專利名稱：一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍保存方法及其冷凍載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種人體、動物或其局部的保存方法及其冷凍載體，尤其涉及一種卵
母細胞/胚胎玻璃化冷凍保存方法及其冷凍載體。
背景技術(shù)：
自從Rall等(1985)發(fā)明胚胎玻璃化冷凍保存方法以來，使冷凍勿需借助冷凍儀， 可在室溫下進行操作，程序得到極大地簡化。后經(jīng)許多研究者的改進，目前卵母細胞/胚胎 的玻璃化冷凍方法僅需1分鐘左右即可完成一個程序。在此過程中，許多研究者創(chuàng)造性地 發(fā)明了許多冷凍的承載物體，并被命名為多種方法。如今常用的主要有以下幾種方法尼龍 環(huán)玻璃化法(Cryoloop)、開放式拉管法(0PS， Open Pulled Straw)、微細玻璃管法(GMP)、 微滴法(Microdrops)、半細管法(hemi-straw)。 尼龍環(huán)玻璃化法(Cryoloop)是將卵母細胞/胚胎在低濃度冷凍液中處理，然后將 卵母細胞/胚胎移到附有玻璃化液的尼龍環(huán)液膜(直徑O. 5-0. 7mm)上，將環(huán)投入浸在液氮 中的冷凍管內(nèi)，具有降溫速度快、冷凍損傷小的優(yōu)點。但該方法一次冷凍卵母細胞/胚胎數(shù) 量有限，且需要特殊的冷凍管固定裝置才易于長期保存。 0PS法是丹麥人Vajta. G于1996年發(fā)明的一種快速降溫的玻璃化冷凍保存方法， 它使用拉得很細的薄壁塑料細管，利用毛細管的虹吸現(xiàn)象將極微量冷凍液滴連同卵母細胞 /胚胎一起吸入毛細管內(nèi)后直接投入液氮。該方法的優(yōu)點是具有快速的升溫和降溫速率， 從而減少冷凍損傷，操作更加簡便，可迅速裝管和解凍以及去除保護劑；卵母細胞/胚胎處 于0PS管中，在少量的高濃度保護液中凍存，有利于減輕冷凍保護劑對卵母細胞/胚胎的毒 性。但由于細管重量較輕冷凍時易漂浮在液氮面；另外細管管壁較薄，在液氮中極易斷裂而 造成卵母細胞/胚胎丟失，不利于卵母細胞/胚胎的長期保存。 微細玻璃管(GMP)法是由Kong等(2000)發(fā)明，它是將外徑為1. 00mm(內(nèi)徑O. 8mm) 的毛細玻璃管拉制成外徑大約為0.3mm的玻璃細管(GMP)作為冷凍工具。其冷凍過程與 0PS法相似，也是利用虹吸效應(yīng)將卵母細胞/胚胎以及冷凍液裝入GMP管中，然后直接投入 液氮保存，解凍過程也與0PS法相同。該法的優(yōu)點是GMP的直徑比0PS的小，冷凍時吸入的 冷凍液的量也少；又因其重量較大，能夠克服OPS在冷凍時漂浮在液氮面上的欠缺。但該法 最高冷卻速率限制在20000°C /min左右，易造成卵母細胞/胚胎損傷；GMP在冷凍中容易斷 裂，造成卵母細胞/胚胎丟失；另外GMP的直徑和體積很小，限制了一次冷凍卵母細胞/胚 胎的數(shù)量；而且GMP的虹吸效果十分顯著，這也增加了操作的難度。 微滴法(Microdrops)首先由landa等(1990)發(fā)明。在微滴法冷凍過程中，卵母細 胞/胚胎在冷凍液中短時間平衡后，將含有卵母細胞/胚胎的冷凍小滴(體積約為6 i！ L)， 直接滴入液氮。然后用經(jīng)液氮冷卻過的鑷子將顆粒集中到冷凍小瓶，置液氮罐中保存。解 凍時，只需將冷凍顆粒直接投入一定的解凍液中，然后對卵母細胞/胚胎進行回收，并脫出 抗凍保護劑。該法的優(yōu)點是降溫速度快，操作簡便。但由于微滴法小滴在貯存過程中無法 進行標識，不利于卵母細胞/胚胎的長期貯存。
3
vavdcrvorst等(2001)首先報道了半細管玻璃化冷凍法(hemi-straw)，該法是 將0. 25mL的細管末端用解剖刀切去大約lcm長，使其成為一個開口的末端，這樣可以將含 有卵母細胞/胚胎的冷凍液直接移入細管開口末端的內(nèi)表面，移入液體的體積要盡可能小 (1. 0 L)。然后直接將細管垂直地投入液氮，而后移入放置在液氮中貼有標簽的0. 5mL冷 凍管中保存。該法的優(yōu)點是半細管使冷凍液直接與液氮接觸極大地提高了冷凍速度，而且 具有易于貯存的優(yōu)點；缺點是操作較難，需要有操作熟練的技術(shù)人員，不太適用于初學者。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是開發(fā)一種操作簡單、速度快、效率高的卵母細胞或胚胎玻璃化冷 凍方法及其冷凍載體。 為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下技術(shù)方案 —種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍保存方法，包括冷凍液配制步驟、解凍液配制步 驟、冷凍步驟和解凍步驟，其特征在于，所述冷凍步驟和解凍步驟中所用的冷凍載體為冷凍 網(wǎng)。 所述冷凍液配制步驟包括配制冷凍預處理液以PBS為基礎(chǔ)液，加入乙二醇，配 制成按體積比為5% 10%的乙二醇冷凍預處理液；和配置冷凍保存液以PBS為基礎(chǔ)液， 加入聚蔗糖、蔗糖和乙二醇，配制成聚蔗糖按體積比為30%、蔗糖濃度為0. 5mol/L、乙二醇 按體積比為30% 40%的EFS30 40冷凍保存液。 所述冷凍保存液還包括EDFS30 40、 GFS30 50、 EDT30 40或其他玻璃化冷 凍液。 所述解凍液配置步驟為以PBS為基礎(chǔ)液，加入蔗糖，配制成O. 3 0. 5mol/L的蔗 糖溶液。 所述冷凍步驟為在室溫20 251:條件下，將卵母細胞/胚胎移入5% 10%的 乙二醇冷凍預處理液中平衡30 60秒，然后移入EFS30 40玻璃化冷凍保存液中平衡 25 30秒，經(jīng)反復洗滌卵母細胞/胚胎，隨后將含有卵母細胞/胚胎的玻璃化小液滴移到 冷凍網(wǎng)上直接投入液氮冷凍保存。 所述解凍步驟為將冷凍網(wǎng)由液氮中取出后直接浸入O. 3 0. 5mol/L的蔗糖溶液 中，將回收后的卵母細胞/胚胎移入新鮮的蔗糖液滴中平衡5 10分鐘后，再移入操作液 中備用。 所述冷凍網(wǎng)包括網(wǎng)體和網(wǎng)柄。
所述網(wǎng)體的孔徑為40-100 ii m。 所述網(wǎng)體由金屬、尼龍或其他材料制成；所述網(wǎng)柄由金屬、塑料或其他材料制成。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于(l)成本低、操作簡單，制作冷凍網(wǎng)的 材料為細銅絲和塑料細管，材料來源廣，價格低；操作過程中可在室溫(20-25°C )下操作， 避免了傳統(tǒng)冷凍法中使用程序冷凍儀的高額費用及繁瑣程序；(2)冷凍速度快、效率高，冷 凍液可直接與液氮接觸，減小了卵母細胞/胚胎的冷凍損傷；傳統(tǒng)的0PS法、微細玻璃管法、 尼龍環(huán)玻璃化法一次冷凍的卵母細胞或胚胎的數(shù)量較少，而本方法克服了此問題，并且冷 凍效果與其他方法沒有差異；(3)堅固耐用、可重復利用、便于貯存，卵母細胞或胚胎的承 載物為特制的銅網(wǎng)，不會發(fā)生像0PS或GMP法中出現(xiàn)的因細管斷裂而造成的丟失現(xiàn)象，并且
4卵母細胞/胚胎解凍后將銅網(wǎng)洗凈可重復利用，可以節(jié)約成本；另外可在柄部對卵母細胞/ 胚胎的類別、數(shù)量加以標識，便于長期貯存。


圖1為本發(fā)明所用冷凍網(wǎng)的示意圖。
具體實施例方式
下面通過具體實施例對本發(fā)明進行進一步闡述。 (1)EFS30 40玻璃化冷凍保存溶液、冷凍預處理液及解凍液。 ①EFS30 40玻璃化冷凍保存溶液以PBS為基礎(chǔ)液，加入聚蔗糖、蔗糖和乙二
醇，配制成聚蔗糖按體積比為30%、蔗糖濃度為0. 5mol/L、乙二醇按體積比為30% 40%
的EFS30 40冷凍保存液。 ②冷凍預處理液為5% 10%的乙二醇(Ethylene glycol :EG):以PBS為基礎(chǔ) 液，加入乙二醇，配制成按體積比為5% 10%的乙二醇冷凍預處理液。
③解凍液為0. 3 0. 5mol/L的蔗糖(Sucrose)溶液以PBS為基礎(chǔ)液配制成 0. 3 0. 5mol/L的蔗糖溶液，作為解凍液。 (2)冷凍在室溫(20 25°C)條件下，將卵母細胞/胚胎移入5% 10%的乙二 醇冷凍預處理液中平衡30 60秒，然后移入EFS30 40玻璃化冷凍保存液中平衡25 30秒，此時反復吹吸卵母細胞/胚胎，以促使預處理液和玻璃化冷凍保存溶液充分的滲入 到卵母細胞/胚胎內(nèi)部，隨后將含有卵母細胞/胚胎的玻璃化小液滴移到冷凍網(wǎng)上直接投 入液氮冷凍保存。 (3)解凍將冷凍網(wǎng)由液氮中取出后直接浸入0. 3 0. 5mol/L的蔗糖溶液中，將 回收后的卵母細胞/胚胎移入新鮮的蔗糖液滴中平衡5 10分鐘后，再移入操作液中備 用。 上述的EFS30 40可以用EDFS30 40、GFS30 50或EDT30 40代替，當然也 可以選用其他玻璃化冷凍液。 本發(fā)明的核心在于提供了一種新型的冷凍載體——冷凍網(wǎng)并用于卵母細胞/胚胎 的玻璃化冷凍保存和解凍。我們采用細銅絲和塑料細管制成孔徑為40-100 ii m的銅網(wǎng)，如 圖l所示的冷凍網(wǎng)(Cryonet)，其包括網(wǎng)體和網(wǎng)柄兩個部分，其材質(zhì)可以都是銅，網(wǎng)柄的材 質(zhì)也可以是塑料，網(wǎng)體的材質(zhì)也可以是尼龍，以提高胚胎和卵母細胞玻璃化冷凍保存效果。 用本方法對427枚Mil期小鼠卵母細胞進行玻璃化冷凍保存，回收413枚，回收率96. 7% (413/427);可用399枚，可用率96. 6% (399/413)，解凍后對215枚卵母細胞進行IVF，卵 裂178枚，卵裂率82.8% (178/215)，獲囊胚93枚，囊胚率43. 3% (93/215)。與0PS法冷 凍相比，卵裂率(81.3%，52/64)和囊胚率(46.9%，30/64)均差異不顯著。用本方法對小 鼠的早期囊胚進行玻璃化冷凍保存，胚胎回收率96. 0% (72/75)，可用68枚，可用率94. 4% (68/72)，對6只小鼠進行移植，共有2只妊娠產(chǎn)仔。證明這種冷凍解凍方法是簡便可行的。
最后所應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參 照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明 的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍之中,
權(quán)利要求
一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍保存方法，包括冷凍液配制步驟、解凍液配制步驟、冷凍步驟和解凍步驟，其特征在于，所述冷凍步驟和解凍步驟中所用的冷凍載體為冷凍網(wǎng)。
2. 如權(quán)利要求l所述的保存方法，其特征在于， 所述冷凍液配制步驟包括配制冷凍預處理液以PBS為基礎(chǔ)液，加入乙二醇，配制成按體積比為5% 10%的乙 二醇冷凍預處理液；和配置冷凍保存液以PBS為基礎(chǔ)液，加入聚蔗糖、蔗糖和乙二醇，配制成聚蔗糖按體 積比為30%、蔗糖濃度為0. 5mol/L、乙二醇按體積比為30% 40%的EFS30 40冷凍保存液。
3. 如權(quán)利要求2所述的保存方法，其特征在于，所述冷凍保存液還包括EDFS30 40、GFS30 50、EDT30 40或其他玻璃化冷凍液。
4. 如權(quán)利要求l所述的保存方法，其特征在于，所述解凍液配置步驟為以PBS為基礎(chǔ)液，加入蔗糖，配制成0. 3 0. 5mol/L的蔗糖溶液。
5. 如權(quán)利要求l所述的保存方法，其特征在于，所述冷凍步驟為在室溫20 251:條件下，將卵母細胞/胚胎移入5% 10%的乙二 醇冷凍預處理液中平衡30 60秒，然后移入EFS30 40玻璃化冷凍保存液中平衡25 30秒，經(jīng)反復洗滌卵母細胞/胚胎，隨后將含有卵母細胞/胚胎的玻璃化小液滴移到冷凍網(wǎng) 上直接投入液氮冷凍保存。
6. 如權(quán)利要求l所述的保存方法，其特征在于，所述解凍步驟為將冷凍網(wǎng)由液氮中取出后直接浸入0. 3 0. 5mol/L的蔗糖溶液中， 將回收后的卵母細胞/胚胎移入新鮮的蔗糖液滴中平衡5 10分鐘后，再移入操作液中備 用。
7. —種如權(quán)利要求1所述保存方法中使用的冷凍網(wǎng)，其特征在于， 所述冷凍網(wǎng)包括網(wǎng)體和網(wǎng)柄。
8. —種如權(quán)利要求7所述的冷凍網(wǎng)，其特征在于， 所述網(wǎng)體的孔徑為40-100 ii m。
9. 一種如權(quán)利要求7或8所述的冷凍網(wǎng)，其特征在于， 所述網(wǎng)體由金屬、尼龍或其他材料制成；所述網(wǎng)柄由金屬、塑料或其他材料制成。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種人體、動物或其局部的保存方法及其冷凍載體，尤其涉及一種卵母細胞/胚胎玻璃化冷凍保存方法及其冷凍載體。所述方法包括冷凍液配制步驟、解凍液配制步驟、冷凍步驟和解凍步驟，其特征在于，所述冷凍步驟和解凍步驟中所用的冷凍載體為冷凍網(wǎng)，所述冷凍網(wǎng)包括網(wǎng)體和網(wǎng)柄。本發(fā)明提供了一種操作簡單、速度快、效率高的卵母細胞或胚胎玻璃化冷凍方法及其冷凍載體。
文檔編號A01N1/02GK101779623SQ20101012279
公開日2010年7月21日 申請日期2010年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月11日
發(fā)明者侯云鵬, 朱士恩, 李俊杰, 王彥平 申請人:中國農(nóng)業(yè)大學