專利名稱：調控哺乳動物毛色表型的載體及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及一種哺乳動物毛色表型的調控方法，更具體涉及含有miR-137基因的調控哺乳動物毛色表型的載體及其應用。
背景技術：
在毛紡行業(yè)中毛色是被毛最重要的經(jīng)濟性狀之一，越來越多得受到了人們的關注，而且對毛色的調控必將在毛紡染色行業(yè)產生深遠意義。被毛的顏色主要取決于沉著于皮膚、毛球等處的黑色素合成、運輸和分布情況。在細胞水平，黑色素細胞合成黑色素，其位于表皮的底層，并且有規(guī)律的穿插在角質化細胞間。分泌的黑色素包含體被稱為黑素體，運 輸出黑素細胞進入鄰近的角質化細胞，在那里可以發(fā)現(xiàn)大量的黑色素。眾所周知，色素沉著的差異變化由引起的黑素體數(shù)量、大小、組成以及與在角質化細胞中的分布有關。雖然已知有些因素，例如α-MSH，MClR和MITF等影響產生黑色素，但決定被毛顏色的黑色素生成的分子機制過于復雜，仍然沒有研究清楚?，F(xiàn)在毛色改變主要集中在毛色形成路徑上基因的突變導致，但這種變化是一種劇烈的，病態(tài)的變化，如白化病和白癜風的發(fā)生等，并不能得到真正意義上的人為毛色控制。哺乳動物毛色表型的控制到目前為止沒有有效的方法進行人為控制，即便利用長期育種的方法改良被毛性狀，也會是一種單一的表型變化且此法耗時、費錢、效果甚微，具有較高的不確定性。

發(fā)明內容
本發(fā)明針對現(xiàn)有哺乳動物毛色表型的控制的不足之處，提供一種新的調控方法，為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，擬采用如下的技術方案一種載體，其序列中包括3個串聯(lián)的pre-mir-137基因序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的載體含有SEQ NO I的序列。本發(fā)明另一方面還涉及含有上述載體的試劑盒，所述的試劑盒包括轉染試劑和緩沖溶液。本發(fā)明另一方面還涉及上述載體在調控黑色素細胞中黑色素的表達中的應用，所述的黑色素細胞可以是離體細胞，也可以是動物體內的黑色素細胞，所述的調控優(yōu)選是下調黑色素的表達。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的調控是通過調節(jié)黑色素細胞中MITF的表達進行調控。本發(fā)明另外一方面還涉及上述載體在調控MITF的表達中的應用。本發(fā)明另一方面還涉及一種調節(jié)哺乳動物毛色表型的方法，其特征在于將上述載體制成注射液，然后通過顯微注射的方式轉入到哺乳動物的胚胎中，生長發(fā)肓產生哺乳動物。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，所述的哺乳動物優(yōu)選是小鼠。
本發(fā)明的載體轉染效率聞，能夠實現(xiàn)并極大的提聞調節(jié)哺乳動物毛色表型的幾率，動物表型變化明顯但又控在人為控制范疇之內，是一種較為緩和而有效的調控模式，能夠在產業(yè)上大范圍使用，具有良好的市場前景。在本發(fā)明中，miR-137是指microRNA_137,其序列是現(xiàn)有技術已知的；Pre-miR-137是指miR-137的前體序列，其序列為SEQ NO 2或3，兩者為互補序列；MITF 是指 Micropthalmia-associated transcription factor (小眼畸形相關轉錄因子)。


圖I :MiR_137高效轉染小鼠原代黑色素細胞系；圖2 :MiR-137轉基因小鼠MITF，TYR，TYRP-1和TYRP-2表達發(fā)生表化.(D)轉基因小鼠MITF，TYR. TYRP-I, TYRP2蛋白表達發(fā)生改變.(E)轉基因小鼠和野生型小鼠miR-137表達水平比較結果(F) (G) (H) (I)轉基因小鼠 MITF，TYR. TYRP-I, TYRP2 Real-time PCR 結果;圖3 :典型的miR-137轉基因小鼠和野生型小鼠毛色表型比較。
具體實施例方式I. mir-137在原代黑色素細胞系轉染為了證明mir-137和MITF及其下游基因是否存在相互影響的關系，通過分子生物學的常規(guī)方法使用質粒PcDNA 6. 2-GW/EmGFPmiR、pre-mir-137,和報告基因構建了pre-mir-137 表達載體，并在 pcDNA 6. 2-GW/EmGFPmiR 上串聯(lián)了 3 個 pre-mir-137。我們設計了原代黑色素細胞陰性對照組，空載組和實驗組，在對數(shù)生長期分別進行轉染，結果發(fā)現(xiàn)陰性對照組和空載組MITF及其下游基因無明顯變化，實驗組miR-137被極顯著的提高，如圖I所示。經(jīng)統(tǒng)計，達到對照組的17倍，而MITFmRNA沒有顯著變化，對所轉染細胞進行蛋白抽提后，western bolt結果顯示MITF蛋白量明顯下降,僅為對照組的1/2。對調控的黑色素合成路徑上MITF下游基因進行檢測發(fā)現(xiàn)TYR、TYP1和TYRP2均出現(xiàn)顯著下降，如圖2所示。結果顯示，miR-137的高表達通過MITF間接調控了黑色素合成路徑上黑色素合成關鍵酶的轉錄，影響黑色素細胞合成黑色素的量，從而影響毛色表型變化。為了近一步驗證miR-137表達量與色素合成量之間的關系，我們對黑色素細胞設計了 3個不同劑量的實驗組同時進行轉染，結果顯示，高轉染組miR-137表達量分別為中轉染組和低轉染組miR-137表達量的A倍，B倍，MITF和其下游基因進行檢測發(fā)現(xiàn)均出現(xiàn)不同程度的變化，黑色素合成量miR-137高轉染組明顯要少于中轉染組和低轉染組，暗示了miR-137的表達量和黑色素細胞合成黑色素的量存在相關性，這種相關性可能與動物毛色表型變化有著內在的聯(lián)系。2. Mir-137轉基因小鼠毛色表型為了探索mir-137對活體動物毛色變化是否具有調控作用，采用轉基因原核注射法將上述含有串聯(lián)pre-mir-137基因序列的表達載體(5ng/μ 1，飽和劑量注射)注射到小鼠胚胎，生長發(fā)肓產生小鼠，并進行繁殖傳代。轉基因后共獲得五個轉基因品系，185只Fl代小鼠，PCR確定其基因型，對Fl代mir-137陽性小鼠進行了實驗。對轉基因小鼠與野生型小鼠繁殖率和存活率進行比較，顯示沒有明顯差異。為了分析轉基因表達是否影響了色素生成和毛色表型，肉眼觀察，轉基因小鼠中45只小鼠被毛呈現(xiàn)了灰色，7只小鼠被毛呈現(xiàn)棕黑色，其他68只仍為黑色(圖3展示了部分典型照片)。同時，我們采用分光光度法對所有實驗小鼠被毛黑色素(可溶性黑色素)含量進行了提取測定，結果說明，所有mir-137轉基因小鼠被毛中的黑色素含量均有不同程度的減少。3. Mir-137轉基因小鼠皮膚中毛色基因的表達為了揭示mir-137轉基因小鼠被毛表型發(fā)生變化的內在因素，首先使用定量PCR對miR-137轉基因小鼠皮膚miR-137和M ITF表達量進行了檢測，結果顯示miR-137轉基因小鼠miR-137表達量顯著高于野生型小鼠，而MITFmRNA表達量與野生型小鼠無明顯差異。使用基因芯片對miR-137轉基因鼠和野生型鼠皮膚差異表達基因進行了篩選，同時，使用定量PCR對小鼠皮膚差異表達基因進行了檢測。發(fā)現(xiàn)多個基因存在差異表達，其中TYR、TYRPl和TYRP2與毛色有關的基因表達差異顯著，而其中僅有MITF為miR-137的目標基因，這些與毛色有關基因存在于a-MSH/MC1R( a-melanocyte stimulating hormone/melanocortin 1-receptor)通路上。免疫組化和Western bolt結果顯示具有活性黑色素細胞數(shù)量明顯減少，MITF蛋白量顯著下降，并檢測了色素生成路徑上MITF調節(jié)的酶TYR、TYRPl和TYRP2，均出現(xiàn)不同程度的表達減少。MiR-137的過量表達通過MITF間接影響到了黑色素細胞的分化成熟，干擾了色素合成路徑，導致色素合成減少，從而使毛色由深變淺。通過本發(fā)明的實施例，證明了單一 miR-137的重要作用。MiR-137轉基因小鼠顯示了 miR-137可以調節(jié)毛色表型的變化，提供了一種調控毛色表型的新途徑。分子機制分析可見，miR-137可以轉錄后下調MITF的表達，從而降低TYR，TYPl，TYRP2等的轉錄，進而溫和的調控了小鼠皮膚和被毛的黑色素合成。應當理解的是，上述具體實施方式
僅是例舉性說明，而不是對本發(fā)明的限制，對本領域普通技術人員來說，可以根據(jù)上述說明加以改進或變換，而所有這些改進和變換都應屬于本發(fā)明所附權利要求的保護范圍。
權利要求
1.一種載體，其序列中包括3個串聯(lián)的pre-mir-137基因序列。
2.根據(jù)權利要求I所屬的載體，所述的載體含有SEQNO 1的序列。
3.含有權利要求I或2所述的載體的試劑盒，所述的試劑盒包括轉染試劑和緩沖溶液。
4.權利要求I或2所述的載體在調控黑色素細胞中黑色素的表達中的應用，所述的黑色素細胞可以是離體細胞，也可以是哺乳動物體內的黑色素細胞，所述的調控優(yōu)選是下調黑色素的表達。
5.根據(jù)權利要求4所屬的應用，所述的調控是通過調節(jié)黑色素細胞中MITF的表達進行調控。
6.權利要求I或2所述的載體在調控MITF的表達中的應用。
7.一種調節(jié)哺乳動物毛色表型的方法，其特征在于將權利要求I或2所述的載體制成注射液，然后通過顯微注射的方式轉入到哺乳動物的胚胎中，生長發(fā)肓產生哺乳動物。
8.根據(jù)權利要求7所述的方法，所述的哺乳動物優(yōu)選是小鼠。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種含有mir-137基因前體序列的載體及其調控哺乳動物毛色表型中的應用。本發(fā)明的載體轉染效率高，能夠實現(xiàn)并極大的提高調節(jié)哺乳動物毛色表型的幾率，動物表型變化明顯但又控在人為控制范疇之內，是一種較為緩和而有效的調控模式，能夠在產業(yè)上大范圍使用，具有良好的市場前景。
文檔編號A01K67/027GK102618576SQ20121006241
公開日2012年8月1日 申請日期2012年3月12日 優(yōu)先權日2012年3月12日
發(fā)明者于秀菊, 王海東, 田雪, 耿建軍, 范瑞文, 董常生, 賀俊平, 赫曉燕 申請人:山西農業(yè)大學