專利名稱：固氮類芽孢桿菌1-49及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種具有固氮能力的固氮類芽孢桿菌 1-49及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
禾本科作物如小麥、玉米和水稻等是全世界約65億人口主要的食物。隨著化肥工業(yè)的興起，提高農(nóng)作物的產(chǎn)量主要依賴于增加化學(xué)氮肥的施用量。我國是世界上最大的化肥生產(chǎn)國和消費(fèi)國，每年化肥施用量高達(dá)4800萬噸，其中氮肥觀00萬噸，磷肥1200萬噸 (P2O5),而且耕地面積下降的情況下，化肥的年總需求不降反升。然而，只有少于30%施用的化肥能被利用，(Van Kessel et al.，2009)，過量施用氮肥所產(chǎn)生的氮氧化物每公斤對(duì)增溫的影響大約是二氧化碳的298倍，而每年我國生產(chǎn)氮肥耗能達(dá)1億噸標(biāo)準(zhǔn)煤，生產(chǎn)和使用過程中共排放了 5億噸二氧化碳當(dāng)量，扣除氮肥施用作物增產(chǎn)所固定的0. 7億噸二氧化碳， 溫室氣體凈排放量達(dá)4. 3億噸二氧化碳，約占全國總排放量的8%。化肥的過量施用，導(dǎo)致土壤可吸收態(tài)微量元素含量下降，同時(shí)造成土壤中氟和重金屬污染，導(dǎo)致土壤酸化嚴(yán)重，重金屬、硝態(tài)氮在土壤中累積，土壤板結(jié)，肥力下降。大部分氮肥通過滲漏、揮發(fā)及硝化與反硝化等途徑損失，一部分化肥隨雨水進(jìn)入江河湖泊，造成水體的富營養(yǎng)化，我國有80%以上的湖泊受到污染(IV類一劣V類)。按照世界衛(wèi)生組織標(biāo)準(zhǔn)，我國地下水硝酸鹽總體超標(biāo)率為四.91 %。菜地硝酸鹽濃度在IOOppm以上，設(shè)施蔬菜超過200ppm，嚴(yán)重威脅到食品安全與國民健康。而生物固氮不僅可以有效的減少化肥的使用量，提高化肥的利用率，而且還可以改善土壤物理性狀，提高土壤肥力，增加有機(jī)質(zhì)，從而提高農(nóng)作物對(duì)營養(yǎng)的吸收，改善根際微生態(tài)系統(tǒng)，從而降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。根據(jù)固氮微生物與宿主植物之間的結(jié)合關(guān)系，可以將固氮作用分為共生固氮、聯(lián)合固氮和自生固氮(尤崇杓主編，生物固氮，科學(xué)出版社，1987)。共生固氮微生物是與其它共生緊密生活在一起，形成特殊的共生結(jié)構(gòu)進(jìn)行固氮的一類微生物。它們一般生活在根瘤內(nèi)，以宿主植物提供的光合產(chǎn)物為能源進(jìn)行固氮，從而為宿主植物生長(zhǎng)提供氮素營養(yǎng)。共生固氮效率高，固氮量大，是迄今研究的最為清楚的固氮體系；但其宿主范圍及其狹窄，僅限于豆科植物(豆科植物根瘤菌)和某些非豆科樹木(弗氏固氮放線菌)，嚴(yán)重的限制了它的廣泛應(yīng)用。聯(lián)合固氮微生物是指定植于植物的根際或根表，有些可以進(jìn)入根的皮層組織但不形成根瘤，進(jìn)行固氮的微生物。由于聯(lián)合固氮菌與植物根系之間只是一種松散的聯(lián)合， 而沒有分化出有形的結(jié)構(gòu)，而裸露在植物根表，是的聯(lián)合固氮易受環(huán)境因素的影響，加之由聯(lián)合固氮微生物固定的氮素不易分泌到體外，是造成了聯(lián)合固氮微生物固氮效率低下的原因。自生固氮微生物是通常在自然環(huán)境或培養(yǎng)基中獨(dú)立生活時(shí)，就可以將分子態(tài)氮固定為氨的一類微生物。自生固氮微生物不需要和其他生物聯(lián)合就能固氮，具有條件寬、適應(yīng)廣的特點(diǎn)，而且還能分泌一些植物激素，刺激根系和植株的生長(zhǎng)發(fā)育，現(xiàn)有的一些氮肥菌劑中便含有自生固氮菌。同時(shí)，自生固氮菌能夠改善植物根際的微生態(tài)群落，起到促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高植物抗逆性的作用。類芽孢菌具有存活期長(zhǎng)和抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，廣泛分布在不同的土壤和植物根際中，有的也可以侵入植物組織內(nèi)部。該屬中的許多菌株以其固氮能力、對(duì)致病菌的抗性和對(duì)植物的促生作用使得他們受到了研究者的廣泛的關(guān)注。我國幅員遼闊，環(huán)境多樣，土質(zhì)情況差異很大，使得我國的自生固氮資源十分豐富，開發(fā)應(yīng)用潛力巨大。但是，由于國內(nèi)外特別是國內(nèi)對(duì)自生固氮菌的研究起步較晚，大大限制了類芽孢桿菌菌種作為有潛力的微生物菌劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有固氮能力的類芽孢桿菌及其應(yīng)用。本發(fā)明提供的1-49于2011年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No. 4966，分類命名類芽孢桿菌(PaenikiciIlus sp.) ο固氮類芽孢桿菌1-49在LD固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，菌落為圓形，邊緣不規(guī)則，顏色乳白，直徑為2 3mm。本發(fā)明提供了含有固氮類芽孢桿菌1-49的菌劑。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)該菌含有固氮酶，其結(jié)構(gòu)基因?yàn)閚ifH，編碼該基因的核苷酸序列如SEQ ID No. 1。乙炔還原法測(cè)定其固氮酶活性為969. 49nmolC2H4/(mg protein h”1。本發(fā)明提供固氮類芽孢桿菌1-49或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有固氮類芽孢桿菌1-49的菌劑在抑制病原菌上的應(yīng)用。所述的病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷絲核菌(Iihizoctonia cerealis)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)禾口 / 或灰葡萄抱(Botrytis cinerea)。本發(fā)明提供固氮類芽孢桿菌1-49或其發(fā)酵產(chǎn)物或含有固氮類芽孢桿菌1-49的菌劑在促進(jìn)植物生長(zhǎng)上的應(yīng)用。本發(fā)明提供了固氮類芽孢桿菌1-49在制備生態(tài)固氮微生物菌劑或生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。本發(fā)明提供了以固氮類芽孢桿菌1-49為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的固氮類芽孢桿菌菌株1-49對(duì)多種植物病原菌具有明顯的抑制作用，同時(shí)對(duì)植物生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，該菌株分泌植物激素吲哚乙酸的產(chǎn)量為11. 59mmol/mL, 將本發(fā)明的菌株1-49制成固氮微生物菌劑或生物有機(jī)肥可對(duì)植物種子的萌發(fā)生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，能有效降低尿素的使用量，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣使用。


圖1為I^aenibacillus sp. 1-49在無氮平板上的菌落形態(tài)；圖2為菌株P(guān)aenibacillus sp. 1-49相關(guān)的電泳圖，其中M :ladder ;1 :PCR擴(kuò)增得到的固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH條帶；2 =PCR擴(kuò)增得到的16S rDNA條帶；圖3為I^enibacillus sp. 1-49對(duì)植物病原菌的抑制作用圖，其中a圖為Paenibacillus sp. 1-49對(duì)灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的抑制作用圖；b圖為Paenibacillus sp. 1-49 核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)的抑制作用圖；c 圖為 Paenibacillus sp. 1-49對(duì)尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的抑制作用圖；d圖為 Paenibacillus sp. 1-49 對(duì)禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)的抑制作用圖；圖4為I^enibacillus sp. 1-49對(duì)小麥種子的促生作用圖，分別為菌液在稀釋10 倍、20倍、50倍、100倍情況下對(duì)小麥種子的促生作用。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的化學(xué)試劑均為常規(guī)市售試劑，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。本實(shí)施例中所用的土樣，來自各地不同植物根基土壤。實(shí)施例1固氮類芽孢桿菌1-49菌株的培養(yǎng)和鑒定(1)菌株的培養(yǎng)培養(yǎng)基的制作液體培養(yǎng)基(IL):20g 蔗糖；12.06g K2HPO4 ；3. 4gKH2P04 ；0. 2g MgSO4 · 7H20 ；0. Olg NaCl ；0. Olg FeCl3 ；0. 002gNaMo04 · 2H20 ；H2O 1L。120°C滅菌 25 分鐘。 固體培養(yǎng)基的制作是在每升液體培養(yǎng)基中加入14g瓊脂。將固氮類芽孢桿菌接種到固體或液體培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)3天。( 細(xì)菌總DNA的提取提取方法參照文獻(xiàn)Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology. New York :ffiley. 1987的方法。(3)菌株的鑒定及固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH及16S rDNA的擴(kuò)增從本發(fā)明菌株I^enibacillus sp. 1-49的純培養(yǎng)物提取基因組DNA，并以此為模板，以表1中nifH Pl和nifH P2為上下游引物，PCR擴(kuò)增固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH，得到了大小約為320bp的條帶。將此條帶進(jìn)行回收純化后，送交公司進(jìn)行測(cè)序?；騨ifH的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。將測(cè)序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫的在線的BLAST比對(duì)，結(jié)果和 Paenibacillus Nz29 的同源性達(dá)到 94% 0以原核生物的模式菌株大腸桿菌的16S rDNA序列設(shè)計(jì)引物，見表1，以提取的菌株I^aenibacillus sp. 1-49的純培養(yǎng)物基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增16S rDNA序列。結(jié)果得到了為1.5Kb左右的條帶，然后將此條帶進(jìn)行回收純化，并送交測(cè)序。16S rDNA序列如 SEQ ID N0. 2所示，測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線的BLAST比對(duì)，結(jié)果顯示此菌株屬于類芽孢桿菌屬。 該菌株1-49已于2011年6月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCCJia 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，郵編 100101)，保藏號(hào)為CGMCC No. 4966，分類命名為類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)。表1用于克隆nifH及16S rRNA基因的引物
權(quán)利要求
1.固氮類芽孢桿菌(Paenibacillussp.)菌株1-49，其保藏號(hào)為CGMCC No. 4966。
2.含有權(quán)利要求1所述固氮類芽孢桿菌1-49的菌劑。
3.權(quán)利要求1所述的固氮類芽孢桿菌1-49產(chǎn)生具有固氮活性的固氮酶，編碼固氮酶的基因?yàn)閚ifH，編碼該基因的核苷酸序列如SEQID No. 1。
4.權(quán)利要求1所述的固氮類芽孢桿菌1-49或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑在抑制植物病原菌上的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的植物病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、禾谷絲核菌(Rhizoctonia cerealis)、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum) 禾口 / 或灰葡萄孢(Botrytis cinerea)。
6.權(quán)利要求1所述的固氮類芽孢桿菌1-49或其發(fā)酵產(chǎn)物或權(quán)利要求2所述的菌劑在促進(jìn)植物生長(zhǎng)上的應(yīng)用。
7.權(quán)利要求1所述的固氮類芽孢桿菌1-49在制備生態(tài)固氮微生物菌劑或生物有機(jī)肥中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1所述的固氮類芽孢桿菌1-49為有效成分的制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株具有固氮能力的類芽孢桿菌(Paenibacillus sp.)菌株1-49，其保藏編號(hào)為CGMCC No.4966。該菌具有固氮酶結(jié)構(gòu)基因nifH，乙炔還原法測(cè)定其固氮酶活為969.49nmolC2H4/(mg protein h)-1。本發(fā)明提供的固氮類芽孢桿菌菌株1-49對(duì)多種植物病原菌有明顯的抑制作用，將本發(fā)明的菌株1-49制成固氮微生物菌劑或生物有機(jī)肥可對(duì)植物種子的萌發(fā)生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的促進(jìn)作用，可在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中推廣使用，有效降低尿素使用量。
文檔編號(hào)A01P3/00GK102352333SQ201110323840
公開日2012年2月15日 申請(qǐng)日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者王莉瑛, 陳三鳳, 陳曦 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)