一株膠質(zhì)類芽孢桿菌n6及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株膠質(zhì)類芽孢桿菌N6及其應(yīng)用。該菌株的分類命名為膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucilaginosus)N6，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO：M 2015548。本發(fā)明膠質(zhì)類芽孢桿菌N6可以在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基平板培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，并能夠把礦物中的鉀解離出來。在液體振蕩培養(yǎng)條件下，通過火焰分光光度計(jì)析速效鉀增量發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，增量顯著。本發(fā)明的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6接種玉米后，通過盆缽實(shí)驗(yàn)，能夠明顯促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育；同時(shí)在果園中的實(shí)驗(yàn)表明，施用N6發(fā)酵液能夠明顯促進(jìn)蘋果的著色率。因此本發(fā)明為提高玉米生長(zhǎng)和蘋果質(zhì)量提供了優(yōu)良的菌株資源。CCTCC NO：M201554820150916
【專利說明】
一株膠質(zhì)類芽孢桿菌N6及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于微生物肥料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種膠質(zhì)類芽孢桿菌N6及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物生長(zhǎng)需要大量的氮、磷、鉀等化學(xué)元素，其中，鉀素的重要性常常被農(nóng)民所忽 視:幾十年來，我國(guó)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中一直存在著"重施氮肥磷肥，少施或不施鉀肥"的現(xiàn)象。實(shí) 際上，鉀不僅是一些重要糧食作物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的（例如水稻對(duì)鉀肥的需求甚至超過于 氮肥和磷肥）；而且也是一系列經(jīng)濟(jì)作物，例如棉花、茶葉、煙草、西瓜、香蕉等所需要的大量 元素。植物在缺鉀的情況下，產(chǎn)量低下、抗逆性差，且極易發(fā)生倒伏。
[0003] 農(nóng)作物所需要的鉀素，目前仍主要靠化學(xué)鉀肥提供，但是全球鉀礦資源分布極不 均衡，化學(xué)鉀肥生產(chǎn)在地域和生產(chǎn)廠商方面均具有極高的集中度，而我國(guó)鉀礦資源貧乏，鉀 肥制造企業(yè)產(chǎn)能偏小，造成我國(guó)目前70 %的化學(xué)鉀肥依賴于進(jìn)口，鉀肥供應(yīng)嚴(yán)重依賴于國(guó) 際市場(chǎng)，鉀肥國(guó)內(nèi)價(jià)格長(zhǎng)期受制于國(guó)際市場(chǎng)，缺乏議價(jià)能力。所以，由于鉀肥價(jià)格偏高，對(duì)鉀 肥重要性的忽視，加之農(nóng)作物產(chǎn)量水平的不斷提高以及復(fù)種水平的逐步增加的因素的疊加 應(yīng)影響，目前我國(guó)農(nóng)田缺鉀現(xiàn)象日益嚴(yán)重，缺鉀的土壤面積不斷擴(kuò)大，土壤"缺鉀"的狀況已 直接影響到我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)能力的進(jìn)一步提升。
[0004] 實(shí)際上，土壤中的鉀素是非常豐富的，所謂"缺鉀"，缺少的只不過是植物能夠利用 的有效鉀。鉀長(zhǎng)石和云母等硅酸鹽礦物，是組成地球表面巖石和土壤的主要成分（占60%以 上），地殼中鉀含量占2.35 %，在所有元素中占第7位，其中土壤含鉀量占1.16 %，而土壤中 95 %的鉀存在于鉀長(zhǎng)石、云母這兩大礦物中。土壤鉀主要以礦物、固定鉀、代換鉀和水溶鉀4 種形態(tài)存在，其中只有2%的代換鉀和水溶性鉀可被植物吸收利用。
[0005] 土壤中存在著一些能夠分解土壤硅酸鹽類礦物的微生物，可以釋放其中土壤中 鉀、磷、硅等元素，從而為植物生長(zhǎng)提供相應(yīng)營(yíng)養(yǎng)。根據(jù)我國(guó)微生物肥料的農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) (NY882-2004)，可開發(fā)為解鉀細(xì)菌肥料的菌種至少有兩種：膠質(zhì)類芽孢桿菌 (Paenibacillus mucilaginosus)和土壤類芽抱桿菌（Paenibacillus ed aphicus)。膠質(zhì) 類芽孢桿菌是土壤中一類特殊的革蘭氏陰性芽孢桿菌，能分解硅酸鹽和鋁硅酸鹽組成的巖 石礦物，具有溶磷、解鉀及固氮能力，尤其能將土壤中的無效鉀轉(zhuǎn)變?yōu)樗傩р?，供植物吸?利用。因此土壤中分離開發(fā)具有高效解鉀能力的細(xì)菌，大量發(fā)酵之后并將之應(yīng)用土壤，活化 土壤中難溶性鉀，提高農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，并有利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā) 展。
[0006] 玉米屬于禾本科(Poaceae)玉蜀黍族(Maydeae)玉蜀黍?qū)儆衩追N，又稱棒子或者荀 谷。它的原產(chǎn)地是北美洲的墨西哥和南美洲的秘魯。后來哥倫布發(fā)現(xiàn)了美洲新大陸將玉米 引種到了歐洲，一段時(shí)間以后玉米被傳播到了時(shí)間各地并成為了主要的糧食作物之一。玉 米植株比較高大，莖挺直，玉米葉于莖兩側(cè)互生，葉窄而長(zhǎng)邊緣波狀。玉米是雌雄同體植物， 雄花頂生，雌花腋生。雌花成熟后形成谷穗且具有粗大中軸，籽粒呈縱列分布。谷穗外有多 層變態(tài)葉包裹，這些變態(tài)葉叫做包皮。玉米籽?？墒常扼w玉米植株的體細(xì)胞中染色體數(shù) 目為10對(duì)，所以玉米的列數(shù)一般為偶數(shù)列。根據(jù)籽粒質(zhì)地的商業(yè)等級(jí)劃分，玉米籽?？煞?為:硬質(zhì)種、粉質(zhì)種、爆裂種、馬齒種和糯玉米等。籽粒硬淀粉和軟淀粉的干燥度不相等形成 了籽粒的頂部凹陷。硬粒玉米含軟淀粉較少，干燥后籽粒頂端不凹陷;粉質(zhì)玉米含軟淀粉較 多，質(zhì)地粉質(zhì)，容易碾碎;爆裂玉米是硬玉米的極端型，籽粒小而硬，不含軟淀粉，加熱時(shí)細(xì) 胞內(nèi)受熱膨脹，籽粒爆裂。玉米可以用作飼料、食物和工業(yè)原料。
[0007]蘋果樹(Malus domestica)是薔薇科的落葉樹種，而蘋果是薔薇科中非常甜的果 實(shí)。蘋果樹是世界性的栽培果樹，它起源于中亞地區(qū)，在亞洲和歐洲已經(jīng)有了上千年的發(fā)展 歷史。蘋果樹一般的栽培品種，高度可以達(dá)到1.8米一4.6米，一些品種可以達(dá)到12米高。通 過砧木篩選和人工修剪能使蘋果樹形成不同的大小，形狀和樹枝密度。蘋果樹葉子是深綠 色，橢圓形，有鋸齒狀邊緣，葉在樹枝上是簡(jiǎn)單的交替排列。葉柄粗壯長(zhǎng)度約1.5-3厘米且有 短柔毛;托葉質(zhì)地為草質(zhì)，呈披針形，頂端為漸尖形有濃密的短柔毛。蘋果樹花序?yàn)閭惴炕?序，由3-7多花組成且著生于小枝的頂端;苞片質(zhì)地為膜質(zhì)，苞片形狀為線狀披針形，先端漸 尖且有絨毛;蘋果幼苗花直徑3-4厘米，萼筒外面有密集的絨毛;蘋果幼苗花的花瓣呈倒卵 形長(zhǎng)15-18毫米基部具短爪，花瓣白色，未開放時(shí)是粉紅色;蘋果幼苗花期是4-5月，果實(shí)成 熟為7-10月。成熟的蘋果甜美可口，是世界上產(chǎn)量最大的水果之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 發(fā)明目的：針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一株膠質(zhì)類芽孢桿 菌N6,具有具有高效解鉀能力。本發(fā)明的另一目的是提供上述一株膠質(zhì)類芽孢桿菌N6的應(yīng) 用。
[0009] 技術(shù)方案:為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[00?0] -株膠質(zhì)類芽孢桿菌，其分類命名為膠質(zhì)類芽孢桿菌(Paenibacillus mucila ginosus)N6,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC Ν0:Μ 2015548;保藏時(shí)間 2015.09.16，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0011]所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在促進(jìn)玉米生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0012] 所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在提高蘋果質(zhì)量中的應(yīng)用。
[0013] 所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在解鉀中的應(yīng)用。
[0014] 所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物在促進(jìn)玉米生長(zhǎng)中的應(yīng)用。
[0015] 所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物在提高蘋果質(zhì)量中的應(yīng)用。
[0016] 所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物在解鉀中的應(yīng)用。
[0017] 該膠質(zhì)類芽孢桿菌N6從南京菜園土中分離，主要生物學(xué)特征：如圖1所示，菌落均 呈無色、半透明，明顯隆起，邊緣整齊，表面光滑，富有彈性且易拉成絲。菌體革蘭氏染色呈 陰性，桿狀或短桿狀，莢膜肥厚。該菌株在常見的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)。過氧化氫 酶活性測(cè)試呈陽(yáng)性，檸檬酸鹽利用試驗(yàn)測(cè)試呈陰性，葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)測(cè)試呈陽(yáng)性，甲基紅試 驗(yàn)測(cè)試呈陽(yáng)性，淀粉水解試驗(yàn)測(cè)試呈陽(yáng)性，耐鹽性（1 %)測(cè)試呈陰性。
[0018] 該膠質(zhì)類芽孢桿菌N6菌株16S rRNA基因序列，如SEQ ID N0.1所示。采用BLAST (http:/www.ncbi .nlm.nih.gov)將菌株16S rRNA基因序列與GenBank中序列進(jìn)行比對(duì)，并 選擇代表性的模式種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)菌株N6的16S rRNA基因同源性并結(jié)合其系統(tǒng)發(fā) 育樹，以及生理生化特征，可將菌株N6鑒定為膠質(zhì)類芽孢桿菌Paenibacillus mucilagenosus N6〇
[0019] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明膠質(zhì)類芽孢桿菌N6可以在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基 平板培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)，并能夠把礦物中的鉀解離出來。在液體振蕩培養(yǎng)條件下，通過火焰 分光光度計(jì)析速效鉀增量發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，增量顯著。本發(fā)明的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6接種玉 米后，通過盆缽實(shí)驗(yàn)，能夠明顯促進(jìn)玉米的生長(zhǎng)發(fā)育；同時(shí)在果園中的實(shí)驗(yàn)表明，施用N6發(fā) 酵液能夠明顯促進(jìn)蘋果的著色率。因此本發(fā)明為提高玉米生長(zhǎng)和蘋果質(zhì)量提供了優(yōu)良的菌 株資源。
【附圖說明】
[0020] 圖1是膠質(zhì)類芽孢桿菌N6的菌落形態(tài)圖；
[0021]圖2是膠質(zhì)類芽孢桿菌N6液體解鉀能力測(cè)定結(jié)果圖；
[0022]圖3是膠質(zhì)類芽孢桿菌N6莢膜染色結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]根據(jù)下述實(shí)施例，可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例所描述的僅 用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。
[0024]實(shí)施例1:膠質(zhì)類芽孢桿菌N6的培養(yǎng)。
[0025]硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基：蔗糖 5g，Na2HP04 2g，MgS04 · 7H20 0.5g，F(xiàn)eC13 0.005g， 〇&(：03 0.18，土壤礦物*1.(^，瓊脂15~2(^，水10001111，？!170~7.5
[0026] 土壤礦物：去除有機(jī)殘?bào)w之土壤，加6N HC1煮沸半小時(shí)，過濾，用蒸餾水淋洗至無 氯離子反應(yīng)。或者采用鉀長(zhǎng)石粉l.Og。
[0027] 培養(yǎng)基滅菌，待溫度降到60 °C左右，加入煮沸處理過的lg 土壤礦物或者鹽酸洗滌 過的鉀長(zhǎng)石粉，混勻，倒平板。膠質(zhì)類芽孢桿菌N6即可在硅酸鹽固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。
[0028]實(shí)施例2:膠質(zhì)類芽孢桿菌N6液體解鉀能力測(cè)定
[0029]液體解鉀試驗(yàn)培養(yǎng)基：蔗糖 10.0g，Na2HP〇4 2.0g，MgS〇4 · 7H20 0.5g，（NH4)2S〇4 1.0g，NaCl 0.1g，CaC03 l.Og，酵母膏0.5g，鉀長(zhǎng)石粉lO.Og，水 1000mL，pH 7.2。
[0030] 鉀長(zhǎng)石研磨，過100目篩，水洗去水溶性鉀，陰干。250mL三角瓶分裝上述培養(yǎng)基 50mL，加入1.0g土壤礦物（100目），121°C滅菌30min，接入2個(gè)直徑接近lcm的菌落。對(duì)照不接 菌，試驗(yàn)設(shè)5個(gè)重復(fù)。28 °C振蕩培養(yǎng)5d后用火焰光度計(jì)分析速效鉀增量，結(jié)果如圖2所示。
[0031] 從圖2結(jié)果可以看出，加入膠質(zhì)類芽孢桿菌N6的液體培養(yǎng)基中，速效鉀增量比對(duì)照 增加超過80%，效果極顯著(p〈0.01)。該結(jié)果表明膠質(zhì)類芽孢桿菌N6對(duì)土壤礦物和鉀長(zhǎng)石 有較強(qiáng)的解鉀能力。
[0032]實(shí)施例3:膠質(zhì)類芽孢桿菌N6莢膜染色
[0033]材料:膠質(zhì)類芽孢桿菌N6,莢膜染色液，載玻片，純甲醇，黑色碳素墨水，無菌水。 [0034]步驟:在載玻片上滴一滴無菌水，取少許培養(yǎng)了72小時(shí)的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在水 中制成懸液，取一滴配好的黑色碳素墨水與菌懸液混合，另取一片載玻片作為推片，將推片 一端平整的邊緣于懸液以30度角接觸后，順勢(shì)將懸液推向前方，使其成勻薄的一層，風(fēng)干。 用純甲醇固定1分鐘，加番茄紅液滴于涂片上，沖去殘余甲醇，并染色30秒，以細(xì)水流適當(dāng)沖 洗，吸干后油鏡檢查，背景黑色，莢膜無色，細(xì)胞紅色，如圖3所示。
[0035]實(shí)施例4:膠質(zhì)類芽孢桿菌N6溫室盆栽試驗(yàn)。
[0036]將采集來的自然土樣風(fēng)干，過8目篩，裝入試驗(yàn)用塑料缽，每缽裝土500g。將"登海9 號(hào)"玉米種子用10%次氯酸鈉溶液消毒，清洗后于28°c恒溫培養(yǎng)基箱中培養(yǎng)48h，待生根生 芽之后，將玉米幼根進(jìn)行N6菌落的蘸根處理，然后播種。處理和對(duì)照各自均為40缽，每缽播6 粒玉米種子，一周后間苗，每缽留4株。隔天進(jìn)行澆水管理，其他管理?xiàng)l件一致。培養(yǎng)25后調(diào) 查玉米株高、干重。
[0037]膠質(zhì)類芽孢桿菌N6接種25d后對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響見表1。從中可以看出，接種膠質(zhì) 類芽孢桿菌N6發(fā)酵液明顯促進(jìn)了玉米的生長(zhǎng)。玉米根長(zhǎng)、株高與CK相比均有不同程度的增 長(zhǎng)。
[0038]表1接種膠質(zhì)類芽孢桿菌N6對(duì)玉米幼苗生長(zhǎng)的影響
[0040]實(shí)施例5:膠質(zhì)類芽孢桿菌N6促進(jìn)蘋果幼苗生長(zhǎng)
[0041 ] 按以下配方配制培養(yǎng)基（淀粉10g，酵母膏0.4g，K2HP〇4 0.5g，CaC03 lg，MgS〇4 · 7H20 0 · 2g，F(xiàn)eCl3 0 · 005g，蒸餾水1000mL，pH7 ·0-7 · 2)，從固體平板上刮取約培養(yǎng)基2%體積 的N6菌落，無菌操作接入上述培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)3天，在培養(yǎng)液中加入10倍體積生理鹽水 備用。選擇蘋果初花期選擇長(zhǎng)勢(shì)基本一致的富士品種樹進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培 養(yǎng)液2000mL/株、4000mL/株、及對(duì)照共3個(gè)處理，分別進(jìn)行根部施肥，圍繞樹下約20cm，開6 條放射狀溝渠，將培養(yǎng)液或者空白培養(yǎng)基用5kg水稀釋后灌入。采用隨機(jī)小區(qū)實(shí)驗(yàn)方式，每 種處理3株小區(qū)，重復(fù)3次。果實(shí)成熟時(shí)著重考查果實(shí)著色情況、含糖量。果園其它管理措施 均與常規(guī)保持一致。
[0042] 結(jié)果如表2所示，表明施用膠質(zhì)類芽孢桿菌N6之后，果實(shí)含糖量增加大約1.5-2.2%。蘋果著色期比對(duì)照早約7-10天，著色率增加超過一倍，可見，膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng) 液對(duì)蘋果葉片的生長(zhǎng)、果實(shí)的發(fā)育及著色都有明顯的促進(jìn)作用。
[0043] 表2:接種膠質(zhì)類芽孢桿菌N6對(duì)蘋果質(zhì)量的影響
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株膠質(zhì)類芽孢桿菌，其分類命名為膠質(zhì)類芽孢桿菌（Paenibacillus mucilaginosus)N6,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO:M 2015548;保藏 時(shí)間2015.09.16，保藏地址為中國(guó)武漢武漢大學(xué)。2. 權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在促進(jìn)玉米生長(zhǎng)中的應(yīng)用。3. 權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在提高蘋果質(zhì)量中的應(yīng)用。4. 權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6在解鉀中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物在促進(jìn)玉米生長(zhǎng)中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物在提高蘋果質(zhì)量中的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物在解鉀中的應(yīng)用。8. -種制備膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物的方法，其特征在于:配制培養(yǎng)基:淀粉IOg，酵母 膏0.4g，K2HP〇4 0.5g，CaC03 lg，MgS〇4,7H20 0.2g，F(xiàn)eCl3 0.005g，蒸餾水 1000mL，pH7.0-7.2;從固體平板上刮取培養(yǎng)基2 %體積的N6菌落，無菌操作接入上述培養(yǎng)基中，30 °C培養(yǎng)3 天，在培養(yǎng)液中加入10倍體積生理鹽水，獲得膠質(zhì)類芽孢桿菌N6培養(yǎng)物。
【文檔編號(hào)】C12R1/07GK105950505SQ201610341875
【公開日】2016年9月21日
【申請(qǐng)日】2016年5月20日
【發(fā)明人】樊奔, 夏永仙, 楊磊, 陳晟, 李昱龍
【申請(qǐng)人】南京林業(yè)大學(xué)