專利名稱：一種具有自生固氮能力的土壤桿菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有自生固氮能力的土壤桿菌，該土壤桿菌用紫外線-等離子體復合誘變獲得，具有抗重金屬生長的能力，可用于土壤重金屬污染環(huán)境治理，屬于微生物應用技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
重金屬污染是指由重金屬或其化合物造成的環(huán)境污染，主要由采礦、廢氣排放、污水灌溉等人為因素所致。近年來，隨著人口的增長、工業(yè)的快速發(fā)展、化肥與農(nóng)藥等的大量使用，使得土壤重金屬污染日益加劇。Cd是一種毒性很大的重金屬，震驚世界的日本“痛痛病”就是因鎘污染而致。鎘會取代骨中的鈣，使骨骼軟化，骨頭寸斷；鎘還會引起胃腸功能失調(diào)，干擾人體和生物體內(nèi)鋅的酶系統(tǒng)，導致高血壓。鎘對人體組織和器官的毒害是多方面的，且治療極為困難。因此，各國對工業(yè)排放“三廢”中的鎘都作了極嚴格的規(guī)定。日本規(guī)定大米含鎘超過I毫克/公斤即為“鎘米”，禁止食用。日本環(huán)境廳規(guī)定O. 3ppm為大米中鎘濃度的最高正常含量。目前，用于土壤重金屬污染修復的技術(shù)主要有物理修復、化學修復和生物修復法。物理修復法處理效果較好，但是工程量大，成本高?；瘜W修復法主要包括化學改良、表面活性劑清洗和有機質(zhì)改良等方法。其優(yōu)點是操作簡單，成本較低，缺點是沒有從根本上除掉重金屬，而且加入的改良劑具有二次污染的風險。生物修復包括動物修復、植物修復、微生物修復和微生物與植物聯(lián)合修復等。植物提取是目前研究最多的修復方法，該法是利用超累積重金屬的植物吸收土壤中的重金屬離子，將重金屬離子大量富集在植物的地上部分，通過收割或拔除植物的地上部分減少和去除土壤重金屬。已報導的超累積植物有遏藍菜屬、燕麥草、印度芥菜、油菜、紫花苜蓿、紫穗槐等，目前主要用于去除污染土壤中的Pb、cd等。該法的優(yōu)點是修復徹底，沒有二次污染，缺點是大部分超累積植物存在生長緩慢、生物量小、重金屬累積量不高，修復時間較長等缺點。植物-微生物聯(lián)合修復法是近幾年來國內(nèi)外研究較多的一種新的修復方法，該方法是利用微生物強化超累積植物修復的效率，徹底去除污染土壤中的重金屬。在土壤-微生物-植物共生環(huán)境中，微生物能夠?qū)⑼寥乐杏袡C質(zhì)和植物根系的分泌物轉(zhuǎn)化為小分子供自身利用，同時，微生物在自身代謝過程中產(chǎn)生的鐵載體、π引哚乙酸(IAA)、草酸等有機酸能夠活化土壤中的重金屬，使重金屬的有效態(tài)增加，而且微生物還有很強的氧化還原能力，可對鐵、錳氧化物進行還原，釋放出重金屬，從而提高超累積植物對重金屬的富集和轉(zhuǎn)運。除此之外，微生物還可合成IAA、鐵載體，ACC脫氨酶以及固氮、解磷和解鉀等作用促進植物生長，增加植物生長量，從而加速重金屬的去除。如Whiting等人將表面消毒的遏蘭菜種子接入滅菌的含重金屬Zn的土壤中，再接入具有Zn抗 性的細菌，結(jié)果接入細菌的植物地上部分累積重金屬Zn的量是不接細菌的植物的2倍，地上部分和根中累積的總的Zn量，接入細菌的為不接入細菌植物累積量的4倍。氮素是作物生長發(fā)育過程中必需的大量元素之一，對作物最終產(chǎn)量的貢獻為40%-50%。高濃度的重金屬可使植物喪失根瘤結(jié)節(jié)能力，從而完全抑制土壤中的共生固氮過程，易造成植物缺氮。如果單純依靠施氮肥，不僅不經(jīng)濟，而且容易造成土壤板結(jié)，氮肥的過量施用會造成地下水亞硝酸鹽的污染和江河湖泊的富營養(yǎng)化。自生固氮菌劑可以固定空氣中的氮氣，將氮氣轉(zhuǎn)變成銨態(tài)氮，與根瘤菌相比使用范圍較廣，生產(chǎn)和使用都較為方便。但是，大部分野生的固氮菌都存在生長緩慢、抗重金屬生長和固氮能力較低的缺點，不能滿足污染土壤修復的需要。為此，采用種種方法來打破菌種的正常代謝，使之產(chǎn)生所需要的目標代謝產(chǎn)物(如蛋白酶)、提高其抗性能力等，要達到此目的，主要措施就是需要進行菌種的選育，如進行物理和化學誘變等。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是通過紫外線-等離子體復合誘變獲得一株可用于土壤重金屬污染環(huán)境治理的具有自生固氮能力和抗重金屬生長能力的土壤桿菌。本發(fā)明的目的之二是提供含有上述土壤桿菌的微生物菌劑及其制備方法； 本發(fā)明的目的之三是提供上述土壤桿菌在土壤重金屬污染環(huán)境治理和土壤生態(tài)修復
中的應用。本發(fā)明實現(xiàn)過程如下
一種具有自生固氮能力的土壤桿菌，其分類命名為土壤桿菌(Agrobacterium sp.)Ymu6-2,已于2011年6月29日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所)，保藏編號為CGMCCNo.5007。Ymu 6-2在固體培養(yǎng)基A上菌落呈乳白色，圓形凸起，邊緣整齊，菌落周圍有透明圈，G_，好氧或兼性厭氧，掃描電鏡顯示呈粗短桿狀，最適的生長溫度28 32°C，最適的pH值為6. 0 8· 0，其固氮能力在O. 56 O. 73nmol · IO7CfiT1 .tT1，解無機磷能力為264. 5mg/l，其產(chǎn)吲哚乙酸(IAA)的能力為15. 25 30. 6μ g/ml，產(chǎn)鐵載體的能力(A/Ar)為O. 806 O. 402 ;所述培養(yǎng)基 A 組成為酵母粉 5-10g, NaCl 2_5g，蛋白胨 5-10g, FeSO4 · 7H20 O. 005-0. Olg，Na2MoO4 · 2H20 0. 0025-0. 005 g，瓊脂粉 15_20g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2。本發(fā)明提供的高效固氮微生物菌株的誘變選育方法，包括以下步驟
O以實驗室從植物根際篩選的土壤桿菌YSGD06作為出發(fā)菌株；
2)誘變選育
(O制備出發(fā)菌株YS⑶06的單細胞懸液
將出發(fā)菌株YS⑶06接種于液體培養(yǎng)基A中，28-32。0，120-150卬111培養(yǎng)12-16hrs,離心，用無菌生理鹽水洗滌，置于裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩，使其分散成單細胞的菌懸液；
所述的培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2_5g，蛋白胨5_10g，F(xiàn)eSO4 · 7H20O. 005-0. Olg, Na2MoO4 · 2H20 0. 0025-0. 005 g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7· 2。(2)紫外線誘變
將步驟(I)所得的菌懸液分別調(diào)節(jié)濃度至IO5-IO7個/ml，取O. Iml分別涂布于含400-800mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，進行紫外誘變，紫外誘變的頻率為10-18W，照射距離為25-50cm，照射時間5-10min ;28_32°C靜置培養(yǎng)5_7days，各挑選20-30個較大的單菌落，進行搖瓶復篩，用乙炔還原法測定各菌株的固氮酶活性，選擇5株固氮酶活性最高的菌株，再分別作搖瓶復篩，選出一株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株YSGD06-Z，制成菌懸液用于下ー步等離子體的誘變；
所述的無氮固體培養(yǎng)基B組分為葡萄糖10-20g，KH2P04 O. 2g,MgSO4 ·7Η20 O.トO. 2g，NaCl O. 2g, CaSO4 · 2H20 0. 2g, CaCO3 5g, CdCl2 0. 080-0. 32g,瓊脂 15_18g，蒸餾水1000ml, p H 7. 0 7. 2 ；
所述的搖瓶發(fā)酵復篩的步驟是首先對上述分離得到的20-30個接種到IOOml上述的液體培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)8-12hrs。各取5ml菌液接種到裝有IOOml液體培養(yǎng)基C的250ml的錐形瓶中，280C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)48h后，將棉塞換成橡膠塞，封ロ膜滴蠟密封，注射器抽取10-15%的空氣，注入10-15%的こ炔氣體，繼續(xù)反應，用こ炔還原法測定固氮酶活性； 所述的液體培養(yǎng)基C所含組分為葡萄糖10-20 g，KH2PO4 O. 2-0. 41 g, K2HPO4O. 3-0. 52 g, CaCl2 O. 1-0. 2 g, MgSO4 · 7H20 O. 1-0. 2 g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 O. 005-0. Olg,Na2MoO4 · 2H20 0. 0025-0. 005 g,蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7· 2。(3)等離子體誘變
將步驟(2)所得的YS⑶06-Ζ菌株，制成IO5-IO7個/ml的菌懸液，取O. 1-0. 2ml分別均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到等離子下面的電極上，調(diào)節(jié)上電極的位置，使得上下電極之間的距離控制在3-8mm左右，調(diào)節(jié)電壓為3-5V，電流為O. 5-0. 8A，使空氣或氬氣放電，得到均勻的空氣或氬氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電時間為2-7min。誘變后立即用無菌生理鹽水或磷酸鹽洗脫，分別涂布于含400-800mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，再進行搖瓶復篩，挑出一株固氮酶活性最高的ー株菌YSGD06-Z2，制成菌懸液用于下一歩的誘變；所述的搖瓶復篩的方法同步驟(2 )。(4)將步驟(3)所得的YS⑶06-Z2菌懸液活菌數(shù)調(diào)至IO5-IO7個/ml，循環(huán)重復紫外線誘變一等離子體誘變1-2次，最后得到一株耐受重金屬Cd且固氮酶活性最高的菌株Ymu6-2o誘變株Ymu 6-2與土壤桿菌具有高度的同源性，菌種鑒定的結(jié)果如下 CCGGGGGCTGCTTACCATGCAGTCGAGCGGAGTGATGGTGCTTGCACTATCACTTAGCGGCGGACGGGTGAG
TAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATTTCGAAAGGAATGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAG
AAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTAC
CAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGG
AGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGGAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGG
TTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTACTGAAGTTAATACCTTCAGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGC
ACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGC
GCGTAGGCGGCTAATTAAGTCAAATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTTAGCTAGA
GTGTGGGAGAGGATGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGC
AGCCATCTGGCCTAACACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATG
CCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGG
GGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTC
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ACCTCCAAAAAAGGGCG
本發(fā)明還提供一種高效固氮菌劑，根據(jù)營養(yǎng)物載體不同可以為液體菌劑或固體菌劑。菌劑的制備包括以下步驟
I)菌種發(fā)酵
①ー級三角瓶液體培養(yǎng)
將凍存的Ymu6-2在37°C條件下快速解凍，按照O. 5-1%的接種量接入裝有液體培養(yǎng)A 的三角瓶中，28-32°C，振蕩培養(yǎng)15-20hrs ；
②ニ級發(fā)酵罐發(fā)酵
將Ymu6-2的一級培養(yǎng)液按照5-10%的接種量接入裝有培養(yǎng)基E的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-32°C，培養(yǎng)pH7-8，通氣培養(yǎng)20-30 hrs ；
所述的培養(yǎng)基E組成為蔗糖10-15g,淀粉2-3g，豆柏20-30g, KH2PO4 O. 2-0. 41 g,K2HPO4 O. 3-0. 52 g, CaCl2 O. 1-0. 2 g, MgS047H20 O. 1-0. 2 g，Na2Mo042H20 O. 0025-0. 005g,水 1000ml, p H 7. 0 7· 2。2)將秸桿粉、草炭土、稻糠用高速粉碎機粉碎，過60目篩，按照質(zhì)量百分比為50-70:20-30:10-20的比例均勻混合，該基質(zhì)中還含有一定濃度的鑰酸鈉和硫酸亞鐵，其中鑰酸鈉為O. 2 O. 5g/Kg，硫酸亞鐵為O. 05 O. 08g/Kg ；
3)將步驟I)中得到的Ymu6-2發(fā)酵液直接打入儲液罐，即得液態(tài)高效固氮菌劑，將得到的發(fā)酵液按照50-100ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28_32°C發(fā)酵5-7days，得到固態(tài)高效固氮菌劑。本發(fā)明提供的菌劑的使用方法，其特征在于，液體菌劑可用于超累積植物浸種、移栽時浸根、育苗期或生長期灌根時按比例加入，在植物浸種時以50-100倍的稀釋液浸泡種子或植物根部2-5hrs，育苗期或生長期灌根采用100-500倍的稀釋液20_40ml/Kg 土壤的劑量澆灌稀釋液，整個生長期灌根1-3次；固態(tài)菌劑可作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-20g/Kg 土壌，土壤中Cd的去除率比對照組增加了 31. 6-92. 5%。本發(fā)明的優(yōu)點與有益效果
1)采用等離子體誘變和紫外誘變多次循環(huán)處理的方法，保證了突變菌株的穩(wěn)定性；
2)提供的自生固氮菌具有高的固氮能力，能夠抗較高濃度的Cd生長，能夠分泌吲哚こ酸、產(chǎn)生鐵原子，具有ACC脫胺酶活性等，傳代14次遺傳性狀穩(wěn)定。能夠促進超累積植物的生長，提高超累積植物的富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)；
3)本發(fā)明的菌劑營養(yǎng)要求簡單、易培養(yǎng)、生長周期短、能夠進行規(guī)?；拇笊a(chǎn)；
4)本發(fā)明的菌劑可以明顯促進超累積植物的生長，増加超累集植物的生物量，極大地提高超累積植物的重金屬富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)，又能改善土壌生態(tài)環(huán)境，環(huán)境友好且成本低廉；
5)為開發(fā)利用植物根際促生菌強化土壌中重金屬的快速去除提供了新途徑，對重金屬污染環(huán)境的治理和生態(tài)修復具有重要的意義。


圖I為Ymu 6-2掃描電鏡照片；圖2為Ymu 6-2產(chǎn)生鐵離子定性實驗照片；
圖3為Ymu 6-2傳代穩(wěn)定性；
圖4為Ymu 6-2在含Cd2+液體培養(yǎng)基A中的生長情況； 圖5為印度芥菜在含Cd 土壤中的生物量(干重)；
圖6為印度芥菜地上部分累積Cd的含量；
圖7為印度芥菜對Cd的去除率；
圖8為紫花苜蓿在含Cd 土壌中的生物量；
圖9為紫花苜蓿地上部分累積Cd的含量；
圖10為紫花苜蓿對Cd的去除率；
圖11為油菜在含Cd 土壤中的生物量；
圖12為油菜地上部分累積Cd的含量；
圖13為油菜對Cd的去除率。
具體實施例方式實施例I
按照本發(fā)明提供的固氮菌株的篩選方法，選育能夠耐受重金屬鎘的固氮酶活性高的固氮菌株，制備的步驟如下
O以實驗室從植物根際篩選并保藏的土壤桿菌YSGD06作為出發(fā)菌株；
2)誘變選育
(I)制備出發(fā)菌株YS⑶06的單細胞懸液
將出發(fā)菌株YS⑶06接種于液體培養(yǎng)基A中，28°C，150rpm培養(yǎng)16hrs，離心，用無菌生理鹽水洗滌，置于裝有玻璃珠的三角瓶內(nèi)，振蕩，使其分散成單細胞的菌懸液；
所述的培養(yǎng)基A組成為酵母粉10g，NaCl 5g，蛋白胨10g，F(xiàn)eSO4 · 7H20 O. 005g,Na2MoO4 · 2H20 0. 0025g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7· 2。(2)紫外線誘變
將步驟(I)所得的菌懸液調(diào)節(jié)濃度至IO5個/ml之間，取O. Iml涂布于含600mg/L Cd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，進行紫外誘變，紫外誘變的頻率為18W，照射距離為25cm，照射時間5min ;28°C靜置培養(yǎng)5days，各挑選25個較大的菌落，進行搖瓶復篩，用こ炔還原法測定各菌株的固氮酶活性，共選擇出5株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株，制成菌懸液用于下ー步等離子體的誘變；
所述的無氮固體培養(yǎng)基B所含組分為葡萄糖20g, KH2PO4 O. 41g，MgSO4 · 7H20 O. 2g,NaCl 0. 2g, CaSO4 · 2H20 0. 2g, CaCO3 5g, CdCl2 0.32g，瓊脂 18g，蒸餾水 1000ml，p H
7.(Γ7. 2 ；
所述的搖瓶發(fā)酵復篩的步驟是首先對上述分離得到的50株自生固氮菌接種到IOOml上述的液體培養(yǎng)基A中，培養(yǎng)12hrs。各取5ml菌液接種到裝有IOOml液體培養(yǎng)基C的250ml的錐形瓶中，28°C，150rpm搖床振蕩培養(yǎng)48hrs后，將棉塞換成橡膠塞，封ロ膜滴蠟密封，注射器抽取10的空氣，注入10的こ炔氣體，繼續(xù)反應，用こ炔還原法測定固氮酶活性；
所述的液體培養(yǎng)基C所含組分為葡萄糖20 g，KH2PO4 0.41 g, K2HPO4 O. 52g, CaCl2
O.2 g, MgSO4 ·7Η20 O. I g ,FeSO4 ·7Η20 O. 005，Na2MoO4 ·2Η20 O. 0025 g,蒸餾水 1000ml，P H 7. 0 7· 2。(3)等離子體誘變
將上述選擇的5株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株，分別制成IO5個/ml的菌懸液，各取O. Iml均勻涂布于無菌培養(yǎng)皿中，將培養(yǎng)皿放到等離子下面的電極上，調(diào)節(jié)上下電極之間的距離為3mm，電壓為3V，電流為O. 5A，利用空氣放電，得到均勻的空氣介質(zhì)阻擋放電等離子體，放電時間為3min。誘變后立即用無菌生理鹽水或磷酸鹽洗脫，涂布于含600mg/LCd2+無氮固體培養(yǎng)基B上，再進行搖瓶復篩，得到2株固氮酶活性高且穩(wěn)定性好的菌株，制成菌懸液用于下一歩的誘變。(4)循環(huán)重復紫外線誘變和等離子體誘變1-2次，最后得到一株耐受重金屬Cd且固氮酶活性高的菌株YMU6-2。
權(quán)利要求
1.一種具有自生固氮能力的土壤桿菌，其分類命名為土壤桿菌sp.)Ymu6-2,已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5007。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的具有自生固氮能力的土壤桿菌，其特征在于該菌株具有以下特性Ymu6-2在固體培養(yǎng)基A上菌落呈乳白色，圓形凸起，邊緣整齊，菌落周圍有透明圈，G_，好氧或兼性厭氧，掃描電鏡顯示呈粗短桿狀，其最適的生長溫度28 32°C，最適的pH值為.6.(T8. 0 ;在固體培養(yǎng)基A上能夠耐受400-800mg/l的Cd2+生長，在液體培養(yǎng)基A中能夠耐受224-448mg/l的Cd2+生長，其固氮能力在0. 56 0. 73nmol IO7CfiT1 tT1，解無機磷能力為264. 5mg/l，產(chǎn)吲哚乙酸的能力為15. 25. 30. 6 y g/ml，產(chǎn)鐵載體的能力為0. 806 0. 402，無ACC脫氨酶活性； 所述的固體培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，F(xiàn)eSO4 7H20.0.005-0. Olg，Na2MoO4 .2H20 0. 0025-0. 005 g，瓊脂粉 15_20g，蒸餾水 1000ml, pH 7. 0 7. 2。
3.含有權(quán)利要求I所述土壤桿菌的微生物菌劑。
4.權(quán)利要求3所述微生物菌劑的制備方法，包括以下步驟 .1)菌種發(fā)酵 ①一級三角瓶液體培養(yǎng) 將凍存的Ymu6-2在37°C條件下快速解凍，按照0. 5-1%的接種量分別接入裝有液體培養(yǎng)A的三角瓶中，28-32°C，振蕩培養(yǎng)15-20hrs ； 培養(yǎng)基A組成為酵母粉5-10g，NaCl 2-5g，蛋白胨5-10g，F(xiàn)eS04 *7H20 0. 005-0. Olg,Na2MoO4 2H20 0. 0025-0. 005 g，蒸餾水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ； ②二級發(fā)酵罐發(fā)酵 .1)將Ymu6-2的一級培養(yǎng)液按照5-10%的接種量分別接入裝有液體培養(yǎng)基E的發(fā)酵罐中，進行發(fā)酵培養(yǎng)，罐溫28-32°C，培養(yǎng)pH7-8，通氣培養(yǎng)20-30 hrs ； 所述的培養(yǎng)基E組成為蔗糖10-15g,淀粉2-3g，豆柏20-30g, KH2PO4 0. 2-0. 41g, K2HPO4 0. 3-0. 52 g, CaCl2 0. 1-0. 2 g, MgSO4*7H20 0. 1-0. 2 g，Na2MoO4.2H20.0.0025-0. 005 g,水 1000ml, p H 7. 0 7. 2 ； .2)將秸桿粉、草炭土、稻糠粉碎過60目篩，按照質(zhì)量百分比為50-70:20-30:10-20的比例均勻混合，再加入鑰酸鈉和硫酸亞鐵，其中鑰酸鈉為0. 2^0. 5g/Kg，硫酸亞鐵為.0.05 0. 08g/Kg ； .3)將步驟I)中得到的Ymu6-2發(fā)酵液直接打入儲液罐，即得液態(tài)高效固氮菌劑，將得到的液態(tài)高效固氮菌劑按照50-100ml/kg的劑量與步驟2)中所得的固態(tài)基質(zhì)混勻，28-32°C發(fā)酵5-7天即可。
5.權(quán)利要求I所述土壤桿菌在土壤重金屬污染環(huán)境治理中的應用。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述應用，其特征在于重金屬為鎘離子。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述應用，其特征在于使用方法為在植物浸種時以50-100倍的液體菌劑稀釋液浸泡種子或植物根部2-5hrs，育苗期或生長期灌根采用100-500倍的液體菌劑稀釋液20-40ml/Kg 土壤劑量澆灌稀釋液，整個生長期灌根1-3次；固態(tài)菌劑作為基肥和追肥使用，使用劑量為5-20g/Kg 土壤。
8.權(quán)利要求I所述土壤桿菌在土壤生態(tài)修復中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種具有自生固氮能力的土壤桿菌，其分類命名為土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)Ymu6-2，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCCNo.5007。本發(fā)明提供的自生固氮菌具有高的固氮能力，能夠抗較高濃度的Cd生長，能夠分泌吲哚乙酸產(chǎn)生鐵原子；制備得到的微生物菌劑可以明顯促進超累積植物的生長，增加超累集植物的生物量，極大地提高超累積植物的重金屬富集系數(shù)和轉(zhuǎn)運系數(shù)，又能改善土壤生態(tài)環(huán)境，環(huán)境友好且成本低廉。
文檔編號A01C1/00GK102747002SQ201110444520
公開日2012年10月24日 申請日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者朱曉麗, 梁麗華, 申燁華, 范代娣, 馬沛 申請人:陜西省能源化工研究院