專利名稱：真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法
技術領域：
本發(fā)明屬海洋生物技術領域，具體講把真鯛胚胎通過顆粒冷凍、液氮保存及解凍洗脫，獲取復活胚胎的過程。
背景技術：
魚類胚胎冷凍保存研究約有20年歷史。國內(nèi)外學者對魚類胚胎冷凍保存的損傷機理、冷凍降溫速率、解凍復溫、抗凍劑種類和毒性等方面進行了大量研究，并取得很大進展。目前鯉科魚類胚胎在-100℃以上溫度的冷凍保存已獲得較穩(wěn)定的復活率(張克儉等。三種淡水魚類胚胎低溫保存及其降溫和復溫速率的研究。水產(chǎn)學報1997，21(4)366-372)，鮭鱒魚類胚胎亦突破-25℃的界限(Erdahl，D.A.，Preservation of spermatozoa and ova from freshwater fish.Thesis of the Universityof Minnesota 1986)。鯉魚(Zhang，X.S.，et al.A study on the cryopreservation of commoncarp embryos.Cryo Letters，1989，10271-278)、泥鰍(張克儉等，同上)在液氮區(qū)獲得了個別冷凍復活胚胎，盡管以上實驗還難以重復，但可以說是目前比較好的結(jié)果。由于魚類胚胎尤其是海水魚類胚胎體積大、含有大量的卵黃和水分等特點，給胚胎冷凍保存造成很大困難。顆粒玻璃化方法是基于儀器換熱面積越大、界面的導熱系數(shù)越高，降溫速度就越快的原理而設計的玻璃化方法，以其胚胎獨立冷凍、降溫速度快、操作方便快捷、設備要求簡單等特點而表現(xiàn)了良好的應用前景。真鯛的胚胎冷凍保存對真鯛這種海水名貴魚類的種質(zhì)保存、遺傳多樣性保護和育種及其養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案為一種真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，選擇真鯛心跳期至出膜前期胚胎，不同濃度的抗凍劑中兩步平衡預冷，用玻璃吸管直接將胚胎滴加在置于液氮面上的銅箔片上，快速冷凍形成玻璃化顆粒，然后直接浸入液氮中冷凍，解凍時直接將冷凍顆粒投入到37℃的0.6M的蔗糖溶液中進行，經(jīng)洗脫后轉(zhuǎn)入海水中培育，獲取復活胚胎。
選擇真鯛心跳期胚胎時，真鯛胚胎心跳次數(shù)60-140次/分鐘。
使用抗凍劑時，抗凍劑為甘油，以平衡鹽溶液Cortland為基液，兩步平衡的甘油濃度分別為第一步20％體積濃度和第二步40％體積濃度。
真鯛胚胎在冰箱中預冷時，預冷分兩步進行，溫度為0～4℃，預冷分別為第一步14～16min、第二步25～35s。
冷凍的過程中，使用了厚度為12微米的銅箔片作為冷凍介質(zhì)。
冷凍的過程中，胚胎直接滴加在低溫銅箔片上，形成玻璃化顆粒，顆粒體積0.005-0.01cm3。
冷凍保存的過程中，將胚胎單獨冷凍，以玻璃化顆粒的形式保存于液氮中。
解凍時，解凍與去除抗凍液同步進行，解凍溶液為0.6mol/L蔗糖溶液。
水浴解凍時，解凍溫度37℃，解凍溶液為0.6mol/L蔗糖溶液，至顆粒融化。
洗脫時，在0.6mol/L蔗糖中浸泡4～6分鐘。
本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)真鯛心跳期至出膜前期胚胎與其它時期階段的胚胎相比，對低溫、抗凍劑毒性的耐受力最強；(2)甘油玻璃化形成能力強，對胚胎顆粒冷凍中的抗凍保護作用好。
(3)分兩步平衡降低了抗凍劑對胚胎的毒性，同時可以滿足玻璃化過程高濃度的要求。
(4)銅箔片的導熱性能好，可以大大提高冷卻速度；(5)顆粒滴加，體積小，散熱面積大，沒有冷凍容器的阻隔，有利于快速冷凍；(6)洗脫與解凍同步，二次洗脫避免了抗凍劑對解凍胚胎的毒害作用；本發(fā)明對真鯛心跳期胚胎，通過添加抗凍劑，采用快速顆粒玻璃化冷凍、液氮保存、解凍、洗脫等步驟，獲得復活胚胎。真鯛胚胎冷凍保存對于真鯛的種質(zhì)保存、遺傳多樣性和育種及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
具體實施例方式
本發(fā)明的保護范圍不僅局限于下列實施例中。
(1)撈取同批自然產(chǎn)真鯛受精卵，放置海水溫度18±1℃、微充氣的孵化桶內(nèi)培育，至心跳期胚胎，心跳次數(shù)60次/分鐘以上(60-140次/分鐘)；(2)裝入保溫箱一定量液氮，液面高約10cm，將銅箔片(厚12微米)平放在液氮面上并固定。
(3)用80目篩絹網(wǎng)撈取胚胎，用濾紙輕蘸吸去表面海水，放入甘油體積濃度20％抗凍劑中，平衡鹽溶液Cortland作為基液(即余量，pH＝8.28)，浸泡15min，然后轉(zhuǎn)入甘油體積濃度40％抗凍劑中，平衡鹽溶液Cortland作為基液(即余量，pH＝8.28)，30s后快速進行冷凍。浸泡過程在0～4℃冰箱中進行。
(4)用直徑約1mm的玻璃吸管吸取一粒浸泡過的胚胎，快速滴加在銅箔片上，會立即形成體積約0.005-0.01cm3的透明玻璃化顆粒。
(5)反復多次進行以上顆粒冷凍，將冷凍顆粒導入置于液氮中的銅箔片槽中；(6)解凍時將銅箔片槽中的顆粒倒入到溫度為37℃的0.6M的蔗糖溶液中，顆粒很快融化，而后將胚胎用篩網(wǎng)過濾出來，再放入0.6M的蔗糖溶液中室溫洗脫5min后轉(zhuǎn)入海水中，觀察胚胎形態(tài)及存活情況。
(7)在48粒顆粒冷凍的胚胎中，復活胚胎為16粒，復活率為33.3％，11粒孵化出膜發(fā)育至仔魚，孵化率68.8％。
另外，經(jīng)試驗，真鯛胚胎在冰箱中預冷時，溫度為0～4℃，二步預冷時間可以分別為第一步14～16分鐘、第二步25～35秒；洗脫時，在0.6mol/L蔗糖中浸泡4～6分鐘，亦可達到本發(fā)明目的，由于其實施較為簡單，故不再贅述。
權利要求
1.一種真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于選擇真鯛心跳期至出膜前期胚胎，不同濃度的抗凍劑中兩步平衡預冷，用玻璃吸管直接將胚胎滴加在置于液氮面上的銅箔片上，快速冷凍形成玻璃化顆粒，然后直接浸入液氮中冷凍，解凍時直接將冷凍顆粒投入到37℃的0.6M的蔗糖溶液中進行，經(jīng)洗脫后轉(zhuǎn)入海水中培育，獲取復活胚胎。
2.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于選擇真鯛心跳期胚胎時，真鯛胚胎心跳次數(shù)60-140次/分鐘。
3.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于使用抗凍劑時，抗凍劑為甘油，以平衡鹽溶液Cortland為基液，兩步平衡的甘油濃度分別為第一步20％體積濃度和第二步40％體積濃度。
4.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于真鯛胚胎在冰箱中預冷時，預冷分兩步進行，溫度為0～4℃，預冷分別為第一步14～16min、第二步25～35s。
5.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，冷凍的過程中，其特征在于使用了厚度為12微米的銅箔片作為冷凍介質(zhì)。
6.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于冷凍的過程中，胚胎直接滴加在低溫銅箔片上，形成玻璃化顆粒，顆粒體積0.005-0.01cm3。
7.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于冷凍保存的過程中，將胚胎單獨冷凍，以玻璃化顆粒的形式保存于液氮中。
8.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于解凍時，解凍與去除抗凍液同步進行，解凍溶液為0.6mol/L蔗糖溶液。
9.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于水浴解凍時，解凍溫度37℃，解凍溶液為0.6mol/L蔗糖溶液，至顆粒融化。
10.根據(jù)權利要求1所述真鯛胚胎顆粒玻璃化冷凍保存方法，其特征在于洗脫時，在0.6mol/L蔗糖中浸泡4～6分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬海洋生物技術領域，具體講把真鯛胚胎通過顆粒冷凍、液氮保存及解凍洗脫，獲取復活胚胎的過程。本發(fā)明對真鯛心跳期胚胎，通過添加抗凍劑，采用快速顆粒玻璃化冷凍、液氮保存、解凍、洗脫等步驟，獲得復活胚胎。真鯛胚胎冷凍保存對于真鯛的種質(zhì)保存、遺傳多樣性和育種及可持續(xù)養(yǎng)殖等方面有著重要意義。
文檔編號A01K67/033GK1748494SQ20041005041
公開日2006年3月22日 申請日期2004年9月15日 優(yōu)先權日2004年9月15日
發(fā)明者丁福紅, 李軍, 肖志忠 申請人:中國科學院海洋研究所