抗遲鈍愛德華氏菌 感染的篩選，將感染后存活率高的家系確定為抗遲鈍愛德華氏菌病品系；
[0010] 5)通過混合養(yǎng)殖魚苗的成活率高低篩選抗病優(yōu)良品系：采用篩選到的牙鲆抗病 家系與其它家系進行交配，建立抗病家系的后代家系，當各家系魚苗生長至10-12厘米時， 每個家系取200-250尾魚苗進行熒光標記，每個家系標記一種顏色，然后將標記了不同顏 色的家系魚苗混合養(yǎng)殖，混合養(yǎng)殖1年后進行體長、體重測量，統(tǒng)計存活魚的數(shù)量，篩選出 抗遲鈍愛德華氏菌病品系。
[0011] 6)將獲得的抗遲鈍愛德華氏菌病品系作為親本來繁育抗遲鈍愛德華氏菌的牙鲆 苗種。
[0012] 作為優(yōu)選，上述步驟3)中的微衛(wèi)星標記為scaffold774_63384,其核苷酸序列為 SEQ ID NO:1 ;
[0013] 用于檢測微衛(wèi)星標記scaffold774_63384的引物對，其序列信息如下：
[0014] F:GTGACCCTGAGTAGGATAAGCG(SEQ ID NO:2)
[0015] R:GTGTTTACGTGACAAGCACCAC(SEQ ID N0:3)〇
[0016] 上述微衛(wèi)星標記，其一種基因型組成包含有187-189bp和175-177bp的2個等位 基因；另一種基因型包含有183-185bp和175-177bp的兩個等位基因。
[0017] 步驟4)中對獲得的后代家系再次進行抗遲鈍愛德華氏菌感染的篩選，另一種方 法如下：通過混合養(yǎng)殖魚苗的成活率高低篩選抗病優(yōu)良品系：采用篩選到的牙鲆抗病家系 與其它家系進行交配，大量建立抗病家系的后代家系，當各家系魚苗生長至10-12厘米時， 每個家系取200-250尾魚苗進行熒光標記，每個家系標記一種顏色，然后將標記了不同顏 色的家系魚苗混合養(yǎng)殖在同一個水泥池中，混合養(yǎng)殖1年后進行體長、體重測量，統(tǒng)計存活 魚的數(shù)量，計算不同家系的養(yǎng)殖成活率，將養(yǎng)殖成活率高的家系定義為抗病家系，據(jù)此篩選 出抗遲鈍愛德華氏菌病品系。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0018] 圖1 :牙鲆抗病家系的篩選，2007年建立的牙鲆家系魚苗人工感染遲鈍愛德華氏 菌后存活率的比較。橫坐標是家系號，縱坐標是感染后成活率；
[0019] 圖2 :牙鲆抗病家系特異微衛(wèi)星標記的篩選及其在后代中的遺傳
[0020] A:牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病家系特異微衛(wèi)星標記的篩選：采用微衛(wèi)星標記 scaffold774_63384鑒定不同家系電泳圖；圖中有5個家系，每個家系8個個體，依次排列 為40個泳道，其中17-24泳道為抗病家系R)768。由圖可見該標記在R)768家系個體中均 可擴增出兩條DNA條帶，其中較小的條帶（175-177bp)為該家系不同個體所共有，較大的條 帶（187-189bp或183-185bp)在不同的個體中存在兩種形式，每個個體的兩條DNA條帶組 合起來，與其他家系存在明顯不同，可用于區(qū)分H)768家系與其他牙鲆家系。
[0021] B:牙鲆抗病家系特異微衛(wèi)星標記在子代中的遺傳
[0022] 標記scaffold774_63384在R)768家系個體及其后代家系F1323中的DNA電泳圖， M為Marker，1和2為R)768家系中的2個個體，代表2種不同的基因型：AC和BC基因型； 3-9為0768家系的后代F1323家系個體，可見基因型為BC、CC，因此可以推斷，建立F1323 家系所用父母本，其中之一為H)768家系個體，在該位點基因型BC，而來自于其他家系的另 一個體基因型為CC，因而子代中有BC、CC兩種基因型，每個子代個體的其中一條DNA條帶 遺傳自F0768家系的魚（A、B、C三種條帶大小分別為187-189bp、183-185bp和175-177bp)
[0023] 圖3 :牙鲆抗病家系后代魚苗人工感染遲鈍愛德華氏菌后成活率比較
[0024] 橫坐標是家系號，縱坐標是感染后成活率?？共〖蚁礡)768的后代家系F1333、 F1323和F1337在遲鈍愛德華氏菌感染后的存活率顯著高于其他家系，表現(xiàn)出抗遲鈍愛德 華氏菌的能力。
[0025] 圖4 :牙鲆抗病家系后代魚苗在同一水泥池中養(yǎng)殖335-360天后的成活率比較
[0026] 橫坐標是家系號，縱坐標是養(yǎng)殖成活率。2012年建立的53個家系魚苗的養(yǎng)殖存活 率差異顯著，其中2007年建立的抗病家系R)768的后代家系F1228和F1263的養(yǎng)殖存活率 分別為82. 8%和74. 4%，明顯優(yōu)于其他家系。
[0027] 圖5 :不同家系對遲鈍愛德華氏菌感染的反應
[0028] 易感家系在注射遲鈍愛德華氏菌后第3天開始出現(xiàn)死亡，第5?6天進入死亡高 峰期，第8天即達到穩(wěn)定狀態(tài)；抗病家系在注射后第5天開始出現(xiàn)死亡，第6?8天進入死 亡高峰期，第10天達到穩(wěn)定狀態(tài)。易感家系人工感染后，發(fā)病早，死亡迅速，發(fā)病周期短，死 亡率高?？共〖蚁当憩F(xiàn)為發(fā)病晚，死亡慢，發(fā)病周期較長。兩者患病個體癥狀無差異，抗病 家系的最終存活率明顯比易感家系高。

【具體實施方式】
[0029] 本發(fā)明通過長期的研究建立了牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系選育方法，主要 包括如下的步驟：遲鈍愛德華氏菌感染牙鲆魚苗及其抗病力測定方法、抗遲鈍愛德華氏菌 病群體篩選方法、抗遲鈍愛德華氏菌病家系篩選方法以及抗遲鈍愛德華氏菌病家系特異微 衛(wèi)星標記篩選方法等，篩選到抗病家系特異微衛(wèi)星標記；建立了抗病家系后代抗病力和養(yǎng) 殖成活率測試方法，創(chuàng)制了牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系。
[0030] 對于本發(fā)明中所用到的術(shù)語，解釋如下：
[0031] 1、群體：主要指不同地理群體和抗病群體，不同地理群體指中國黃渤海野生群體、 日本牙鲆群體、韓國牙鲆群體等；抗病群體指在遲鈍愛德華氏菌病發(fā)病后自然存活的牙鲆 魚苗以及通過人工感染遲鈍愛德華氏菌后存活的魚苗。
[0032] 2、家系：是由1尾雄魚的精子和1尾雌魚的卵子授精而獲得的魚苗。
[0033] 3、品系：指經(jīng)過2代選育后、性狀穩(wěn)定的豕系。
[0034] 下面結(jié)合附圖，對發(fā)明的方法進行詳細敘述。
[0035] 1.抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆群體的篩選：采用自然選擇途徑或人工感染途徑篩 選牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病的群體。具體事例如下：
[0036] 1)遲鈍愛德華氏菌的培養(yǎng)及其對牙鲆魚苗的感染方法：首先用劃線法將遲鈍愛 德華氏菌接種在TSA培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)24h，挑取單菌落接種于滅菌的TSB液體培養(yǎng) 基中，接種后的培養(yǎng)基放置于震蕩培養(yǎng)箱中，在28°C，200r/min的條件下培養(yǎng)約24h，測定 0D600值，培養(yǎng)至菌液濃度達到I. OOD時，即對數(shù)生長中期，取出菌液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0037] 當牙鲆魚苗生長至10-12厘米時，進行人工感染實驗，實驗前一天停止投喂飼料， 從每個家系中各隨機選取7尾牙鲆個體，平均放到7個濃度梯度的魚缸中，每個濃度梯度共 32尾。用滅菌的PBS溶液把原菌液稀釋到1.00D，測得菌液濃度為4. 33X 109CFU/mL。將 菌液分別按照不稀釋、稀釋50倍、100倍、500倍、1000倍和10000倍建立6個濃度梯度，另 加一個對照組為滅菌PBS溶液，共7組進行感染，各組分別編號為Al、A2、A3、A4、A5、A6和 A7。按照病原菌感染牙鲆魚苗的常規(guī)腹腔接種法進行遲鈍愛德華氏菌的感染。菌液劑量為 0. 2mL/10g體重。感染后觀察魚苗患病情況,記錄魚苗開始死亡時間和死亡魚苗數(shù)量,統(tǒng)計 魚苗存活率。根據(jù)每個濃度梯度的死亡率，結(jié)合實際情況，計算出遲鈍愛德華氏菌對牙鲆的 半致死濃度 LD50 為 3. 69X 105CFU/mL。
[0038] 人工感染前，將培養(yǎng)好的菌液以8000r/min的轉(zhuǎn)速離心15min，每次離心后倒掉上 清液，并用IX PBS吹洗，連續(xù)3次，最后測定0D600的菌液值，將菌液用IX PBS稀釋到上步 所得半致死濃度，進行感染。
[0039] 在確定了遲鈍愛德華氏菌對牙鲆半致死濃度后，從每個家系中隨機抽取75尾個 體，按照〇. 2mL/10g體重的劑量腹腔接種感染半致死濃度的菌液，并設置1次重復實驗。實 驗時水溫控制在（19±1)°C，每個家系實驗用魚獨立養(yǎng)殖，保持正常的流水和通氣。病原菌 感染后每2h觀察一次，記錄每個家系實驗魚的體色變化、活動力大小、攝食強弱、有無發(fā)病 癥狀和死亡時間等信息，及時撈出死魚，測量其全長（從吻端到尾鰭末端）、體重，并剪取鰭 條保存，在感染結(jié)束時，記錄每個家系存活魚的數(shù)目，測量每個個體全長和體重，并剪取少 量鰭條保存。
[0040] 2)抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆群體的篩選
[0041] 通過2種途徑篩選抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆群體。第一種途徑是從牙鲆養(yǎng)殖場發(fā) 病的牙鲆魚苗中選育抗愛德華氏菌病牙鲆群體的方法。每年8-10月份山東等沿海地區(qū)水 溫較高，病原菌較多，牙鲆魚苗極易出現(xiàn)各種疾病，特別是遲鈍愛德華氏菌等細菌性疾病極 易感染魚苗引起腹水病，常常導致養(yǎng)殖的牙鲆魚苗大量死亡，但在一個池塘中總有些抗病 力比較強的魚苗存活下來。因此，通過調(diào)查山東沿海地區(qū)多個牙鲆養(yǎng)殖場的牙鲆魚苗患病 情況，在確認某個養(yǎng)殖池塘的牙鲆魚苗是因遲鈍愛德華氏菌感染后幸存下來的，就將這些 存活下來的魚苗收集起來，一般應選擇那些85-95%以上的魚苗死亡、而只有約5-15%的 魚苗存活下來的池塘收集幸存魚苗進行培養(yǎng)。將這些幸存的抗病魚苗培育成親魚，達到性 成熟，作為牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病群體?？共∪后w一般應由至少100尾以上抗病個體組 成。抗病牙鲆群體的養(yǎng)殖和繁殖按照常規(guī)方法進行。
[0042] 第二種途徑是通過人工感染的途徑制備抗病牙鲆群體，按照1中所述方法對全長 9-12厘米的牙鲆普通魚苗進行遲鈍愛德華氏菌感染，從中篩選出抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆 群體。
[0043] 2.抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆家系的選育
[0044] 將培養(yǎng)成熟的牙鲆抗愛德華氏菌病群體與牙鲆不同地理群體進行雜交，建立牙鲆 家系，當不同牙鲆家系魚苗生長至10-12厘米時，采用遲鈍愛德華氏菌對構(gòu)建的家系魚苗 進行人工感染，比較不同家系魚苗感染后的成活率，篩選出抗遲鈍愛德華氏菌病家系。
[0045] 本發(fā)明中，將培養(yǎng)成熟的牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病群體與不同地理群體（日本群 體和黃渤海野生群體等）進行雜交。將1尾雌魚的50-100毫升卵和1尾雄魚的約0. 1-0. 5 毫升精液授精后放在一個30-40立方米的小網(wǎng)箱中孵化，大約36小時候后，收集孵化出膜 前的胚胎放在1個3立方米的圓形水缸內(nèi)進行育苗，共建立了 40個家系。牙鲆家系的培育 和日常管理按照常規(guī)方法進行。
[0046] 當不同家系魚苗生長至10-12厘米時，采用遲鈍愛德華氏菌等病原菌對各個家系 魚苗進行人工感染。比較不同家系魚苗感染后的成活率，將感染實驗中成活率居前2-4名 的家系的成活率作為確定抗病家系的數(shù)值，比如本發(fā)明中有3個家系的成活率在70%以 上，所以選擇成活率在70%以上的家系為抗病家系，而將成活率在30% -70%的家系確定 為比較抗病家系，成活率為30%以下的定為不抗病家系。
[0047] 從建立的牙鲆家系中選取25個家系進行感染，發(fā)現(xiàn)不同家系感染后的存活率顯 著不同。篩選出感染后成活率在70%以上的家系4個，將其確定為抗病家系，其中存活率最 高的家系其存活率為86. 7% (0768號家系），其次家系感染后存活率為83% (0779家系）， 這2個抗病家系的存活率顯著高于所有家系感染后的平均存活率50.4% (p〈0. 05);篩選出 比較抗病的家系12個，其感染后存活率為30-70% ;篩選出不抗病家系9個，其中0729和 0747號家系的感染后存活率均為0,為最不抗病家系（表1和圖1)。
[0048] 表1 :不同牙鲆家系病原菌感染后的存活率
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病優(yōu)良品系選育方法，其特征在于，所述的方法包括有 如下的步驟： 1) 抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆群體的篩選：采用自然選擇途徑或人工感染途徑篩選牙 鲆抗遲鈍愛德華氏菌病的群體； 2) 抗遲鈍愛德華氏菌病牙鲆家系的選育：將培養(yǎng)成熟的牙鲆抗愛德華氏菌病群體進 行不同地理群體雜交來建立牙鲆家系，當不同牙鲆家系魚苗生長至10-12厘米時，采用遲 鈍愛德華氏菌對構(gòu)建的家系魚苗進行人工感染，篩選出抗遲鈍愛德華氏菌病家系； 3) 牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病家系特異微衛(wèi)星標記的篩選：通過牙鲆多態(tài)性微衛(wèi)星標 記引物對篩選出的牙鲆抗病家系進行基因分型，篩選出牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病家系的特 異微衛(wèi)星標記； 4) 牙鲆抗遲鈍愛德華氏菌病品系的選育：采用篩選到的牙鲆抗病家系與其它家系進 行交配，建立抗病家系的后代家系，采用特異的微衛(wèi)星標記對建立的牙鲆家系進行鑒定，篩 選出牙鲆抗病家系的后代家系；然后對獲得的后代家系再次進行抗遲鈍愛德華氏菌感染的 篩選，將感染后存活率高的家系確定為抗遲鈍愛德華氏菌病品系； 5) 通過混合養(yǎng)殖魚苗的成活率高低篩選抗病優(yōu)良品系：采用篩選到的牙鲆抗病家系 與其它家系進行交配，建立抗病家系的后代家系，當各家系魚苗生長至10-12厘米時，每個 家系取200-250尾魚苗進行熒光標記，每個家系標記一種顏色，然后將標記了不同顏色的 家系魚苗混合養(yǎng)殖，混合養(yǎng)殖1年后進行體長、體重測量，統(tǒng)計存活魚的數(shù)量，篩選出抗遲 鈍愛德華氏菌病品系； 6) 將獲得的抗遲鈍愛德華氏菌病品系作為親本來繁育抗遲鈍愛德華氏菌的牙鲆苗種。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟3)中的微衛(wèi)星標記為 scaffold774_63384,其核苷酸序列為 SEQ ID NO:l。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微衛(wèi)星標記的檢測引物的序列為SEQ ID NO:3 和 SEQ ID NO:4。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微衛(wèi)星標記的一種基因型組成包含 有187-189bp和175-177bp的兩個等位基因。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的微衛(wèi)星標記的一種基因型包含有 183-185bp和175-177bp的兩個等位基因。
6. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中篩選出牙鲆抗病家系的后 代家系，是用人工感染遲鈍愛德華氏菌方式篩選的。
7. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步驟4)中對獲得的后代家系再次進 行抗遲鈍愛德華氏菌感染的篩選，其篩選方法如下：通過混合養(yǎng)殖魚苗的成活率高低篩選 抗病優(yōu)良品系：采用篩選到的牙鲆抗病家系與其它家系進行交配，大量建立抗病家系的后 代家系，當各家系魚苗生長至10-12厘米時，每個家系取200-250尾魚苗進行熒光標記，每 個家系標記一種顏色，然后將標記了不同顏色的家系魚苗混合養(yǎng)殖在同一個水泥池中，混 合養(yǎng)殖1年后進行體長、體重測量，統(tǒng)計存活魚的數(shù)量，計算不同家系的養(yǎng)殖成活率，將養(yǎng) 殖成活率高的家系定義為抗病家系，據(jù)此篩選出抗遲鈍愛德華氏菌病品系。
【文檔編號】A01K61/00GK104304096SQ201410422481
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月26日
【發(fā)明者】陳松林, 張英平, 劉洋, 孫何軍, 田永勝, 王磊, 范彩霞, 高峰濤, 沙珍霞, 王娜 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所